米諾環(huán)素對(duì)人類膠質(zhì)瘤U87和LN229細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響

趙海龍，嚴(yán)婉約，李巧巧，李 科，劉 麗，李麗娟

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)卓越醫(yī)生班，貴州 遵義 563099)

米諾環(huán)素對(duì)人類膠質(zhì)瘤U87和LN229細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響

趙海龍1，嚴(yán)婉約2，李巧巧2，李 科2，劉 麗2，李麗娟1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)卓越醫(yī)生班，貴州 遵義 563099)

目的探討米諾環(huán)素對(duì)人類膠質(zhì)瘤U87和LN229細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響，為米諾環(huán)素治療臨床膠質(zhì)瘤提供基礎(chǔ)。方法采用MTT法和BrdU標(biāo)記法檢測(cè)不同濃度米諾環(huán)素(0、50、100、200 μmol/L)對(duì)人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和LN229細(xì)胞增殖水平的影響；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)米諾環(huán)素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自我更新能力的影響；通過免疫熒光標(biāo)記自噬相關(guān)蛋白LC3B和Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡法分別檢測(cè)米諾環(huán)素處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞中自噬水平和凋亡水平；使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻斷細(xì)胞自噬通路后，分別觀察米諾環(huán)素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬水平和凋亡水平的影響；qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)米諾環(huán)素作用下促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2的基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果米諾環(huán)素對(duì)人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和自我更新能力有明顯抑制作用，并呈劑量依賴性；米諾環(huán)素可誘導(dǎo)人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生廣泛的細(xì)胞自噬與凋亡，但凋亡水平呈現(xiàn)劑量依賴性，而不同濃度處理下的自噬水平無(wú)顯著性差異；使用3-MA阻斷自噬通路對(duì)細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞增殖水平和自我更新能力無(wú)顯著性影響；米諾環(huán)素處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論米諾環(huán)素可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，進(jìn)而抑制人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和自我更新能力，其中主要依賴于細(xì)胞凋亡通路的激活。因此，米諾環(huán)素可能成為潛在的膠質(zhì)瘤治療藥物。

米諾環(huán)素；膠質(zhì)瘤；增殖；凋亡；Bax；Bcl-2

人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的44.7%，發(fā)病率高達(dá)48%，其惡性度高，病死率高，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康[1]。目前惡性膠質(zhì)瘤的首選治療方式仍然是手術(shù)切除，但對(duì)病人傷害很大，且對(duì)總生存率無(wú)明顯改善[1-3]。此外，系統(tǒng)性化療是手術(shù)切除腫瘤外常用的治療方法，但大多數(shù)化療藥物效果較差，且毒副作用大[4]。因此，尋找更為有效的抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞的藥物將具有重要的臨床學(xué)意義。

米諾環(huán)素(Minocycline)，又稱半合成四環(huán)素，是一種已在臨床上廣泛應(yīng)用的高度親脂性、浸潤(rùn)組織和血液的抗生素[2,4]。除作為四環(huán)素藥物的耐藥性改良替代品治療多種感染外，米諾環(huán)素還在抗炎和神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)方面有更為廣泛的應(yīng)用[4-6]。近期大量動(dòng)物疾病模型研究表明，米諾環(huán)素可以在體內(nèi)外抑制諸如膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肝癌等多種常見腫瘤細(xì)胞的增殖以及腫瘤形成[2-3,6-9]。然而米諾環(huán)素抗腫瘤作用的具體機(jī)制卻不盡相同，主要包括細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活自噬通路以及調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖或激活等[4-5,8-9]。更為讓人困擾的是，用于腫瘤治療的米諾環(huán)素劑量非常高，為治療感染炎癥的5～10倍[2]。而在米諾環(huán)素處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究中主要著眼的是自噬相關(guān)機(jī)制的作用，其他機(jī)制少有提及[3,8]。因此，研究米諾環(huán)素在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中的其他可能作用機(jī)制，將為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和多種藥物聯(lián)合的協(xié)同作用，提高米諾環(huán)素在臨床治療腫瘤的安全性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87細(xì)胞和LN229細(xì)胞由本教研室常規(guī)保存；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT染色液、臺(tái)盼藍(lán)染色液、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒、Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自GIBCO公司、碧云天生物技術(shù)公司、Invitrigen公司、Premega公司、BD公司；兔源LC3B一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司、兔源Bax和Bcl-2一抗購(gòu)自Abcam公司，大鼠源BrdU一抗購(gòu)自Santa Cruz公司，山羊源抗兔熒光二抗、山羊源抗大鼠熒光二抗購(gòu)自Life Technologies，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自KPL公司，辣根過氧化物標(biāo)記二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Promega公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)器及計(jì)數(shù)板、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素)中培養(yǎng)，置于含5% CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每2d換液或傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)U87和LN229細(xì)胞增殖 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期消化重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，于96孔板中200 μL/孔進(jìn)行接種。次日分別加入終濃度0(DMSO作為對(duì)照)、50、100、200 μmol/L的米諾環(huán)素培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)終止前4 h按20 μL/孔添加MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)，在酶標(biāo)儀上讀取波長(zhǎng)560 nm的吸光值(OD值)。每天相同時(shí)間重復(fù)添加MTT并檢測(cè)，持續(xù)5 d并重復(fù)3次繪制時(shí)間變化曲線，比較各組細(xì)胞增殖能力。

1.4 培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線 按1.2中以DMSO或100 μmol/L米諾環(huán)素處理細(xì)胞，每個(gè)處理組以相同細(xì)胞濃度置于96孔板中，每組15孔。每隔24 h使用臺(tái)盼藍(lán)染色以及TC10自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀選取每組3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，持續(xù)5 d繪制時(shí)間變化曲線，完成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 BrdU染色實(shí)驗(yàn) 按1.3中消化重懸細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，每孔500 μL加入24孔板中培養(yǎng)過夜后。每孔加入3 μg BrdU繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，4%多聚甲醛固定；2M鹽酸冰浴處理10 min后，0.1%Triton 100室溫處理5 min，山羊血清室溫封閉2 h；加入稀釋好的大鼠源BrdU一抗，4 ℃孵育過夜；加入稀釋好的山羊源抗大鼠熒光二抗200 μL，室溫孵育2 h；Hoechst33342染色15 min，PBS漂洗后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，然后統(tǒng)計(jì)同一視野下細(xì)胞總數(shù)與BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 軟瓊脂克隆形成檢測(cè)U87和LN229細(xì)胞自我更新能力 將含有0.6% Agarose溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基按每孔1 mL加入6孔板中靜置至完全凝固。按1.3中消化處理的細(xì)胞重懸至含有0.6% Agarose溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基加至下層凝固瓊脂上，靜置至上層瓊脂完全凝固。15～20 d后，顯微鏡觀察單克隆形成情況。

1.7 免疫熒光染色檢測(cè)U87和LN229細(xì)胞自噬水平 細(xì)胞以適當(dāng)濃度重懸至鋪有細(xì)胞爬片的12孔板中，過夜貼壁后，分別加入終濃度0(DMSO作為對(duì)照)、10、50、100 μmol/L的米諾環(huán)素培養(yǎng)72 h(其余按照相應(yīng)處理方式操作)后，使用4%多聚甲醛固定，0.3%Triton 100室溫處理5 min，5%BSA封閉2 h，依次加入兔源LC3B一抗(1∶500)4 ℃過夜，山羊源抗兔熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，Hoechst33342染色15 min，PBS漂洗后取出爬片置于載玻片上在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U87和LN229細(xì)胞凋亡水平 胰酶消化并搜集細(xì)胞，PBS洗兩遍，每個(gè)樣本中加入500 μL的結(jié)合緩沖液(Binding buffer)使細(xì)胞重懸，再分別加入5 μL Annexin V和10 μL PI染料，室溫下避光孵育10～30 min；立刻進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，并用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

1.9 qRT-PCR檢測(cè)Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá) 分別提取對(duì)照組和米諾環(huán)素處理組培養(yǎng)72 h的U87和LN229細(xì)胞，裂解后按Trizol提取試劑盒(Invitrigen公司)說明書提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrigen公司)說明書轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，每組重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算細(xì)胞中Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)量。其中，根據(jù)NCBI查找Bax、Bcl-2和β-actin的基因序列(基因庫(kù)序列號(hào)依次為NM_138761.3、EU287875.1、DQ407611.1)，按照引物設(shè)計(jì)原則利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，而引物序列分別為：Bax： F：TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG；R：GTCCAGCCCATGATGGTTCT。Bcl-2： F：ATGTGTGTGGAGAGCTCAAC；R：AGCAGCCAGGAGAAATCA。β-actin：F：TGGCATCCACG-AGACCACCTTCA；R：GACTGCTGTCACCTTCACCGTTCC。以上引物于上海生工公司合成，PCR反應(yīng)體系如下：H2O 7 μL、Mix(2R)10 μL、CXR0.2 μL、正反向引物各0.4 μL、DNA模板2 μL，反應(yīng)條件95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，同時(shí)收集熒光信號(hào)，設(shè)置40個(gè)循環(huán)，最后溫度上升至95 ℃，繪制溶解曲線。

1.10 Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2的蛋白量 分別提取對(duì)照組和米諾環(huán)素處理組培養(yǎng)72 h的U87和LN229細(xì)胞，使用RIPA高效裂解液提取細(xì)胞全蛋白，測(cè)定蛋白濃度后以每組30 μg，加入上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%BSA常溫封閉1h，依次加入兔源Bax或Bcl-2一抗(1∶500)4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參，使用ImageJ比較蛋白條帶灰度值測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 米諾環(huán)素對(duì)人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響 MTT結(jié)果顯示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和LN229中，與不加入米諾環(huán)素的DMSO對(duì)照組相比較，米諾環(huán)素在50、100和200 μmol/L濃度時(shí)細(xì)胞增殖受到明顯抑制(Plt;0.05)，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性，即隨著加入培養(yǎng)環(huán)境的米諾環(huán)素濃度的增加，不同實(shí)驗(yàn)組中同一時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞活力逐漸明顯降低(見圖1)。同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)結(jié)果顯示100 μmol/L濃度的米諾環(huán)素可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖速度(Plt;0.05)(見圖2)。隨后，通過BrdU標(biāo)記熒光染色計(jì)數(shù)分別對(duì)U87和LN229細(xì)胞系的對(duì)照組(DMSO)和實(shí)驗(yàn)組(100 μmol/L的米諾環(huán)素)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性標(biāo)記率顯著低于同期對(duì)照組細(xì)胞(Plt;0.05)，說明米諾環(huán)素可以顯著減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力(見圖3)。

A：米諾環(huán)素對(duì)U87細(xì)胞增殖能力的影響；B：米諾環(huán)素對(duì)LN229細(xì)胞增殖能力的影響。圖1 米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響

A：米諾環(huán)素對(duì)U87細(xì)胞數(shù)量的影響；B：米諾環(huán)素對(duì)LN229細(xì)胞數(shù)量的影響。圖2 米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活能力的影響

A：米諾環(huán)素處理后U87和LN229細(xì)胞中BrdU的免疫熒光染色情況；B：米諾環(huán)素處理后U87和LN229中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比率。 圖3 BrdU染色顯示米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

2.2 米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞自我更新能力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，米諾環(huán)素處理后，U87和LN229細(xì)胞形成克隆的數(shù)目顯著減少(Plt;0.05)，克隆體積減小(見圖4)，說明米諾環(huán)素抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自我更新能力。

A：米諾環(huán)素處理后U87和LN229細(xì)胞集落形成情況；B：米諾環(huán)素處理后U87和LN229形成的細(xì)胞集落數(shù)量。 圖4 米諾環(huán)素處理后的人膠質(zhì)瘤Soft agar克隆成瘤情況

2.3 米諾環(huán)素對(duì)U87和LN229細(xì)胞自噬和凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，經(jīng)過不同濃度米諾環(huán)素(10、500、100μmol/L)處理后的U87和LN229細(xì)胞胞漿內(nèi)LC3B熒光斑點(diǎn)數(shù)量呈現(xiàn)明顯增加(Plt;0.05)，但同一細(xì)胞不同米諾環(huán)素濃度組之間LC3B熒光斑點(diǎn)數(shù)量變化不顯著(Pgt;0.05)，并沒有呈現(xiàn)劑量依賴性(見圖5)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，U87和LN229細(xì)胞凋亡率隨著米諾環(huán)素濃度的升高而呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)(Plt;0.05)，具有顯著的劑量依賴性(見圖6)。

A：米諾環(huán)素處理后U87和LN229細(xì)胞LC3B的免疫熒光染色；B：米諾環(huán)素處理后U87和LN229細(xì)胞LC3B斑點(diǎn)數(shù)比值。圖5 免疫熒光檢測(cè)米諾環(huán)素處理后的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞LC3B的變化

A：米諾環(huán)素處理后U87和LN229中凋亡細(xì)胞的流式分布情況；B：米諾環(huán)素處理后U87和LN229中凋亡細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的比率。圖6 米諾環(huán)素處理后的人膠質(zhì)瘤中細(xì)胞凋亡情況流式分析

為了進(jìn)一步探究細(xì)胞自噬和凋亡在米諾環(huán)素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮的各自作用，我們使用10umol/L的3-甲基腺嘌呤(3-MA，一種廣泛自噬抑制劑)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理4h以降低其自噬水平。LC3B免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)100umol/L米諾環(huán)素處理后的U87和LN229細(xì)胞在3-MA作用下，LC3B熒光斑點(diǎn)數(shù)均發(fā)生顯著降低(Plt;0.05)，說明3-MA可以在一定程度上阻斷米諾環(huán)素處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)自噬途徑激活(見圖7)。與之相對(duì)的是，米諾環(huán)素處理后的U87和LN229細(xì)胞凋亡情況在3-MA處理前后差異不顯著(Pgt;0.05)(見圖8)。這些結(jié)果表明自噬水平的下降并不影響米諾環(huán)素誘發(fā)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

此外，米諾環(huán)素處理后的U87和LN229細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力在3-MA處理前后差異也不顯著(Pgt;0.05)(見圖9～10)。上述信息說明自噬水平的改變并不影響米諾環(huán)素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的抑制作用。因此我們推測(cè)米諾環(huán)素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力和自我更新能力主要依賴于直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，而細(xì)胞自噬水平的激活可能是米諾環(huán)素的間接或次要途徑。

A：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)87和LN229細(xì)胞中LC3B的免疫熒光染色的影響；B：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)87和LN229細(xì)胞中LC3B斑點(diǎn)數(shù)與細(xì)胞數(shù)的比值的影響。圖7 3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞LC3B表達(dá)情況的影響

A：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)U87和LN229中凋亡細(xì)胞的流式分布的影響；B：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)U87和LN229中凋亡細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的比率的影響。圖8 3MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤中細(xì)胞凋亡情況的影響

A：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)U87細(xì)胞活力的影響；B：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)LN229細(xì)胞活力的影響影響。圖9 3MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤中細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 米諾環(huán)素對(duì)U87和LN229細(xì)胞表達(dá)Bax和Bcl-2的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，100μmol/L米諾環(huán)素處理后的U87和LN229細(xì)胞中，促凋亡基因BaxmRNA表達(dá)水平顯著升高(Plt;0.05)，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(Plt;0.05)(見圖11)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明Bax和Bcl-2在蛋白表達(dá)水平上也呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)(見圖12)。

A：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)U87和LN229細(xì)胞集落形成的影響；B：3-MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)U87和LN229形成的細(xì)胞集落數(shù)量的影響。圖10 3MA處理前后米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤中細(xì)胞成瘤能力的影響

A：米諾環(huán)素處理后U87中Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平變化；B：米諾環(huán)素處理后LN229中Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平變化。圖11 米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤中Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響

A：米諾環(huán)素處理后U87中Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平變化；B：米諾環(huán)素處理后LN229中Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平變化。圖12 米諾環(huán)素對(duì)人膠質(zhì)瘤中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

米諾環(huán)素屬于第二代四環(huán)素類藥物，具有廣譜、藥力持久、不具光敏性等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上主要用于治療表皮和軟組織細(xì)菌感染等[4,10]。近年來許多研究表明米諾環(huán)素在抗腫瘤和神經(jīng)組織保護(hù)方面有很好的臨床應(yīng)用前景[5-6,8,11]。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素可以通過自噬通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力[8]；Liu等也證實(shí)在肝癌細(xì)胞中米諾環(huán)素可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期阻滯和凋亡發(fā)生抑制癌細(xì)胞增殖能力[2]；同時(shí)，Ataie-kachoie等對(duì)卵巢癌的離體和在體研究中發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素可以同時(shí)調(diào)控P53介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路和AKT/mTOR介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路的表達(dá)[6]；此外，米諾環(huán)素在多種神經(jīng)疾病的動(dòng)物模型中通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、緩解神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和自噬、減少活性氧的產(chǎn)生等方式發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。

現(xiàn)有研究證實(shí)，米諾環(huán)素可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤作用，然而在膠質(zhì)瘤方面除自噬以外的可能機(jī)制則未見報(bào)道。本研究從細(xì)胞增殖能力和自我更新能力兩方面證實(shí)米諾環(huán)素對(duì)人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，并具有劑量依賴性。腫瘤細(xì)胞增殖能力和活力的降低通常與抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡有關(guān)，而常見的細(xì)胞程序性死亡包括細(xì)胞自噬和凋亡。因此本研究使用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)米諾環(huán)素處理72h后的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U87和LN229細(xì)胞中出現(xiàn)廣泛性的細(xì)胞自噬和凋亡現(xiàn)象，然而自噬水平相對(duì)于凋亡水平并不具有劑量依賴性。這一發(fā)現(xiàn)提示米諾環(huán)素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬可能是通過某種間接途徑實(shí)現(xiàn)而并沒有直接作用于相應(yīng)的自噬信號(hào)通路。因此接下來選擇自噬抑制劑3-MA阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞中自噬的發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬水平的下降并不影響米諾環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的發(fā)生，并且相應(yīng)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生顯著性下調(diào)。

綜上所述，本研究表明米諾環(huán)素可以在體外通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，抑制人類惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和LN229增殖和自我更新，潛在的機(jī)制可能更直接依賴于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在此過程中間接激活細(xì)胞自噬。而由于米諾環(huán)素在臨床上已廣泛使用，其極有可能成為潛在的膠質(zhì)瘤治療藥物，但臨床實(shí)用性有待進(jìn)一步探討。

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[收稿2017-06-17;修回2017-08-10]

(編輯：譚秀榮)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

EffectsofminocyclineoncellproliferationandapoptosisinU87andLN229glioblastomacells

ZhaoHailong1,YanWanyue2,LiQiaoqiao2,LiKe2,LiuLi2,LiLijuan1

(1.Department of Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China；2.Excellent Doctor Educational Reform Class of 2014,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo explore the effects of minocycline on proliferation and apoptosis of U87 and LN229 glioblastoma cells and the involved mechanisms and further provide the evidence for promising target for the treatment of glioblastoma.MethodsMTT assay and BrdU staining were performed to detect the proliferation of U87 and LN229 cells treated with minocycline at different concerntrations (0,50,100 and 200 μmol/l).The self-renewal ability was measured by soft agar clonogenic assay.The activation of autophagy was detected by immunofluorescence analysis against autophagy-associated protein light chain 3B (LC3B) and the apoptosis level was detected by Annexin V-FITC/PI assay.Pretreatment with autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) was employed to investigate the mechanisms underlying the autophagy and apoptosis regulation associated with minocycline.The expression of apoptotic protein Bax and Bcl-2 in glioblastoma cells followed by minocycline treatment was determined by qRT-PCR and western blot assays.ResultsMinocycline significantly inhibited the proliferation and self-renewal ability of U87 and LN229 cells in a dose-dependent manner.The activation of autophagy and apoptosis in glioblastoma cells were induced by minocycline treatment.The significant differences of apoptosis rates among different concerntrations but not autophagy levels were shown.The autophagy pathway blockage in treatment of 3-MA showed no significant effect on apoptosis level,cells proliferation and self-renewal ability.Minocycline induced the apoptosis of glioblastoma cells through up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2.ConclusionMinocycline inhibits glioblastoma cells proliferation and self-renewal through an increase of autophagy and apoptosis,which is mainly associated with activation of apoptotic pathway.Thus,minocycline is a promising agent in the treatment of glioblastoma.

Minocycline; glioblastoma; proliferation; apototosis; Bax; Bcl-2

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:81260131)；遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO：F-818)；遵義醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(NO：20163726)。

李麗娟，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥物靶點(diǎn)篩選，E-mail:LiLijuan@zmc.edu.cn。

R739.41

A

1000-2715(2017)05-0496-08