分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的5種硝基咪唑類藥物殘留

勵 炯,孫 嵐，王紅青，邱紅鈺，康 健

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310017；2.島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司，上海 200052)

分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的5種硝基咪唑類藥物殘留

勵 炯1*,孫 嵐1，王紅青1，邱紅鈺1，康 健2

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310017；2.島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司，上海 200052)

建立了水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)含0.1%氨水乙腈提取，加無水硫酸鈉、C18-N以及NH2-PSA凈化劑后渦旋振蕩對樣品進(jìn)行凈化，以Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 mm×100 mm)色譜柱分離，甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，正離子模式電噴霧電離，配合多反應(yīng)離子掃描(MRM)定性定量分析目標(biāo)化合物?？疾炝颂崛┲邪彼蛢艋瘎┑挠昧繉訕?biāo)回收率的影響，在優(yōu)化實驗條件下，5種硝基咪唑類藥物在20～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2≥0.998 9；3個加標(biāo)水平下的方法回收率為77.2%～94.8%；定量下限為0.7～2.0 μg/kg。該方法快速、簡單、準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類藥物殘留的檢測。

高效液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜；分散固相萃?。幌趸溥?；水產(chǎn)品

硝基咪唑類藥物(Nitromidazoles，NMZs)是一種具有5-硝基取代咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，常見的主要有甲硝唑(Metronidazole，MNZ)、地美硝唑(Dimetridazole，DMZ)、洛美硝唑(Ronidazole，RNZ)等[1]。NMZs具有抗菌和抗原蟲作用，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用于寄生蟲的防治與感染[2-3]。但由于NMZs含有的硝基雜環(huán)類化合物具有細(xì)胞誘變性，并且經(jīng)生物體內(nèi)代謝后形成的羥基甲硝唑(MNZOH，MNZ 的代謝物) 和羥基二甲硝咪唑(HMMNI，DMZ 和RNZ 的共同代謝物)同樣具有原藥類似毒性，其殘留對動物源性食品安全構(gòu)成了直接威脅，許多國家和地區(qū)已禁止該類藥物用于食源性動物，我國也于2002 年禁用了該類藥物[4-6]。

圖1 MNZ、DMZ、RNZ、MNZOH和HMMNI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of MNZ,DMZ,RNZ,MNZOH and HMMNI

目前國內(nèi)外用于硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)[7-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[13-15]等。HPLC 法靈敏度低，易被雜質(zhì)干擾，且無法準(zhǔn)確進(jìn)行定性；GC-MS方法繁瑣，干擾因素多，適用范圍有限；而LC-MS/MS 兼具靈敏度高及抗干擾性強(qiáng)的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于硝基咪唑類藥物多殘留的檢測。

前處理作為關(guān)鍵技術(shù)，直接影響方法靈敏度和精密度。液質(zhì)聯(lián)用前處理方法多以乙酸乙酯提取為主，用小柱凈化，但其成本高、耗時長、步驟繁瑣，操作不當(dāng)易造成損失而影響定量準(zhǔn)確性。本研究建立了分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的方法，采用分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行前處理，省去了濃縮、固相小柱萃取等步驟，具有靈敏、簡便、高效的優(yōu)點，可滿足水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Agilent公司高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6410串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)，MS3旋渦混合器。

甲硝唑(MNZ)對照品(批號：106700，Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.8%)；洛硝噠唑(RNZ)對照品(批號：101507，Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.0%)；地美硝唑(DMZ)對照品(批號：92632，Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.0%)；羥基甲硝唑(MNZOH)對照品(批號：281527，WITEGA公司，含量100%)；羥甲基甲硝咪唑(HMMNI)對照品(批號：272032，WITEGA公司，含量99.5%)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(95%，色譜級，美國Sigma公司)；氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18-N)和NH2-丙基乙二胺吸附劑(NH2-PSA)(島津技邇公司)。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 mm×100 mm)；流動相：A為含0.1%甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～4 min，5%～15%A；4～4.1 min，15%～5%A；4.1～7 min，5%A。柱溫：30 ℃；流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣量2 μL；運(yùn)行時間：7 min。

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測方式(ESI+)；多反應(yīng)檢測(MRM模式)，MRM進(jìn)行分段掃描：0～2.7 min，MNZOH；2.7～4.2 min，HMMNI、MNZ和RNZ；4.2～7 min，DMZ；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；噴霧器壓力：200 kPa；毛細(xì)管電壓：4 kV；校準(zhǔn)方法：質(zhì)量軸自動調(diào)諧校正；其他質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表1。

表1 5種硝基咪唑類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for 5 nitromidazoles

*quantitative ion pair

1.3 樣品制備

提?。簻?zhǔn)確稱取5.0 g魚肉試樣于50 mL聚丙烯離心管中，精密加入10 mL含0.1%(體積分?jǐn)?shù))氨水的乙腈溶液，充分均質(zhì)提取5 min，加入2 g氯化鈉和5 g無水硫酸鈉，旋渦1 min，以5 000 r/min離心5 min，將有機(jī)相全部轉(zhuǎn)入10 mL聚丙烯離心管中，待凈化。

凈化：在待凈化樣液中加入凈化劑(內(nèi)含1 000 mg無水硫酸鈉，200 mg C18-N以及200 mg NH2-PSA)，旋渦1 min混勻，以5 000 r/min離心5 min，精密取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至試管中，40 ℃水浴下氮吹至干，精密加入1 mL 0.1%甲酸水-乙腈(90∶10，體積比)，旋渦混勻1 min溶解殘渣，用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取MNZ、DMZ、RNZ 以及兩種代謝產(chǎn)物MNZOH及HMMNI標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg，分別用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，作為對照品儲備溶液(質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L)。分別精密吸取上述5種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適當(dāng)體積于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。精密吸取適當(dāng)體積的該中間溶液，配成20、50、80、100、200、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取MNZ、DMZ、RNZ、MNZOH及HMMNI質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用于質(zhì)譜條件優(yōu)化。在ESI離子源下，分別用正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種化合物均在ESI+模式下響應(yīng)最好，故本方法采用正離子模式進(jìn)行檢測。

在正離子模式下對5種硝基咪唑類化合物進(jìn)行母離子掃描，掃描范圍為m/z150～250，得到 [M+H]+峰。確定母離子之后，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)牧呀怆妷?，使得各母離子一級掃描時響應(yīng)最高。確定母離子及其裂解電壓，繼續(xù)進(jìn)行子離子掃描，以得到最佳的二級質(zhì)譜條件，經(jīng)儀器自帶的二級質(zhì)譜參數(shù)自動優(yōu)化程序，得到5種化合物的二級質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)(表1)。

圖2 5種硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品的總離子圖和MRM定量離子圖Fig.2 TIC and MRM of five NMZs reference standards

2.2 色譜條件優(yōu)化

本方法對Waters CORTECS-C18(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)、Waters XBridge-C18(3.5 μm，3.0 mm×50 mm)、Merck Chromolith RP-18e(4.6 mm×100 mm)3種色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，普通的C18柱(CORTECS-C18和XBridge-C18)在分離MNZ和RNZ時比較困難，所以采用整體化色譜柱Merck Chromolith RP-18e進(jìn)行分析。整體化色譜柱是利用極高純度且不含金屬的烷氧基硅膠為材料，采用新的液溶膠技術(shù)制備得到的整體化的多孔硅膠棒。這種硅膠棒具有典型的孔結(jié)構(gòu)，即: 大孔結(jié)構(gòu)和中孔結(jié)構(gòu)，其中大孔的孔徑為2 μm，相互交聯(lián)成密集的大孔網(wǎng)絡(luò)，保證流動相可以快速通過，卻不會造成大的反壓。填料骨架上13 nm的中孔保證了填料具有比顆粒型色譜柱更高的比表面積，從而可使該色譜柱在保證高柱效和低反壓的條件下使用高流速，具有較好的色譜柱柱效。結(jié)果如圖2所示，Merck Chromolith RP-18e對5種硝基咪唑類化合物的分離效果良好。

選擇合適的流動相能直接影響目標(biāo)化合物的分離、靈敏度等[16]。由于乙腈的極性高于甲醇，采用水相-乙腈體系作為流動相時，5種硝基咪唑類化合物的分離效果較差，分離度均未達(dá)到1.5，所以本研究采用極性相對較弱的甲醇作為有機(jī)相。在水相中加入一定比例的甲酸能促進(jìn)離子化，因此本研究考察了不同含量的甲酸水溶液(0.1%、0.15%、0.2%)對5種目標(biāo)化合物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸含量為0.1%時，5種目標(biāo)化合物的分離效果最佳，且離子化程度較好，而當(dāng)采用另外兩個較高含量的甲酸水溶液時，MNZ和RNZ的分離度變差(<1.5)。因此本研究選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇為最佳的流動相。

2.3 提取及凈化方式的優(yōu)化

水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物的提取溶劑一般采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈以及一些混合溶劑，而分散固相萃取法提取獸藥殘留常采用的提取溶劑為含0.1%甲酸的乙腈溶液，所以本方法采用乙腈作為提取劑[17-18]。硝基咪唑類藥物具有酸堿兩性化學(xué)性質(zhì)，在弱酸性條件下呈質(zhì)子化狀態(tài)，在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài)，酸堿條件對MNZOH和HMMNI兩種代謝產(chǎn)物的提取率影響較大，采用含0.1%甲酸的乙腈溶液作為硝基咪唑類藥物的提取劑時，MNZOH和HMMNI的回收率均低于30%，其余3種硝基咪唑類藥物的回收率為50%～60%，所以本文考慮在乙腈提取液中加入少量堿性物質(zhì)來提高提取率。分別采用含0.05%、0.1%、0.15%氨水的乙腈溶液作為提取溶劑，結(jié)果顯示，采用含0.1%氨水的乙腈時提取效率最高，5種硝基咪唑類藥物的回收率均達(dá)到75%以上，并且氨水類揮發(fā)性堿性成分不會污染質(zhì)譜離子源，符合實驗要求。

表2 無水硫酸鈉、C18-N及NH2-PSA用量配比的正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal test factors and levels of the dosages of Na2SO4,C18-N and NH2-PSA

分散固相萃取常用的凈化吸附劑為無水硫酸鈉、C18-N、NH2-PSA，其中無水硫酸鈉(一般用量為500～1 500 mg)主要用于除去樣液中的水分，以保證其他吸附劑的吸附能力，C18-N(一般用量為100～300 mg)用于除去脂肪類雜質(zhì)，NH2-PSA(一般用量為100～300 mg)主要吸附色素、金屬離子、有機(jī)酸等。本研究通過對3種吸附劑的用量配比進(jìn)行正交試驗優(yōu)化(無水硫酸鈉、C18-N以及NH2-PSA用量分別作為因素A、B、C)，每個因素取3個水平，按照L9(33)正交表試驗，比較50 μg/L加標(biāo)水平下各因素組合的回收率和凈化效果，來選擇最佳配比組合。正交試驗因素見表2。正交試驗結(jié)果表明，使用1 000 mg無水硫酸鈉、200 mg C18-N以及200 mg NH2-PSA組成的凈化劑可以獲得良好的凈化效果。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)會對方法靈敏度、精密度以及準(zhǔn)確度造成影響[18]。MNZ、DMZ和RNZ在水產(chǎn)品中的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，但MNZOH和HMMNI存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，本研究通過優(yōu)化色譜分離條件較好地消除了基質(zhì)效應(yīng)，并采用相應(yīng)基質(zhì)配制標(biāo)樣進(jìn)行校準(zhǔn)，有效保證了定性、定量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

2.5 線性關(guān)系與定量下限

取“1.4”配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別進(jìn)樣1 μL，以定量監(jiān)測離子對離子流中譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表3。5種硝基咪唑類藥物線性關(guān)系較好，r2≥0.998 9。

取空白樣品5 g，加入適當(dāng)稀釋的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按本方法制備供試品溶液分別進(jìn)樣測定，得5種硝基咪唑類藥物的檢出限(LOD，S/N=3)與定量下限(LOQ,S/N=10)分別為0.2～0.7 μg/kg和0.7～2.0 μg/kg，結(jié)果見表3。

表3 5種硝基咪唑類藥物的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 3 Linear regression results，LODs and LOQs of five NMZs

2.6 方法回收率與精密度

取空白樣品，每份5 g，分別加入適量的混合對照品溶液，使供試品溶液最終加標(biāo)水平分別為10、20、50 μg/kg，平行6份，按樣品制備方法制備供試品溶液，檢測含量并計算回收率，結(jié)果見表4。5種硝基咪唑類藥物的平均回收率為77.2%～94.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～7.8%。

表4 平均回收率與精密度(n=6)Table 4 Average recoveries and precision(n=6)

2.7 實際樣品檢測

利用本研究建立的方法對杭州市市售的50批次水產(chǎn)品中5種硝基咪唑類藥物進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50批次水產(chǎn)品中均未檢出5種硝基咪唑類藥物殘留。

3 結(jié) 論

本研究建立了分散固相萃取凈化/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物殘留的分析方法，同時優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件以及提取和凈化條件。該方法無需復(fù)雜的樣品前處理，經(jīng)含0.1%氨水的乙腈溶液提取，使用1 000 mg無水硫酸鈉、200 mg C18-N以及200 mg NH2-PSA組成的凈化劑進(jìn)行凈化吸附，即可有效降低基質(zhì)效應(yīng)，提高分析方法的選擇性和靈敏度。

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Determination of Five Nitromidazoles in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Combined with Dispersive Solid Phase Extraction

LI Jiong1*,SUN Lan1,WANG Hong-qing1，QIU Hong-yu1，KANG Jian2

(1.Hangzhou Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310017，China；2.Shimadzu-GL Sciences(Shanghai)Laboratory Supplies Co.，Ltd.,Shanghai 200052，China)

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(HPLC-MS/MS) method was developed for the determination of five nitromidazoles in aquatic products.Samples were extracted with acetonitrile containing 0.1%(by volume) ammonium hydroxide,and then purified with a mixture of anhydrous sodium sulfate,C18-N and NH2-PSA.The analysis was performed by an HPLC-MS/MS system with Merck Chromolith Performance RP-18e(4.6 mm×100 mm) column.The mobile phase consisted of methanol and 0.1%(by volume) formic acid solution by gradient elution,and multiple reaction monitoring(MRM) mode with positive electrospray ionization was used.The effects of the dosages of ammonium hydroxide in extractant and anhydrous sodium sulfate,C18-N and NH2-PSA in cleaning-up agent were studied.Under the optimized analytical conditions,the calibration curves for five nitromidazoles were linear in the concentration range of 20-500 μg/L with their correlation coefficients(r2) not less than 0.998 9.The recoveries at three concentrations ranged from 77.2%to 94.8%with the LOQs of 0.7-2.0 μg/kg.The method is suitable for the determination of 5 nitromidazoles in aquatic products.

high performance liquid chromatography；tandem mass spectrometry；dispersive solid phase extraction；nitromidazole；aquatic product

2017-06-29；

2017-08-16

*

勵 炯，碩士，副主任技師，研究方向：藥品、食品、保健品檢驗，Tel:0571-85463893,E-mail：jokelee2@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.011

O657.63；O657.7

A

1004-4957(2017)11-1357-06