氧化苦參堿抑制DBTC刺激的胰腺腺泡細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及TβRⅡ和p-Smad2/3表達

張 斌，許 威，李如月，張 青，向曉輝，夏時海

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽胰脾中心，天津 300162)

臨床醫(yī)學(xué)研究

氧化苦參堿抑制DBTC刺激的胰腺腺泡細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及TβRⅡ和p-Smad2/3表達

張 斌，許 威，李如月，張 青，向曉輝，夏時海

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽胰脾中心，天津 300162)

目的探討二氯二丁基酯(Dibutyltin dichloride,DBTC)及氧化苦參堿(oxymatrine,OM)對胰腺腺泡細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白和TGFβ1/Smad信號通路影響。方法體外常規(guī)傳代培養(yǎng)AR42J細胞。CCK-8法檢測0、0.1、1、10、100 μmol/L的DBTC對AR42J細胞毒性作用。Western Blot法檢測0、0.1、1、10 μmol/L的 DBTC刺激AR42J細胞72h后EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin及Snail1表達。Western Blot法檢測對照組(Control組)、模型組(DBTC：10 μmol/L)、OM治療組(DBTC: 10 μmol/L; OM: 1mg/mL)及藥物對照組(OM: 1 mg/mL)中E-cadherin、Vimentin、Snail1及轉(zhuǎn)化生長因子β1Ⅱ型受體(TβRⅡ)、p-Smad2/3的表達。結(jié)果濃度低于10 μmol/L的DBTC對AR42J細胞無明顯的毒性作用。1 μmol/L及10μmol/L DBTC刺激AR42J細胞可下調(diào)E-cadherin同時上調(diào)Vimentin、Snail1的表達。與對照組相比,10 μmol/L DBTC刺激AR42J細胞72 h后還可上調(diào)TβRⅡ、p-Smad2/3表達，OM可逆轉(zhuǎn)上述蛋白的表達。結(jié)論DBTC可誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞發(fā)生EMT，OM對此有抑制作用，其機制可能與TGFβ1/Smad 通路有關(guān)。

氧化苦參堿；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；DBTC；胰腺纖維化

胰腺纖維化(pancreatic fibrosis,PF)是慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的主要病理過程，近些年認為胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell,PSC)異常激活產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是PF的中心環(huán)節(jié)[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)使上皮細胞向間質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)變，增加ECM中纖維成分的表達，因此可認為是纖維化的重要補充[2-3]。最近的研究也發(fā)現(xiàn)EMT存在于人的PF組織中[3]，但關(guān)于EMT在PF發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)研究還極少。二氯二丁基酯(Dibutyltin dichloride,DBTC)是常用的CP動物模型造模藥物，存在TGFβ1/Smad 信號通路的激活；同時DBTC還可誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞發(fā)生凋亡并且與PF程度相關(guān)[4-5]，提示胰腺腺泡細胞可能參與了PF過程，但其發(fā)揮作用的方式還不清楚。氧化苦參堿(oxymatrine,OM)是藥用苦參干燥根中提取的生物堿，具有抗實驗性PF作用，同時對PF模型中高表達的轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)Ⅱ型受體(TβRⅡ)及Smad2/3有抑制作用[1,6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)OM可以通過抑制腎小管EMT進而抑制腎纖維化，且機制可能與TGFβ1/Smad 信號通路有關(guān)[7]。基于上述研究，我們利用DBTC體外刺激胰腺腺泡細胞，觀察EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和Snail1以及TβRⅡ、p-Smad2/3的表達；同時觀察OM對上述蛋白表達影響，初步探討EMT在PF發(fā)生中的作用及OM抗實驗性PF的機制，為CP的臨床藥物開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胰腺腺泡細胞株AR42J購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection,ATCC)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自HyClone公司；青鏈霉素混合液購自Solarbio公司；DBTC購自Sigma公司；OM購自Abcam公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；全蛋白提取試劑盒購自上海碧云天公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛公司；蛋白Marker購自Solarbio公司；PVDF 膜購自BD公司；ECL發(fā)光液購自上海碧云天公司；單克隆兔抗鼠E-cadherin、兔抗鼠Vimentin、兔抗鼠Snail1、兔抗鼠p-Smad2/3和兔抗鼠GAPDH 購自沈陽萬類公司；兔抗鼠TβRⅡ購自Proteintech公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗購自北京鼎國昌盛公司。Multiskan FC多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；電泳儀、垂直版電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽購自美國Bio-Rad公司；5 200 Multi自動熒光/化學(xué)發(fā)光成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) AR42J 細胞用含10%FBS、1% 青鏈霉素的1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期細胞隨機分為4組分別用0、0.1、1、10 μmol/L的DBTC處理篩選出DBTC的最佳藥物刺激濃度進行后續(xù)實驗；再將細胞隨機分為對照組(Control組)、模型組(DBTC:10 μmol/L)、OM治療組(DBTC:10 μmol/L;OM:1 mg/mL)、藥物對照組(OM:1 mg/mL)以研究DBTC對AR42J細胞EMT相關(guān)蛋白和TGFβ1/Smad通路影響及OM對此的作用。待細胞增至70%～80%接觸率時用不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h后加入相應(yīng)藥物，OM提前半小時加入，72 h后終止培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法測AR42J細胞增殖 取對數(shù)生長期的AR42J細胞接種于96孔板，每孔加入含10%FBS的細胞懸液100μL，細胞密度為1×104個/孔，實驗孔周圍每孔加D-Hank’s液100 μL以保持濕度。實驗孔分別以0、0.1、1、10、100 μmol/L的DBTC刺激，設(shè)4復(fù)孔，另設(shè)調(diào)零組(加入不含細胞的1640培養(yǎng)基100 μL)。分別加入相應(yīng)藥物于37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)72 h。而后每孔加入10 μLCCK-8試劑，于孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，搖床低速震蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值(OD值)。

1.2.3 Western Blot檢測EMT相關(guān)蛋白及TβRⅡ、p-Smad2/3表達 超聲裂解法提取AR42J細胞總蛋白，定量后用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行分離，上樣量30 μg，電泳電壓為80 V，電泳結(jié)束后以200 mA恒流2 h冰浴下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將目的蛋白條帶置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉2 h，再對應(yīng)加入兔抗鼠E-cadherin、Vimentin、Snail1、TβRⅡ、p-Smad2/3和GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)， 4 ℃條件下過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，而后加入HRP標記的山羊抗兔二抗稀釋液(1∶10 000)室溫中孵育3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參，條帶灰度值通過Image J軟件測取。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用SNK法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DBTC對AR42J細胞的毒性作用 以不同量級濃度DBTC刺激AR42J細胞觀察DBTC對其增殖影響。結(jié)果顯示，100 μmol/L DBTC可抑制AR42J細胞增殖(Plt;0.05)，而10 μmol/L以下濃度DBTC對AR42J細胞增殖無明顯抑制即無明顯毒性作用(見圖1)。故用10 μmol/L以下濃度DBTC進行后續(xù)實驗。

2.2 DBTC對AR42J細胞中EMT相關(guān)蛋白表達影響 與0 μmol/L DBTC刺激組相比，1 μmol/L及10 μmol/L濃度的DBTC刺激AR42J細胞72 h

可下調(diào)E-cadherin及上調(diào)Vimentin、Snail1的蛋白表達水平(Plt;0.05)，而0.1 μmol/L DBTC無明顯作用(見圖2)。其中1 μmol/L與10 μmol/L DBTC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，我們選擇后者進行后續(xù)實驗。

與0 μmol/L DBTC組比較，*Plt;0.05。 圖1 DBTC對AR42J細胞的毒性作用

2.3 OM對DBTC刺激的AR42J細胞中EMT相關(guān)蛋白表達影響 10 μmol/L DBTC刺激AR42J細胞72 h可下調(diào)E-cadherin及上調(diào)Vimentin、Snail1的蛋白表達水平；OM(1 mg/mL)干預(yù)后上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)；單獨的OM對EMT相關(guān)蛋白表達無影響(與對照組相比，*Plt;0.05；與DBTC組相比，#Plt;0.05，見圖3)。

A：電泳圖；B：數(shù)據(jù)圖；與對照組相比，*Plt;0.05；與DBTC組相比，#Plt;0.05。 圖3 OM對DBTC刺激的AR42J細胞中EMT相關(guān)蛋白表達影響

2.4 OM對DBTC刺激的AR42J細胞中TβRⅡ及p-Smad2/3表達影響 100 μmol/L DBTC刺激AR42J細胞72 h可上調(diào)TβRⅡ及p-Smad2/3的表達水平；OM(1 mg/mL)干預(yù)后上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)；單獨的OM對TβRⅡ及p-Smad2/3表達無影響(與對照組相比，*Plt;0.05；與DBTC組相比，#Plt;0.05，見圖4)。

A：電泳圖；B：數(shù)據(jù)圖；與對照組相比，*Plt;0.05；與DBTC組相比，#Plt;0.05。 圖4 OM對DBTC刺激的AR42J細胞中TβRⅡ及p-Smad2/3表達影響

3 討論

CP發(fā)病機制復(fù)雜，臨床尚無特效藥物，其主要病理特征為PF，表現(xiàn)為纖維組織逐步取代正常胰腺組織導(dǎo)致內(nèi)外分泌功能障礙。PF的發(fā)生基礎(chǔ)是ECM合成增加而降解減少導(dǎo)致基質(zhì)中膠原纖維、纖連蛋白等纖維成分大量沉積[6]。PSC的異常激活在PF的發(fā)生中發(fā)揮核心作用，此外胰腺腺泡細胞也可能是纖維成分的重要來源[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1刺激AR42J細胞，EMT相關(guān)標志蛋白表達變化明顯[9]；進一步的實驗得出TGFβ1可能通過誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞發(fā)生EMT進而促進PF的進展，且機制與TGFβ1/Smad信號通路有關(guān)。

EMT已證實是肝、腎、肺等組織發(fā)生纖維化的重要途徑，它是指上皮細胞失去極性和細胞間連接轉(zhuǎn)變成間質(zhì)樣細胞的過程，表現(xiàn)為細胞增殖、遷移能力增強，伴有上皮標志蛋白E-Cadherin、ZO-1表達減少而間質(zhì)標志蛋白Vimentin、α-SMA等表達增加，同時EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Twist等被激活，在腫瘤轉(zhuǎn)移及組織纖維化中發(fā)揮重要作用[2,7,10-11]。TGFβ1是最強效的EMT誘導(dǎo)因子和促纖維化因子，可通過激活TGFβ1/Smad通路誘導(dǎo)EMT進而發(fā)生纖維化，且其他刺激因子在誘導(dǎo)EMT的過程中多伴有TGFβ1的表達增高[7,10]。DBTC是常用的CP動物模型造模藥物，其對胰膽管上皮細胞的毒性作用可導(dǎo)致上皮壞死、導(dǎo)管梗阻，隨后膽汁持續(xù)淤積產(chǎn)生CP；血源性的DBTC還可造成胰腺細胞線粒體損傷、自噬、凋亡，加重胰腺的急性期炎癥[12-13]，且DBTC造成的大鼠胰腺腺泡細胞凋亡與纖維化程度有關(guān)[5]。同時，TGFβ1/Smad通路參與了DBTC誘導(dǎo)的大鼠CP模型，且Smad7在蛋白水平表達下降而mRNA水平表達升高，可能與TGFβ1/Smad通路的負反饋調(diào)節(jié)有關(guān)[4,13-14]。Xu等發(fā)現(xiàn)，濱蒿內(nèi)酯可抑制DBTC誘導(dǎo)的大鼠CP模型，其機制可能與濱蒿內(nèi)酯對TGFβ1/Smad通路及EMT的抑制有關(guān)[15]?；谏鲜鲅芯?，我們用DBTC體外刺激AR42J細胞，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達下調(diào)以及Vimentin、Snail1表達上調(diào)，表明DBTC可以誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞發(fā)生EMT。同時TβRⅡ、p-Smad2/3表達升高，提示TGFβ1/Smad通路可能參與了DBTC誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞發(fā)生EMT的過程。

OM是從傳統(tǒng)中藥苦參中提取的喹諾里西啶類生物堿，具有抗病毒、抗纖維化、抗炎等多種藥理作用，其作用的信號通路包括TGFβ/Smad、TLR等多種通路[16]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)OM具有抗實驗性PF作用，其機制包括對胰腺細胞中TGFβ/Smad通路的抑制[1,6]。此外，Liu等發(fā)現(xiàn)，OM可以抑制腎小管發(fā)生EMT進而抑制腎纖維化的進展，其機制與TGFβ1/Smad通路有關(guān)[7]。OM還可以通過抑制TGFβ1/Smad通路的EMT進而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，OM可逆轉(zhuǎn)DBTC刺激AR42J細胞引起的E-cadherin下調(diào)以及Vimentin、Snail1、TβRⅡ、p-Smad2/3的上調(diào)，提示OM可能是通過抑制TGFβ1/Smad 通路來抑制DBTC誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞發(fā)生EMT樣改變。

綜上所述，DBTC可誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞發(fā)生EMT樣改變，結(jié)合DBTC可誘導(dǎo)大鼠PF，提示EMT可能在PF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。OM一定程度逆轉(zhuǎn)了DBTC誘導(dǎo)的EMT樣改變，同時抑制了DBTC引起的TβRⅡ和p-Smad2/3的上調(diào)，豐富了OM抗PF的機制，為OM未來的臨床應(yīng)用提供理論參考。

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[收稿2017-08-10;修回2017-09-06]

(編輯：王福軍)

Oxymatrineinhibitsepithelial-mesenchymaltransitionandtherelatedproteinexpressionsofTβRⅡandp-Smad2/3inducedbyDibutyltindichlorideinpancreaticacinarcells

ZhangBin,XuWei,LiRuyue,ZhangQing,XiangXiaohui,XiaShihai

(Department of Hepatopancreatobiliary and Splenic Medicine,Affiliated Hospital of Logistics University of the People ′s Armed Police,Tianjin 300162,China)

ObjectiveTo explore the effects of Dibutyltin dichloride (DBTC) and oxymatrine (OM) on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and the related protein expressions of TGFβ1/Smad signaling pathway in pancreatic acinar cells.MethodsAR42J cells were culturedinvitroand treated with DBTC for 72 hours at different concentrations.The cytotoxicity of DBTC on AR42J cells was measured by CCK-8 assay.The protein expressions of E-cadherin,Vimentin,Snail1,TβRⅡand p-Smad2/3 treated by DBTC with or without OM in AR42J cells were detected by Western Blotting.ResultsDBTC had no significant cytotoxicity on AR42J cells at less than 10 μmol/L concentration.DBTC (1 μmol/L or 10 μmol/L) could downregulate E-cadherin and upregulate Vimentin and Snail1 in AR42J cells.Compared with control group,DBTC (10 μmol/L) stimulated AR42J cells for 72 hours and also upregulated TβRⅡand p-Smad2/3,whereas OM reversed the alterations.ConclusionDBTC induces EMT,which could be inhibited by OM,via TGFβ1/Smad signaling pathway in pancreatic acinar cells.

Oxymatrine; epithelial-mesenchymal transition; DBTC; pancreatic fibrosis

國家自然科學(xué)基金青年項目(NO：81500489)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃青年項目(NO：15JCQNJC45600)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金重點項目(NO：FYZ201508)。

夏時海，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：胰腺疾病臨床與基礎(chǔ)，E-mail:xshhcx@sina.com。

R285.5

A

1000-2715(2017)05-0531-05