化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

李靜雯，劉清珺，杜美紅*，趙瑞雪，萬宇平，吳小勝，馮月君

(1.北京市理化分析測(cè)試中心 北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，北京 100089；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

李靜雯1，劉清珺1，杜美紅1*，趙瑞雪1，萬宇平2，吳小勝2，馮月君2

(1.北京市理化分析測(cè)試中心 北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，北京 100089；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)憑借其化學(xué)發(fā)光的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高特異性在微生物快速檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。該文著重?cái)⑹隽嘶瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)核心檢測(cè)體系在微生物檢測(cè)中的研究進(jìn)展，并對(duì)其涉及到的樣品前處理和檢測(cè)新方法進(jìn)行了綜述?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)微生物用時(shí)短、成本低，但特異性識(shí)別方法和檢測(cè)的靈敏度有待提升，新型的發(fā)光體系、發(fā)光放大方法、可替代抗體的識(shí)別分子以及相關(guān)的前處理技術(shù)是未來研究的重點(diǎn)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)；微生物檢測(cè)；前處理；發(fā)光放大；識(shí)別分子

微生物檢測(cè)是食品安全、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)控、生物分析等領(lǐng)域的常見和必檢項(xiàng)目，全球的微生物檢測(cè)市場(chǎng)每年約有10億檢測(cè)量[1]。致病微生物的快速準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)并合理控制污染和防止疾病的進(jìn)一步傳播至關(guān)重要。因此，研發(fā)靈敏、快捷、成本低的微生物檢測(cè)新技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。

目前微生物檢測(cè)采用國(guó)標(biāo)方法，即平板培養(yǎng)法。該方法需經(jīng)過前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等步驟，雖然結(jié)果較為準(zhǔn)確，成本較低，但檢測(cè)過程繁瑣，一般需4～6 d的時(shí)間，不適用于致病微生物的快速篩查與污染控制。近年來，分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，使得微生物的快速檢測(cè)方法不斷創(chuàng)新。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)[2]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)[3- 4]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[5-6]生物芯片[7-9]，以及免疫分析技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)[10-11]、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)[12-13]、側(cè)流免疫層析技術(shù)(Lateral flow immunoassay，LFI)[14-15]、電化學(xué)免疫分析技術(shù)(Electrochemical immunosensor，ECIS)[16]等均被應(yīng)用于食品、環(huán)境樣品的微生物快速檢測(cè)，檢出限達(dá)到100～104CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間為0.5～5 h(表1)。這些快速檢測(cè)技術(shù)在縮短微生物檢測(cè)時(shí)間和降低檢出限等方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。分子生物學(xué)技術(shù)以檢測(cè)微生物的核酸(DNA和RNA)為特點(diǎn)，其靈敏度高、特異性好，但較難區(qū)別死、活菌，對(duì)檢測(cè)體系、檢測(cè)環(huán)境要求嚴(yán)格，檢測(cè)人員需要有較高的專業(yè)背景，而且檢測(cè)儀器昂貴，限制了其在基層部門微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以抗體特異性識(shí)別微生物細(xì)胞表面的抗原決定簇，成本低廉、特異性好，但是其檢測(cè)用抗體較難制備和保存，目前并不能對(duì)所有目標(biāo)菌進(jìn)行檢測(cè)，涉及的關(guān)鍵問題還需深入研究?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是近年來免疫分析技術(shù)中的研究熱點(diǎn)，該技術(shù)已成為真菌毒素、藥物、激素、腫瘤標(biāo)志物等物質(zhì)的重要檢測(cè)方法，并開發(fā)出多種檢測(cè)試劑盒[17]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)以其檢測(cè)用時(shí)短、靈敏度高、設(shè)備兼容性強(qiáng)的特點(diǎn)在微生物檢測(cè)中嶄露頭角，本文針對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在食品、環(huán)境等領(lǐng)域中微生物檢測(cè)的研究進(jìn)展及應(yīng)用進(jìn)行闡述。

表1 常見的微生物快速檢測(cè)技術(shù)Table 1 Common rapid detection techniques of microbes

1 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)微生物的原理

1.1 檢測(cè)原理

1977年Halmann等[18]首先建立化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，以參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑(發(fā)光劑或催化劑)標(biāo)記抗體，標(biāo)記后的抗體與待測(cè)物經(jīng)過抗原抗體反應(yīng)和分離步驟，以化學(xué)發(fā)光的形式來定量反映待測(cè)物的含量。因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)速率相關(guān)，而反應(yīng)速率由標(biāo)記物的含量決定，所以化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度可以作為定量依據(jù)[17]。相對(duì)于酶聯(lián)免疫以顏色深淺定量、放射免疫以放射強(qiáng)度定量，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)具有靈敏度高、可檢測(cè)范圍大、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定和不易被干擾等突出優(yōu)勢(shì)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析包括免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性，化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)決定了檢測(cè)的靈敏度。

1.2 免疫分析方法

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是一種利用抗原和抗體的特異性結(jié)合來選擇性識(shí)別和測(cè)定待測(cè)物的免疫分析方法，一般分為競(jìng)爭(zhēng)法和雙抗夾心法。夾心法常用于大分子抗原的定量分析，微生物檢測(cè)多采用此法[19]：用免疫磁珠或包被了抗體的微孔板捕獲目標(biāo)菌，加入標(biāo)記抗體，形成夾心復(fù)合物；將游離標(biāo)記抗體分離，再加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，目標(biāo)菌濃度與發(fā)光強(qiáng)度成正比(圖1)。競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)微生物，將微生物的抗原決定簇包被在固相載體上，與目標(biāo)菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記抗體，然后測(cè)定固相載體上標(biāo)記物的含量，發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)菌濃度成反比(圖2)。由于夾心法涉及兩種抗體，檢測(cè)的特異性優(yōu)于競(jìng)爭(zhēng)法，測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。Gehring等[20]以特異性識(shí)別大腸桿菌O157∶H7的O抗原和H抗原的兩種抗體作為夾心雙抗，避免了其他大腸桿菌種屬的干擾，降低了檢測(cè)的假陽性率。Li等[21]通過電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)采用競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)夾心法的檢出限較低(1.2×102CFU/mL)且線性范圍更寬。

圖1 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)微生物的雙抗夾心法原理[12]Fig.1 Principle of sandwich immunoassay format in microbiological detection by chemiluminescence immunoassay

1.3 化學(xué)發(fā)光體系

以標(biāo)記物區(qū)分，化學(xué)發(fā)光體系一般分為3類：酶促化學(xué)發(fā)光、非酶促化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光。酶促化學(xué)發(fā)光體系以催化劑為標(biāo)記物，靈敏度和穩(wěn)定性均優(yōu)于以發(fā)光劑為標(biāo)記物，所以微生物檢測(cè)一般采用酶促化學(xué)發(fā)光體系。標(biāo)記物多采用辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)[13,19-20,22-25]和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)[12,26]。Liu等[22]以HRP為標(biāo)記物，催化魯米諾與H2O2進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為425 nm，用雙抗夾心法對(duì)牛肉中的大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為5.5×102CFU/mL，線性范圍為102～105CFU/mL。Gehring等[26]以ALP為標(biāo)記物，二氧化吖啶二鈉鹽(APS-5)為發(fā)光底物，同樣利用雙抗夾心法對(duì)牛肉中的大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為7.6×103CFU/mL。APS-5的穩(wěn)定性較差，顯色溫度需低于20 ℃，保存溫度需低于-20 ℃，限制了其廣泛使用。目前，常用的ALP催化的化學(xué)發(fā)光底物為二氧雜環(huán)乙烷類物質(zhì)，其中二氧環(huán)乙烷二鈉鹽(AMPPD)的應(yīng)用最為成功[12]，其在ALP催化下發(fā)生分解反應(yīng)，脫去磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生477 nm的持續(xù)穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光。AMPPD性質(zhì)十分穩(wěn)定，在無酶催化下水解速率非常慢，極具應(yīng)用潛力。以酶為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光是化學(xué)發(fā)光免疫分析的主流，所占比例約為80%[17]。非酶促發(fā)光體系一般以化學(xué)發(fā)光試劑為標(biāo)記物，如魯米諾、異魯米諾、吖啶酯，在過渡金屬離子、過氧化物酶等催化劑的作用下與H2O2反應(yīng)，目前關(guān)于微生物檢測(cè)的報(bào)道較少。電化學(xué)發(fā)光是一類特殊的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系，一般以聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+為標(biāo)記物，電極將其氧化為[Ru(bpy)3]3+，然后被電子載體N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)還原，并釋放1個(gè)光子回到基態(tài)，在620 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。[Ru(bpy)3]2+在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程中不消耗，兼具準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，便于開發(fā)全自動(dòng)分析儀器，是近年來化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一[20,27-28]。Morel等[29]利用該方法檢測(cè)炭疽桿菌，檢出限為3×102CFU/mL，比酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)表現(xiàn)出更高的靈敏度。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 樣品前處理策略

食品、環(huán)境和醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)的主要挑戰(zhàn)是樣品中痕量目標(biāo)菌(<10 CFU/g)的檢測(cè)，和樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。前處理過程能有效地從樣品顆粒、干擾物和抑制劑中分離、濃縮目標(biāo)菌，有助于提高低水平或散發(fā)性污染樣品的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，避免微生物分布不均勻?qū)е碌臋z測(cè)結(jié)果代表性差的問題。此外，目標(biāo)菌濃縮可以減少或消除對(duì)增菌步驟的需要。因此，前處理方法在微生物檢測(cè)中有舉足輕重的作用。目前，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)常用的前處理方法有過濾、離心、免疫磁分離等(表2)。Wunderlich等[30]使用吸附過濾結(jié)合離心超濾的前處理方法，先將10 L樣品水通過單層過濾膜，并用20 mL洗脫液將吸附物完全洗脫下來，再離心濃縮至1 mL，整個(gè)前處理過程將水中微生物的密度提高10 000倍，省去了增菌步驟，嗜肺軍團(tuán)菌的回收率達(dá)到99.8%。再利用微陣列化學(xué)發(fā)光芯片可檢出0.39 CFU/mL的目標(biāo)菌，檢測(cè)全過程僅需90 min。過濾和離心等物理前處理方法可有效濃縮微生物，但無法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌的特異性分離，較適合液態(tài)、無較多顆粒干擾的檢測(cè)樣品。微生物過濾后需洗脫，面臨濃度降低和回收不完全的問題。

表2 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)結(jié)合前處理技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用Table 2 Application of chemiluminescence immunoassay combined with pretreatment in microbiological detection

1979年免疫磁珠問世，磁性微粒表面偶聯(lián)著抗體等識(shí)別分子，可與目標(biāo)菌特異性結(jié)合，通過外加磁場(chǎng)定向移動(dòng)并聚集，達(dá)到特異性分離和濃縮的目的[31]。免疫磁珠分離能夠快速無損分離目標(biāo)菌，不但排除了樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，還降低了其他種屬微生物對(duì)目標(biāo)菌檢測(cè)的干擾，因此越來越多地應(yīng)用于微生物檢測(cè)的前處理。高明遠(yuǎn)課題組[32]以國(guó)產(chǎn)亞微米級(jí)的單分散磁性微球?yàn)榛A(chǔ)，制備出捕獲效率95%以上的免疫磁珠，用于沙門氏菌的富集分離。Du等[33-34]證實(shí)該納米級(jí)免疫磁珠的捕獲性能優(yōu)于微米級(jí)免疫磁珠，利用該免疫磁珠對(duì)雞肉和牛奶樣品中100 CFU/mL的沙門氏菌免疫磁分離后進(jìn)行了4 h增菌培養(yǎng)，即達(dá)到103CFU/mL以上，滿足化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢出限的需求。Yang等[12]利用萬古霉素標(biāo)記的磁珠捕獲樣品中的目標(biāo)菌，菌密度增加20倍，與標(biāo)記ALP的金黃色葡萄球菌抗體形成夾心，ALP催化AMPPD進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌，檢出限達(dá)3.3 CFU/mL。

將免疫色譜、毛細(xì)管電泳等新興的分離技術(shù)，與靈敏的化學(xué)發(fā)光結(jié)合，具有反應(yīng)快，無需長(zhǎng)時(shí)間溫浴，可以同時(shí)進(jìn)行多組分檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。Yacoub-George等[35]采用集成的毛細(xì)管芯片免疫反應(yīng)器將含有菌毒素、病毒和細(xì)菌的樣品組分分離并同時(shí)檢測(cè)，分離檢測(cè)全過程僅需24 min，可檢測(cè)出105CFU/mL以上的大腸桿菌O157∶H7。

2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)中的特異性識(shí)別策略

免疫分析技術(shù)建立在免疫識(shí)別基礎(chǔ)上，識(shí)別分子保證了檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)微生物的識(shí)別分子一般為抗體。多克隆抗體價(jià)格相對(duì)低廉，但需通過免疫動(dòng)物獲得，雖然經(jīng)過分離純化，但不可避免地與非目標(biāo)菌存在交叉反應(yīng)。單克隆抗體的特異性好，但雜交瘤技術(shù)非常昂貴且耗時(shí)[38]。此外，抗體活性易受環(huán)境、反應(yīng)條件等多種因素的影響，制約了免疫分析技術(shù)的推廣普及。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試使用新型識(shí)別分子代替抗體，適配體[39]、抗生素[12]、抗菌肽[21]、噬菌體[40]和分子印跡聚合物[41]等均在微生物特異性識(shí)別中得到應(yīng)用(表3)。Kwun等[39]利用適配體作為識(shí)別分子偶聯(lián)1,1′-草酰二咪唑，競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)副溶血弧菌，目標(biāo)菌與氧化石墨烯競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體，檢出限為2.23×103CFU/mL。Li等[21]利用抗菌肽Magainin Ⅰ作為識(shí)別分子，通過電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7，進(jìn)一步降低了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的本底值。Yue等[40]利用噬菌體作為識(shí)別分子，通過電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)能檢測(cè)出56 CFU/mL以上的銅綠假單胞菌。這些新型識(shí)別分子制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單，制備成本低，在高溫下穩(wěn)定性好，有更寬的pH值耐受范圍，而且應(yīng)用靈活性強(qiáng)，容易標(biāo)記各種酶分子或官能團(tuán)。其中，對(duì)于微生物細(xì)胞這種大抗原，噬菌體和適配體是目前最有希望替代抗體的識(shí)別分子，但還需利用多種手段優(yōu)化篩選方法以進(jìn)一步提高識(shí)別分子與目標(biāo)菌的親和性。抗生素和抗菌肽簡(jiǎn)單易得，但特異性普遍較弱，一般用于初步捕獲，檢測(cè)需抗體配合。分子印跡聚合物較適合用于小抗原的識(shí)別，其制備常用本體聚合法，制備完成后存在模板分子難以去除導(dǎo)致實(shí)際產(chǎn)率低的問題[38]。

表3 新型識(shí)別分子特異性識(shí)別目標(biāo)菌的作用機(jī)理Table 3 Mechanism of new recognition elements specific recognizing the target bacteria

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)中的發(fā)光放大策略

靈敏度是微生物快速檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵指標(biāo)。特別在低水平污染的樣品中，靈敏度是決定微生物檢測(cè)時(shí)間和準(zhǔn)確性的重要因素。因此，提高化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的靈敏度具有重要的研究?jī)r(jià)值。將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光放大是提高靈敏度的主要手段。利用微粒比表面積大的特點(diǎn)，在其表面結(jié)合大量的催化劑、發(fā)光劑等，使得與待檢物結(jié)合的標(biāo)記物大大增加，靈敏度大幅提高，檢出限降低。Mun等[42]將HRP標(biāo)記到免疫磁珠上用來捕獲沙門氏菌，利用100 nm免疫磁珠比沙門氏菌體積小很多的特點(diǎn)，用0.22 μm的過濾膜將免疫磁珠-沙門氏菌復(fù)合體與游離的免疫磁珠分離。由于免疫磁珠上可標(biāo)記大量的HRP，所以檢出限顯著降低，10 CFU沙門氏菌即可檢出。Wang等[43]通過納米金顆粒輔助銀形成樹枝狀分布的Ag+，利用Ag+對(duì)K2S2O8-Mn2+-魯米諾反應(yīng)體系顯著的催化作用，使得靈敏度提高2個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了100 CFU/mL沙門氏菌不需經(jīng)過增菌步驟的直接化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)。

開發(fā)新的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系以提高檢測(cè)靈敏度是化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。Zhang等[36]以葡萄糖氧化酶作為標(biāo)記物，催化葡萄糖和O2產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2，并利用漆酶在堿性環(huán)境下催化魯米諾與H2O2的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)起到二次放大的作用，增加了化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，檢出限為1.2×103CFU/mL。

2.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)中固相材料的應(yīng)用

固相材料用于固定抗體、酶、發(fā)光劑等物質(zhì)，影響微生物檢測(cè)的靈敏性和穩(wěn)定性。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)中使用的固相材料有微孔板、磁性微粒和多孔材料等[17](表4)。Magliulo等[23]利用聚苯乙烯微孔板為固相材料，并在1個(gè)主孔中設(shè)置4個(gè)子孔分別包被大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌、單核增生李斯特菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的單克隆抗體，利用HRP標(biāo)記的多克隆抗體同時(shí)檢測(cè)這4種致病菌，檢出限為104CFU/mL。該方法使用極少量的抗體，實(shí)現(xiàn)了快速、高通量、低成本的微生物檢測(cè)。

表4 固相材料在化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測(cè)微生物中的應(yīng)用Table 4 Application of solid materials in microbiological detection by chemiluminescence immunoassay

微粒形態(tài)的固相材料包被上抗原，模擬制成目標(biāo)菌標(biāo)準(zhǔn)品，即可采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)微生物。Xiong等[13]將包被了葡萄球菌蛋白A的磁珠作為目標(biāo)菌類似物，與金黃色葡萄球菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HRP標(biāo)記的抗體，檢出限達(dá)6 CFU/mL。此方法有較高的靈敏度和較寬的線性范圍，且抗原抗體一步孵育即可得出檢測(cè)結(jié)果，全部檢測(cè)過程僅需50 min，顯示出良好的應(yīng)用前景。

固相材料還可用于合成人工模擬酶，比天然酶更易制備且性質(zhì)穩(wěn)定。Yang等[44]將脫氧核酶序列與適配體序列組成一個(gè)單鏈DNA探針，將探針包裹到單碳納米管上。其中適配體序列能特異性地與目標(biāo)菌結(jié)合，導(dǎo)致脫氧核酶序列遠(yuǎn)離單碳納米管與高鐵血紅素結(jié)合，形成HRP的模擬酶。該模擬酶能夠催化魯米諾-H2O2體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，可檢測(cè)出103CFU/mL的沙門氏菌。

3 總結(jié)與展望

微生物檢測(cè)技術(shù)，必須具備較高的靈敏度、顯著的特異性、獲得結(jié)果的快速性和檢測(cè)成本的低廉性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法的靈敏性和檢測(cè)范圍遠(yuǎn)高于酶聯(lián)免疫等其他免疫分析技術(shù)，兼具操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，在微生物檢測(cè)方面發(fā)展迅速。靈敏度是微生物快速檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵問題，化學(xué)發(fā)光體系中最成熟的是HRP-魯米諾-H2O2和ALP-ADPPM體系，目前靈敏度達(dá)到102～103CFU/mL。配合免疫磁分離、超濾等前處理方法，檢出限可降為10-1～100CFU/mL。新型的化學(xué)發(fā)光體系、納米顆粒和固相材料的應(yīng)用能進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)，降低本底噪音，提高檢測(cè)的靈敏度。

免疫識(shí)別決定了化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)微生物的特異性和穩(wěn)定性。由于抗體難制備與不易保存的缺點(diǎn)，噬菌體、適配體等新型可替代抗體的識(shí)別分子的研發(fā)是今后化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，對(duì)該技術(shù)的推廣普及具有重要意義。微生物容易發(fā)生變異，一定程度上限制了免疫分析方法的穩(wěn)定性，但這也是目前快速檢測(cè)方法普遍面臨的問題。必要時(shí)可結(jié)合生化鑒定、全基因組測(cè)序和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等其他技術(shù)深入解析變異微生物，并進(jìn)行鑒定和溯源。

食品行業(yè)的微生物監(jiān)控，要求對(duì)樣品進(jìn)行活菌檢測(cè)，但食品中活致病菌數(shù)量一般較少，直接進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)難以達(dá)到目的。通過對(duì)樣品進(jìn)行短暫增菌，使少量的活菌得到增殖，避免了檢測(cè)結(jié)果的假陰性；同時(shí)區(qū)分了死、活菌，避免了假陽性結(jié)果。因此針對(duì)不同性質(zhì)的待測(cè)樣品開發(fā)成套的、結(jié)合前處理和增菌方案的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法非常必要，可為該技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的推廣普及奠定基礎(chǔ)。

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Application of Chemiluminescence Immunoassay in Microbiological Detection

LI Jing-wen1，LIU Qing-jun1，DU Mei-hong1*，ZHAO Rui-xue1，WAN Yu-ping2，WU Xiao-sheng2，F(xiàn)ENG Yue-jun2

(1.Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis,Beijing Center for Physical and Chemical Analysis,Beijing 100089,China；2.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immune Rapid Detection,Beijing Kwinbon Biotechnology Co.,Ltd.，Beijing 102206,China)

Chemiluminescence immunoassay is widely used in the rapid detection of microbes because of its high sensitivity of chemiluminescence and high specificity of immune response.In the paper,the advance of the coresystems of chemiluminescence immunoassay in microbiological detection is emphatically illustrated.The related sample pretreatments and the new detection methods are reviewed.Although Chemiluminescence immunoassay in the microbiological detection has the advantages of rapidness and low consumption,its specific recognition and sensitivity could be further improved.The innovative luminescence systems,the luminescence amplification methods,the alternative recognition elements and the related pretreatment techniques are the focuses in future research.

chemiluminescence immunoassay；microbiological detection；pretreatment；luminescence amplification；recognition element

2017-05-12；

2017-07-09

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2013YQ140371)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助(2016YFF0203802)；北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Z161100000916001)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2162018)

*

杜美紅，博士，副研究員，研究方向：食品安全微生物快速檢測(cè)，Tel:010-58717271，E-mail:dumeihong@beijinglab.com.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.020

O657；O734

A

1004-4957(2017)11-1409-08