白藜蘆醇改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退與抑制炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)

李明剛，鄧媛媛，龔其海

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院，貴州 遵義 563100)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

白藜蘆醇改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退與抑制炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)

李明剛1,2，鄧媛媛1，龔其海1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院，貴州 遵義 563100)

目的觀察白藜蘆醇對(duì)阿爾茨海默病(AD)樣神經(jīng)炎癥大鼠模型的作用及其機(jī)制。方法雄性SD大鼠隨機(jī)分空白對(duì)照組(n=10)，模型組(n=15)，陽性藥組(n=15)，白藜蘆醇10、20、40 mg/kg劑量組(n=15)。除空白對(duì)照組外，各組大鼠腹腔注射脂多糖(0.5 mg/kg)，空白對(duì)照組注射相同體積的溶媒，每周1次，共13周。造模期間，陽性藥組灌胃布洛芬40 mg/kg，白藜蘆醇不同劑量組分別每日一次灌胃白藜蘆醇10、20、40 mg/kg，連續(xù)13周，空白對(duì)照組和模型組以等體積蒸餾水灌胃。Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力；透射電鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)；免疫印跡法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、環(huán)氧合酶2(COX-2)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的蛋白表達(dá)。結(jié)果白藜蘆醇和布洛芬顯著縮短模型大鼠的空間逃避潛伏期；減輕海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷；降低海馬組織TNF-α、COX-2和IL-1β的過度表達(dá)。結(jié)論白藜蘆醇通過下調(diào)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善LPS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退。

白藜蘆醇；脂多糖；阿爾茨海默??；炎癥；大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種常見于中老年人的中樞退行性疾病。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知障礙和日常生活能力下降，同時(shí)常伴有精神及運(yùn)動(dòng)障礙。AD的病因及病理生理學(xué)機(jī)制迄今尚未完全闡明，可能涉及到氧化應(yīng)激、基因突變、神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙及環(huán)境毒素等方面。其中神經(jīng)炎癥反應(yīng)貫穿AD的發(fā)生與發(fā)展過程[1]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到諸如炎癥、外傷等損傷時(shí)，可導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積，進(jìn)而激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞，釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)等炎性因子，這些炎癥因子阻止小膠質(zhì)細(xì)胞有效地去除淀粉樣斑塊，從而使炎癥反應(yīng)加重，Aβ含量增加，最終加速AD的發(fā)展[2-3]。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種多酚類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果、茶葉等植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗炎、增強(qiáng)免疫、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[4-6]。本題組既往研究發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇可改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的急性神經(jīng)炎癥大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制與減少TNF-α和COX-2的表達(dá)及淀粉樣前體蛋白的水平有關(guān)[7]。然而，AD是進(jìn)行性的慢性發(fā)展過程，急性神經(jīng)炎癥模型并不能完全模擬AD-樣神經(jīng)炎癥。因此，本研究在既往工作基礎(chǔ)上，通過LPS誘導(dǎo)的大鼠慢性神經(jīng)炎癥模型，評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)AD樣神經(jīng)炎癥模型學(xué)習(xí)記憶減退的影響，在此基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)海馬炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，探索白藜蘆醇對(duì)AD樣大鼠神經(jīng)炎癥模型可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠85只，雄性，SPF級(jí)，體重250±20 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK渝2007-0005)。飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房/屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，5只/籠。

1.1.2 主要藥品和試劑 白藜蘆醇(經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度大于98%)從湖南華光生物有限公司購(gòu)買；LPS從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買；TNF-α、IL-1β及COX-2抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.3 儀器 MT-200 Morris水迷宮為成都泰盟科技公司產(chǎn)品；垂直電泳系統(tǒng)及全自動(dòng)凝膠圖象分析儀均為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，模型組，陽性藥組，白藜蘆醇低、中、高劑量組，除空白對(duì)照組為10只大鼠外，其余各組n=15。大鼠腹腔注射LPS(0.5 mg/kg)造模，每周1次，連續(xù)13周，空白對(duì)照組同法注射等體積生理鹽水。造模期間，陽性藥組灌胃布洛芬40 mg/kg，白藜蘆醇各劑量組分別每日1次灌胃白藜蘆醇10、20、40 mg/kg，連續(xù)13周，空白對(duì)照組和模型組則給予等量蒸餾水。

1.2.2 Morris水迷宮 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能采用Morris水迷宮檢測(cè)，方法同本研究組既往報(bào)道[8]。

1.2.3 Western blot檢測(cè)TNF-α、COX-2和IL-1β的蛋白水平 水迷宮檢測(cè)結(jié)束后，麻醉各組大鼠，斷頭取海馬。提取海馬總蛋白并計(jì)算蛋白濃度。將樣品制備后上樣至8% SDS-PAGE凝膠梳孔，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗TNF-α(1∶1 000)、COX-2(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、β-actin孵育過夜后，二抗山羊抗兔IgG(H+L)孵育，洗膜，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)和Quantity One定量分析系統(tǒng)檢測(cè)條帶吸光度積分值，將目的條帶積分光密度比上內(nèi)參β-actin的積分光密度可得目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退的影響 Morris水迷宮結(jié)果顯示，各組大鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸縮短。從第3天起，模型組的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(Plt;0.05)，而白藜蘆醇 40 mg/kg組大鼠在第3天和第4天的逃避潛伏期均較模型組顯著縮短(Plt;0.05)，布洛芬40 mg/kg及白藜蘆醇20 mg/kg大鼠在第4天的逃避潛伏期明顯縮短 (Plt;0.05)。這表明長(zhǎng)期腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大鼠的學(xué)習(xí)記憶減退，而布洛芬、白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶減退具有改善作用(見表1)。

組別n第1日(s)第2日(s)第3日(s)第4日(s)空白對(duì)照1097.1±27.964.5±24.233.1±24.025.0±17.3模型1576.8±22.874.7±20.159.2±20.1*58.8±37.4*陽性藥1594.2±24.158.5±31.445.7±26.626.0±15.5#白藜蘆醇低劑量1580.5±27.463.4±34.743.5±27.440.5±28.8白藜蘆醇中劑量1582.5±25.868.3±36.461.1±27.732.5±20.0#白藜蘆醇高劑量1588.2±19.558.1±30.234.0±24.5#31.1±17.5#

與空白對(duì)照組比較，*Plt;0.05；與模型組比較，#Plt;0.05。

2.2 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡觀察到，對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰，核糖體豐富。模型組與空白對(duì)照組比較，大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核不規(guī)則，異染色質(zhì)增多并聚集，核周間隙明顯加大，線粒體出現(xiàn)腫脹或空泡。與模型組比較，布洛芬組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，大多數(shù)核染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。與布洛芬組相似，長(zhǎng)期給予白藜蘆醇20 mg/kg或40 mg/kg的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)較規(guī)則，且白藜蘆醇40 mg/kg的高劑量組的超微結(jié)構(gòu)損傷不明顯(如圖1所示)。綜上可知，LPS反復(fù)腹腔注射導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)受損，布洛芬和白藜蘆醇(20、40 mg/kg)長(zhǎng)期給藥可減輕LPS導(dǎo)致的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷。

A：空白對(duì)照組；B：模型組；C：布洛芬組；D-F：白藜蘆醇低、中、高劑量組。圖1 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響(500 nm)

2.3 白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬IL-1β、TNF-α及COX-2蛋白表達(dá)的影響 Western blott檢測(cè)了大鼠海馬炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，模型組海馬組織中IL-1β、TNF-α以及COX-2的蛋白表達(dá)均顯著升高(Plt;0.01)，布洛芬長(zhǎng)期給藥可以降低上述各蛋白在模型大鼠海馬內(nèi)的過度表達(dá)(Plt;0.01，Plt;0.05，Plt;0.01)，同時(shí)，白藜蘆醇各劑量治療組能夠不同程度的降低大鼠海馬內(nèi)上述蛋白的表達(dá)。此提示白藜蘆醇可降低LPS誘導(dǎo)的類AD樣炎癥模型中大鼠海馬IL-1β、TNF-α和COX-2的過度表達(dá)。

與空白對(duì)照組比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01；與模型組比較，#Plt;0.05，##Plt;0.01。圖2 白藜蘆醇對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠海馬IL-1β、TNF-α及COX-2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病機(jī)制中的作用至關(guān)重要[9-10]。LPS作為細(xì)菌內(nèi)毒素，無論是與腦細(xì)胞孵育、腦部注射或者是全身注射均能誘導(dǎo)明顯的炎癥反應(yīng)[11-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過反復(fù)腹腔注射LPS誘導(dǎo)慢性神經(jīng)炎癥。發(fā)現(xiàn)連續(xù)注射LPS 13周后，大鼠在水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組，且海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)受損，證實(shí)長(zhǎng)期腹腔給予LPS可引起大鼠學(xué)習(xí)記憶減退和神經(jīng)元損傷，提示造模成功。而給予陽性藥布洛芬40 mg/kg或受試藥白藜蘆醇20～40 mg/kg能改善大鼠的行為學(xué)癥狀和神經(jīng)元損傷。

基于炎癥反應(yīng)在AD發(fā)病過程中的關(guān)鍵作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)了炎癥相關(guān)介質(zhì)COX-2、TNF-α和IL-1β在海馬組織中的蛋白表達(dá)。COX-2是前列腺素生成過程中的關(guān)鍵限速酶，而前列腺素作為一種炎性介質(zhì)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞形成炎癥環(huán)路。在AD發(fā)病過程中COX-2表達(dá)上調(diào)，可見COX-2在AD炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的扮演了關(guān)鍵角色[14-15]。同時(shí)，AD的進(jìn)展過程中，過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，如TNF-α、IL-1β，其中涉及“細(xì)胞因子循環(huán)”引起慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加速AD的進(jìn)程[16-17]。在炎癥或其他疾病的存在下，TNF-α通常被小膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放，它作為內(nèi)源性熱源，增加了谷氨酸的釋放，引起神經(jīng)毒性發(fā)生[18]。而白細(xì)胞介素1族包括11種細(xì)胞因子，其中IL-1β具有最強(qiáng)的促炎能力，它在神經(jīng)炎癥中含量增多，它的存在會(huì)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的吞噬作用，不利于Aβ斑塊的清除，加重AD患者的病情[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)腹腔注射LPS后，大鼠海馬組織的炎癥介質(zhì)COX-2、TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯增加，提示長(zhǎng)期注射LPS可誘導(dǎo)大鼠的AD樣慢性神經(jīng)炎癥。同時(shí)，陽性藥布洛芬及受試藥白藜蘆醇明顯降低模型大鼠COX-2、TNF-α和IL-1β的過度表達(dá)，即白藜蘆醇具有抗AD樣慢性神經(jīng)炎癥的作用。在既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬中炎癥因子COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的增加[21]，因此，本研究從蛋白水平進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)白藜蘆醇可改善反復(fù)腹腔注射LPS誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶減退和海馬神經(jīng)元損傷，其機(jī)制與抑制炎癥介質(zhì)COX-2、TNF-α和IL-1β的過度表達(dá)有關(guān)。

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[收稿2017-04-18;修回2017-06-17]

(編輯：譚秀榮)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Resveratrolimproveslipopolysaccharide-inducedlearningandmemoryimpairmentthroughinhibitionofinflammation-relatedproteinexpressioninrats

LiMinggang1,2,DengYuanyuan1,GongQihai1

(1.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.People’s Hospital of Zunyi City Bozhou District,Zunyi Guizhou 563100,China)

ObjectiveTo observe the effects of resveratrol (Res) on Alzheimer's disease (AD)-like neuroinflammation in rats and explore its mechanisms.MethodsMale SD rats were randomly divided into sham-operated group (n=10) as control group,model group (n=15),positive group and model + Resveratrol (Res 10,20 and 40 mg/kg) groups (n=15 per groups).To construct inflammatory model,rats in the model group were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS) at the dose of 0.5 mg/kg once a week continuously for 13 weeks.Meanwhile,the intragastric administration of distilled water,Ibuprofen (IBU,40 mg/kg) or Res (10,20 and 40 mg/kg) once a day for each group.Morris water maze was applied to investigate the cognitive function.Electron microscope was used to detect the hippocampal neuronal morphology.The expression of tumor necrosis factor (TNF-α),interleukin-10(IL-10) and cyclooxygenase-2 (COX-2) was analyzed by western blot assay.ResultsThe swimming distances in model group were obviously longer than those in sham group,while Res or IBU treatment significantly shortened the swimming distances compared with those in model rats.Electron microscopy showed that Res significantly reduced the ultrastructural damage of hippocampal neurons.Moreover,the overexpression of TNF-α,COX-2 and IL-1β protein in the hippocampus were significantly decreased after Res treatment.ConclusionRes improves spatial learning and memory in LPS-induced rats,and the possible mechanisms are due to inhibiting the expressions of pro-inflammatory cytokines.

Alzheimer’s disease; inflammation; lipopolysaccharide; resveratrol; rat

教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(NO：IRT_17R113)。

龔其海，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:gqh@zmc.edu.cn。

R965

A

1000-2715(2017)05-0491-05