抗老化啤酒酵母研究進展

楊靜靜，王金晶，李永仙，鄭飛云，鐘俊輝，李崎

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抗老化啤酒酵母研究進展

楊靜靜1,2,3，王金晶1,2，李永仙1,2，鄭飛云1,2，鐘俊輝3，李崎1,2

1 江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122 2 江南大學釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫 214122 3 華潤雪花啤酒 (中國) 有限公司，北京 100005

啤酒酵母是啤酒釀造的核心,對啤酒風味多樣性及風味穩(wěn)定性具有重要影響。風味穩(wěn)定性是啤酒重要的質(zhì)量指標之一，篩選或選育綜合抗老化能力高的優(yōu)良啤酒酵母菌株將成為有效解決該問題的途徑之一。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展及啤酒酵母基因組的不斷闡明，人們對啤酒酵母菌種改良展開了大量的研究，以期解決啤酒釀造問題，改善啤酒質(zhì)量。本文對采用傳統(tǒng)方式及基因工程手段選育高產(chǎn)抗氧化物質(zhì)或低產(chǎn)啤酒老化物質(zhì)及老化前驅(qū)物的啤酒酵母的最新研究進展進行了綜述。其中，對抗老化啤酒酵母的選育目標、評價方法及選育策略進行了討論，并對抗老化啤酒酵母選育的研究熱點及發(fā)展趨勢進行了展望。

啤酒,啤酒酵母,抗老化,抗氧化,風味穩(wěn)定性,菌種改良

風味穩(wěn)定性是啤酒最重要的質(zhì)量指標之一[1]，自上世紀以來一直是啤酒行業(yè)的研究熱點。消費者主要通過飲用啤酒時的口感差異或變化來識別啤酒的好壞或特定品牌的啤酒，啤酒老化是影響啤酒口感的主要因素。

對啤酒老化機理的研究可追溯到20世紀60年代，氧化是啤酒老化的主要成因，Vanderhaegen等[2]綜述了啤酒中多種老化物質(zhì)的化學起源及形成機理。由于構(gòu)成啤酒組分體系的復雜性，國內(nèi)外對啤酒老化研究的角度、途徑不同，由此形成了啤酒老化機理的復雜性。目前，在老化機理研究中占主導地位的為活性氧的作用和羰基化合物的生成。啤酒老化現(xiàn)象是啤酒中的抗氧化物質(zhì)、老化物質(zhì)及老化前驅(qū)物受時間及溫度等多種環(huán)境因素影響共同作用的結(jié)果，影響因素包括原輔料、釀造工藝、啤酒酵母、儲存及物流條件等。釀造科學家經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)啤酒老化過程只能延緩而不能終止，這使啤酒老化問題至今仍然是一個無法攻關(guān)的學術(shù)難題。在過去的工業(yè)實踐中，釀造科學家注意到將酚類化合物、抗壞血酸鈉、還原酮及亞硫酸鹽等抗氧化物質(zhì)添加到啤酒中可以抑制啤酒的氧化損害，從而改善啤酒的風味穩(wěn)定性。但是隨著人們食品安全意識的日益提高，啤酒工廠對外來添加物的管控越來越謹慎和嚴格，這些外來添加物的使用越來越少甚至完全不使用。

近年來，釀造科學家對啤酒及啤酒原料中的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)[3-6]、生產(chǎn)工藝參數(shù)[7-9]及某一種[10]或一類老化物質(zhì)[11]對啤酒風味穩(wěn)定性的影響進行了大量研究，但這并不能從根本上解決該問題。而啤酒酵母是啤酒釀造的核心，啤酒酵母自身就會代謝產(chǎn)生很多抗氧化物質(zhì)、老化物質(zhì)及老化前驅(qū)物，這些物質(zhì)與麥汁中原有的物質(zhì)協(xié)同作用對啤酒風味穩(wěn)定性具有重要影響，并成為啤酒在儲存過程中進一步發(fā)生老化的化學基礎，表1簡述了部分啤酒中與老化相關(guān)、抗氧化及促氧化物質(zhì)。此外，由于活的啤酒酵母具有很好的還原活性，其本身就是優(yōu)良的抗氧化劑。因此，篩選或選育綜合抗啤酒風味老化能力提高的優(yōu)良啤酒酵母菌株將成為有效解決啤酒風味穩(wěn)定性問題和延緩啤酒老化的途徑之一。本文將對抗老化啤酒酵母的最新研究展開綜述。

表1 啤酒中老化相關(guān)、抗氧化及促氧化物質(zhì)簡述

Table 1 Summary of beer aging-related, anti-oxidant and pro-oxidant substances

Chemical classCompoundsFunctionPossible sources Carbonyl compounds Linear aldehydes AcetaldehydeAged flavor imparted to beer;Major beer aging substanceProcess and ingredients: yeast, high fermentation temperatures, over-pitching, under-aeration;Packaging and storage: oxidation of alcohol (E)-2-nonenalPaper, wet cardboard flavor imparted to beer;Beer aging indicatorPackaging and storage: oxidation;Formed in malt and wort production;Released during storage Strecker aldehydes 2-methylbutanalBeer aging indicatorsPackaging and storage: released during storage 3-methylbutanal 2-phenylaldehyde Benzaldehyde 2-methylpropanel Ketones (E)-β-DamascenoneBeer aging indicatorPackaging and storage:breakdown of precursors from hops Heterocyclic compounds FurfuralCaramel, bready flavor imparted to beer; Heat-related aging indicatorsPackaging and storage: Maillard reaction products 5-Hydroxymethylfurfural (5-HMF) 3-Methyl-2-butene-1-thiol (MBT)Lightstruck flavor imparted to beerPackaging and storage: photochemical reaction of isomerized hop alpha acids with fluorescent or sunlight S-compoundsSulfur dioxide (Sulfite)Anti-oxidantProcess and ingredients: yeast Glutathione (GSH) Thioredoxin (TRX) Superoxide dismutase (SOD)Recombinant yeast containing SOD Polyphenols(+)-catechinMain anti-oxidant capacity contributors in light beerProcess and ingredients: mashing, wort boiling, malt and hops Gallic acid Ferulic acid (high concentration)Certain polyphenols behave as pro-oxidantsPackaging and storage: oxygen susceptible Ferulic acid (low concentration) MelanoidinsMain anti-oxidant capacity contributors in dark beerIngredients: dark speciality malt Present pro-oxidant properties

The table contents were summarized according to Vanderhaegen[2].

1 抗老化啤酒酵母選育目標

目前，為了選育抗啤酒風味老化的啤酒酵母，要求選育后的啤酒酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的啤酒抗氧化活性提高和/或其在儲存過程中老化程度較低。此外，Bamforth也從實用性角度指出酵母對啤酒風味穩(wěn)定性的直接影響主要體現(xiàn)在生成亞硫酸鹽和還原羰基化合物的能力兩個方面[12]。目前，抗老化啤酒酵母的研究多集中于二氧化硫 (SO2) 和乙醛這兩個與啤酒風味穩(wěn)定性密切相關(guān)的化合物。

除降低成品啤酒中分子氧及自由基對啤酒風味的損害，在發(fā)酵過程中啤酒酵母具有抵抗一系列環(huán)境應力對生長代謝的影響，也可以有效避免啤酒風味老化的潛在風險。因此，選育具有較好環(huán)境應力耐受能力的啤酒酵母也將成為選育抗老化啤酒酵母可能的重要目標之一。

1.1 增加抗氧化物質(zhì)含量

由啤酒酵母代謝產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)主要包括亞硫酸鹽/SO2、谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶 (SOD) 及硫氧還蛋白等。

SO2是啤酒酵母硫代謝途徑中的重要中間代謝產(chǎn)物，也是啤酒中最有效的抗氧化劑之一[13]，SO2對啤酒風味具有重要影響，F(xiàn)lavorActiV公司SO2啤酒感官品評風味閾值為7 mg/L，超過此風味閾值通常會給啤酒口感上帶來燃燒的火柴味，目前多個國家規(guī)定SO2含量不能超過10 mg/L，否則必須在瓶身上標出，適量的SO2對提高啤酒的風味穩(wěn)定性具有積極作用。由于啤酒發(fā)酵過程中啤酒酵母產(chǎn)生SO2含量的提高通常伴隨著硫化氫 (H2S) 含量的提高，H2S在啤酒中的典型濃度為0.001–0.2 mg/L，其風味閾值很低，約為4 μg/L，微量的H2S是Lager型啤酒風味特征的重要組成部分，過量則呈現(xiàn)臭雞蛋氣味，給啤酒帶來不良風味。迄今為止，高產(chǎn)SO2成為選育抗老化啤酒酵母的主要選育方向，但一般都會同時結(jié)合對H2S含量的影響進行酵母選育研究。程殿林等選育獲得了一株高產(chǎn)SO2的菌株M24，與出發(fā)菌株相比，其SO2生成量提高了107%，H2S生成量減少了51%[14]。Yoshida等選育了一株高產(chǎn)SO2而H2S含量并未提高的突變株，主酵結(jié)束的嫩啤酒與成熟后的瓶裝啤酒其SO2含量分別為母本的2.8倍和2.6倍，而H2S含量分別為母本的0.9倍和1.1倍[15]。Chen等選育獲得了一株高產(chǎn)SO2和GSH、低產(chǎn)H2S、具有較高抗氧化活性、風味更為穩(wěn)定且使用安全的釀酒酵母，與出發(fā)菌株相比，其發(fā)酵液中的SO2和GSH含量分別增加了31%和30.2%，而H2S含量降低了74.9%，其相應的DPPH自由基清除率增加了24.6%，抗老化能力提高了33%[16]。陳璐等選育出一株高產(chǎn)SO2、低產(chǎn)H2S且發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株TK-10，其SO2產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了2–3倍[17]。Iijima和Ogata等構(gòu)建了SO2分泌量提高的自克隆釀酒酵母，采用該酵母釀造的啤酒風味穩(wěn)定性良好，SC-和SB-基因的同源轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的SO2含量從出發(fā)株的11 mg/L分別提高到21.2 mg/L和18.7 mg/L[18]。

GSH是啤酒酵母在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的一種非常重要的抗氧化物質(zhì)，可以與一系列的活性氧自由基發(fā)生非酶促反應，具有維持啤酒酵母細胞氧化還原平衡的能力。隨著GSH含量的增加，啤酒的抗老化能力得到顯著提高[19]。蔣凱構(gòu)建了一株高產(chǎn)GSH的啤酒酵母基因工程菌，由其發(fā)酵所獲得的啤酒風味穩(wěn)定性也得到提高[20]。

SOD也是啤酒酵母抗氧化防御系統(tǒng)中的一種具有重要生理活性的抗氧化性物質(zhì)，但是對于未經(jīng)改造的啤酒酵母其不能分泌到胞外，因此無法對啤酒風味穩(wěn)定性產(chǎn)生直接影響。但是Wang等通過在同一株酵母中共表達和基因，同時刪除和基因，促使SOD1和GSH分泌到胞外，由此構(gòu)建了一株發(fā)酵性能良好的酵母菌株[19]。

此外，硫氧還蛋白由于其抗氧化作用和對啤酒風味穩(wěn)定的可能影響而逐漸獲得研究者的關(guān)注。

由于啤酒風味的形成和穩(wěn)定是多種代謝產(chǎn)物之間協(xié)同作用的結(jié)果，通過菌株改造改變某些化合物的含量水平存在影響風味平衡及產(chǎn)品質(zhì)量的風險，故合理控制目標產(chǎn)物水平非常重要。因此，啤酒中的抗氧化物質(zhì)的含量也不是越高越好，應在滿足啤酒風味穩(wěn)定性、膠體穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性等的基礎上，且不帶來其他不良風味并符合食品安全的范圍內(nèi)，抗氧化物質(zhì)含量越高越好。目前，提高啤酒酵母代謝產(chǎn)生內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)含量及其分泌到胞外的能力且不形成其他不良風味將成為未來抗老化啤酒酵母的重要選育目標之一。

1.2 降低老化物質(zhì)或老化前驅(qū)物含量

早在1966年，Hashimoto首次發(fā)現(xiàn)啤酒中老化味的形成伴隨著揮發(fā)性羰基化合物含量的提高[21]。由于酵母代謝產(chǎn)生包括乙醛在內(nèi)的一系列羰基化合物，其含量高低具有明顯的菌株依賴性。此外，啤酒酵母本身又具有極強的還原羰基化合物的能力。因此，選育低產(chǎn)老化物質(zhì)和/或老化前驅(qū)物的啤酒酵母將會有效改善啤酒的風味穩(wěn)定性。乙醛是啤酒中含量最高的一種羰基化合物，在啤酒中的典型濃度為2–15 mg/L，在啤酒中的風味閾值范圍為5–15 mg/L，含量過高會引起不良的風味，同時也會影響啤酒的抗老化能力?？刂埔胰┖繉Ω纳破【骑L味，提高啤酒質(zhì)量具有重要意義。李崎等選育了一株低產(chǎn)羰基化合物且GSH合成能力提高的抗老化啤酒酵母菌株MI4。沈楠等在此基礎上選育了一株低產(chǎn)乙醛的啤酒酵母D-A-14，由該突變株發(fā)酵獲得的啤酒風味穩(wěn)定性提高[22]。Wang等選育了一株低產(chǎn)乙醛，同時乙醇產(chǎn)量提高的突變株MA12[23]。

1.3 增強環(huán)境應力耐受能力

現(xiàn)代化的啤酒生產(chǎn)，高濃釀造及各種輔料的應用對啤酒酵母尤其是Lager型啤酒酵母對環(huán)境應力的耐受提出了新的要求。高滲透壓、高乙醇應力等條件影響酵母細胞的活力及啤酒的質(zhì)量。Sanchez等將Lager型啤酒酵母孢子與釀酒酵母進行雜交從而獲得了13株應力抗性增強的Lager型啤酒酵母雜合體，這些酵母在發(fā)酵結(jié)束后的活力也有所增強[24]。Li等基于細胞壁多糖組成選育了一株壓力耐性提高的啤酒酵母，并對菌株中細胞應激反應相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄情況進行分析，發(fā)現(xiàn)酵母細胞完整性途徑相關(guān)基因發(fā)生了不同程度的上調(diào)[25]。Wang等通過敲除Lager型啤酒酵母基因構(gòu)建了一株新型啤酒酵母[26]，該酵母細胞壁中β-1,3葡聚糖的含量降低，幾丁質(zhì)含量增加，細胞壁變厚，發(fā)生在細胞壁上的這些變化使得酵母對環(huán)境應力的耐受能力更強，在發(fā)酵過程中顯示出了很好的魯棒性，由其釀造的啤酒顯示出了良好的抗氧化活性。盡管有研究表明氧化應力耐受能力提高的Lager型啤酒酵母突變株其發(fā)酵產(chǎn)生的啤酒未必具有更強的氧化穩(wěn)定性[27]，但是在工業(yè)大生產(chǎn)條件下啤酒酵母具有更好的環(huán)境應力耐受能力是獲得穩(wěn)定啤酒質(zhì)量，尤其是良好的啤酒風味穩(wěn)定性的基礎。因此，人們?nèi)韵Ｍ@得可耐受各種環(huán)境應力的啤酒酵母菌株，然而從該角度選育抗老化啤酒酵母菌株還需要更多的探索。

2 抗老化啤酒酵母選育評價手段

選育抗老化啤酒酵母的主要目的在于控制啤酒風味質(zhì)量，延緩啤酒老化。在確定選育目標和評價抗老化啤酒酵母選育效果時，一個指標的改變很難影響到啤酒品質(zhì)，而如果對整個啤酒品質(zhì)具有顯著影響，一定是啤酒本身組分發(fā)生了極大的變化，啤酒有可能風味不協(xié)調(diào)或者面臨其他問題。因此，評價抗老化啤酒酵母的選育除了考慮目標化合物的評價，通常還需要基于啤酒抗老化能力評價及風味品評。綜合評價啤酒的抗老化能力，即除研究單一目標化合物之外，尤其是針對SO2和乙醛這一類易與其他物質(zhì)結(jié)合的化合物，要結(jié)合其他重要老化指標、抗氧化力指標及常規(guī)風味指標共同評價。

目前，傳統(tǒng)的啤酒老化指標和抗氧化指標仍是啤酒風味老化研究中的常用指標，如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 自由基清除率常用于評價啤酒本身的抗氧化力，硫代巴比妥酸(TBA) 值作為常用的啤酒老化指標評價啤酒的老化程度。但是采用這些方法評價抗老化啤酒酵母選育效果都存在一定缺陷，如DPPH法是一種常用的評價抗氧化力的體外的化學方法，不適合生理環(huán)境，因此不適用于有利于健康或者有利于酵母生長或抵抗氧化應力的抗氧化活性的評價。此外，由酵母代謝產(chǎn)生的微量抗氧化物質(zhì)中除SO2外，其他均為對健康有益的抗氧化物質(zhì)。因此，尚需要探索新的抗氧化活性評價方法鑒別由不同啤酒酵母發(fā)酵帶來的啤酒抗氧化活性之間的差別。此外，這些體外的抗氧化力測定方法還具有共同的缺點，就是它們都沒有測定抗氧化物質(zhì)對細胞活力的影響。這些缺陷可以通過使用活的細胞和生理相關(guān)的氧化劑解決，活的細胞系統(tǒng)將為測定抗氧化活性提供最佳平臺[28]。

自2007年Wolfe和Liu發(fā)表了細胞抗氧化方法[29]以來，這種“基于細胞的抗氧化活性評價方法” (CAA)，比一般的化學方法能夠更好地闡述生物系統(tǒng)的復雜性，解決了傳統(tǒng)化學評價方法不能反映抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)的真實活性及可能的運行機制問題，對評價對健康有益的抗氧化物質(zhì)具有獨特的優(yōu)越性。由于啤酒酵母在啤酒發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生很多抗氧化物質(zhì)，這些抗氧化物質(zhì)大部分是在啤酒發(fā)酵后期啤酒酵母響應高壓、高滲的抗氧化防御系統(tǒng)的一部分，對酵母在生理條件下具有抗氧化應力的保護，這些物質(zhì)對啤酒風味穩(wěn)定性具有保護作用。因此，采用細胞抗氧化活性評價指標將有助于構(gòu)建評價這一類篩選目標選育效果的平臺。該方法在釀酒領域中的應用尚無報道，同時，這種方法是否可用于啤酒酵母本身抗氧化活力評價或啤酒酵母自溶研究也有待進一步探究。

另外，Wu等報道了一種基于氧化劑誘導的釀酒酵母生長停滯的高通量的抗氧化劑篩選方法[28]。這種方法利用了氧化應力調(diào)節(jié)酵母細胞生長停滯的生理現(xiàn)象，從生理角度對抗氧化物質(zhì)進行評價，并采用多種氧化劑及抗氧化劑使篩選更為全面，能夠篩選不同化學屬性的化合物的氧化清除活性及在細胞內(nèi)的抗氧化活性。目前，這種抗氧化活性篩選方法在國內(nèi)釀酒領域里尚沒有應用報道，釀酒酵母作為一種典型的模式細胞用于評價抗氧化物質(zhì)在生理條件下的抗氧化作用對研究啤酒在發(fā)酵過程中的抗氧化活性具有一定意義。

3 抗老化啤酒酵母的選育策略

經(jīng)典和傳統(tǒng)的酵母育種主要依靠酵母形成孢子，孢子間交配形成新種，以期獲得優(yōu)良特性。近年來，隨著DNA序列分析的完成，酵母作為外源基因克隆和表達的受體及載體系統(tǒng)逐步完善，酵母的人工育種得到廣泛和實質(zhì)性的開展。因此，從酵母菌種改良的角度出發(fā)，篩選或者采用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)某種抗氧化物質(zhì)或某些抗氧化物質(zhì)組合，低產(chǎn)老化物質(zhì)或者老化前驅(qū)物的啤酒酵母，從而從本質(zhì)上改善啤酒的風味穩(wěn)定性。

3.1 傳統(tǒng)育種技術(shù)選育抗老化啤酒酵母

李崎等采用紫外誘變篩選蛋氨酸耐性菌株，進而利用高濃度蛋氨酸連續(xù)馴養(yǎng)，獲得了1株羰基化合物產(chǎn)生減少而GSH合成能力提高的抗老化啤酒酵母菌株MI4[30]。在此基礎上，沈楠等進一步以MI4為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線誘導、雙硫侖平板初篩和乙醛培養(yǎng)基馴化復篩，獲得了1株低產(chǎn)乙醛的啤酒酵母D-A-14。采用該突變株釀造的啤酒中乙醛含量為2.86 mg/L，與出發(fā)菌株相比下降了76%，總高級醇含量也有所降低，從而改善了啤酒的風味穩(wěn)定性及協(xié)調(diào)性。Wang等采用UV突變的傳統(tǒng)育種技術(shù)，采用乙醇為唯一碳源，4-MP為篩選標記篩選到1株低產(chǎn)乙醛，且乙醇產(chǎn)量提高的突變株MA12[23]。

Chen等通過紫外誘變的非基因工程方法獲得了1株高產(chǎn)SO2和GSH、低產(chǎn)H2S的釀酒酵母，由其釀造的啤酒具有較高抗氧化活性、風味穩(wěn)定性良好且可安全使用[16]。程殿林等對BY-1菌進行紫外誘變處理，通過醋酸鉛顯色平板、不同硫源鑒別平板、SO2及H2S生成量的測定，選育出1株能適量高產(chǎn)SO2的菌株M24[14]。陳璐等以啤酒釀造Lager酵母TS-01為出發(fā)菌株，依次利用含乙硫氨酸、羥基正纈氨酸的平板進行定向育種，采用硝酸鉛平板分離出高產(chǎn)SO2、低產(chǎn)H2S的菌株，然后通過EBC管、100 L中試發(fā)酵試驗，以發(fā)酵液的SO2、H2S、雙乙酰、乙醛、高級醇的含量和發(fā)酵度為篩選指標獲得1株發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株TK-10[17]。隨后，以出發(fā)菌株TS-01為對照進行600 t大生產(chǎn)對比實驗，實驗結(jié)果表明新篩選出的菌株TK-10發(fā)酵液SO2生成量明顯提高，成品酒抗氧化性能有所提高，口感良好。Sanchez等將Lager型啤酒酵母孢子與進行雜交獲得了13株應力抗性增強的Lager型啤酒酵母雜合體，在發(fā)酵結(jié)束后新獲得的酵母菌株活力也有所提高[24]。

綜上所述，由于啤酒酵母應用領域的特殊性，人們更加青睞采用傳統(tǒng)育種技術(shù)選育抗老化啤酒酵母菌株，并在該領域獲得了很多成功。然而采用傳統(tǒng)育種技術(shù)獲得所需表型特性概率極低[31]，也極易發(fā)生性狀的回復突變，因此可采用不同的基因工程技術(shù)手段或者多目標策略構(gòu)建抗老化啤酒酵母菌株并進行相關(guān)機理探索。

3.2 逆向代謝工程策略選育抗老化啤酒酵母

SO2對啤酒風味穩(wěn)定性具有重要影響，啤酒酵母可通過還原吸收的硫酸鹽生成SO2。過表達和/或[32]或鈍化或敲除[33]均可獲得高產(chǎn)SO2的突變株。然而，敲除了的Lager型啤酒酵母菌株很有可能會因胞內(nèi)甲硫氨酸含量減少或酵母生長緩慢而獲得不需要的表型。此外，采用重組DNA技術(shù)選育的酵母菌株不能用于商業(yè)化生產(chǎn)啤酒。因此，采用逆向代謝組學技術(shù)選育抗老化酵母將有效地解決這一問題。Yoshida等采用整合代謝組和轉(zhuǎn)錄組學分析手段，對mRNA豐度和細胞內(nèi)代謝物的濃度進行全局分析，鑒定了差異的分子基礎，并依此成功獲得了高產(chǎn)SO2而H2S含量并未增加的突變株[15]。

3.3 采用酵母“基因自克隆技術(shù)”構(gòu)建抗老化啤酒酵母

自克隆技術(shù)是利用來源于酵母本身的目的基因構(gòu)建酵母工程菌，不引入其他任何的外源DNA 片段，因此具有生物安全性。在食品及飲料酒領域，酵母基因工程菌、轉(zhuǎn)基因作物并不受消費者歡迎。采用酵母“基因自克隆技術(shù)”對酵母基因組進行改造由于其不引入外源DNA，有助于消除消費者對貼有基因工程菌標簽的產(chǎn)品的恐懼感，卡塔赫納生物安全議定書對自克隆酵母并不進行管控。基因自克隆技術(shù)在工業(yè)啤酒酵母菌株改造中具有重要的實際應用價值。中國科學院微生物研究所酵母分子遺傳與育種研究室首先使用攜帶基因的酵母-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，使基因在啤酒酵母中高效表達，所構(gòu)建工程菌中GSH含量比對照菌株提高了50%[34]，并在此基礎之上采用同源重組技術(shù)將來自啤酒酵母YSG-26的基因整合至青島啤酒酵母YSF31的乙酰乳酸合成酶基因內(nèi)部，在破壞基因的同時，增加基因的拷貝數(shù)，100 L發(fā)酵罐的中試結(jié)果表明，所構(gòu)建酵母工程菌的GSH含量提高了34%，所產(chǎn)啤酒抗老化能力提高1.5倍[35]。王金晶等采用同源重組技術(shù)在啤酒酵母中引入來源于其本身的GSH限速酶基因，同時破壞了調(diào)控乙醛合成的乙醇脫氫酶II基因，構(gòu)建了1株GSH產(chǎn)量提高了約10 mg/L的啤酒酵母，其風味穩(wěn)定性較出發(fā)菌株提高了1.3倍[36]?；蚓幋a亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，Iijima和Ogata通過基因重組技術(shù)高效表達成功構(gòu)建了亞硫酸鹽分泌量提高的自克隆釀酒酵母，采用該酵母釀造的啤酒風味穩(wěn)定性良好[18]。因此，采用自克隆技術(shù)構(gòu)建抗老化啤酒酵母將非常實用有效，并更具商用化可能。

3.4 采用多基因改造策略構(gòu)建抗老化啤酒酵母

Wang等通過在同1株酵母中共同表達和基因，使SOD1和GSH產(chǎn)量增加，同時敲除和基因，構(gòu)建了1株發(fā)酵性能良好的酵母菌株，由該菌株釀造的啤酒抗氧化性能及抗老化能力均明顯增強[19]。Donalies等通過過表達和基因構(gòu)建抗老化啤酒酵母菌株，其亞硫酸鹽分泌量增加[32]。由于啤酒酵母基因組倍性的復雜性，采用多基因改造策略在啤酒酵母，尤其是Lager型的抗老化啤酒酵母菌株選育中存在較大難度。但是由于啤酒組分的復雜性，多基因改造策略極有可能是提高啤酒綜合抗老化能力最適合的抗老化啤酒酵母選育策略。

4 展望

世界各地的專業(yè)機構(gòu)試圖對啤酒酵母進行基因改造，以期獲得優(yōu)良啤酒酵母菌株。通過增加抗氧化物質(zhì)、降低老化物質(zhì)或老化前驅(qū)物含量提高啤酒風味穩(wěn)定性成為抗老化啤酒酵母選育的主要選育方向。此外，提高啤酒酵母代謝產(chǎn)生的對人體健康有益的抗氧化物質(zhì)含量，增強啤酒這一產(chǎn)品的健康屬性；抑制啤酒酵母在工業(yè)大生產(chǎn)復雜環(huán)境應力條件下的衰變，防止有害物質(zhì)進入酵母細胞及防止酵母自溶等將成為新的研究熱點。

采用基因工程技術(shù)如CRISPR/Cas9等基因編輯系統(tǒng)對啤酒酵母進行多基因綜合改造可以為抗老化啤酒酵母選育提供重要的機理上的佐證。此外，由于通過異源同組DNA如抗性基因的基因工程菌的使用受到極大關(guān)注，而無法進行商業(yè)化應用，因此采用“基因自克隆技術(shù)”選育抗老化啤酒酵母，因其生物安全性更易被消費者接受[37]，而極具吸引力[38]。

此外，采用釀酒酵母和真貝酵母雜交產(chǎn)生新的Lager型啤酒酵母，從中找到抗啤酒風味老化能力更強的啤酒酵母具有很好的商用化前景。但由于1株新酵母只有發(fā)酵性能及風味特性優(yōu)良，才需考慮抗啤酒風味老化的能力強弱，因無法明確選育目標，因此如何確定選育目標和選育策略將雜交技術(shù)用于抗老化啤酒酵母的選育值得思考。

由于Lager型啤酒酵母異源多倍體的雜交屬性和極差的孢子形成能力，對其進行遺傳學改造將極具挑戰(zhàn)性。隨著Lager型啤酒酵母基因組學研究[39-42]的不斷深入，結(jié)合系統(tǒng)生物學、代謝工程以及高通量的篩選方法為抗老化啤酒酵母選育打開新通道，未來將推動這一領域的發(fā)展。

REFERENCES

[1] Bamforth CW, Lentini A. The flavor instability of beer//Bamforth CW, Russell I, Stewart G, Eds. Beer: A Quality Perspective. New York: Academic Press, 2009: 85–109.

[2] Vanderhaegen B, Neven H, Verachtert H, et al. The chemistry of beer aging–a critical review. Food Chem, 2006, 95(3): 357–381.

[3] Woffenden HM, Ames JM, Chandra S, et al. Effect of kilning on the antioxidant and pro-oxidant activities of pale malts. J Agric Food Chem, 2002, 50(17): 4925–4933.

[4] Maillard MN, Soum MH, Boivin P, et al. Antioxidant activity of barley and malt: relationship with phenolic content. LWT-Food Sci Technol, 1996, 29(3): 238–244.

[5] Abrahamsson V, Hoff S, Nielsen NJ, et al. Determination of sulfite in beer based on fluorescent derivatives and liquid chromatographic separation. J Am Soc Brew Chem, 2012, 70(4): 296–302.

[6] Leitao C, Marchioni E, BergaentzléM, et al. Fate of polyphenols and antioxidant activity of barley throughout malting and brewing. J Cereal Sci, 2012, 55(3): 318–322.

[7] Li HP, Sun GF, Zhao MM, et al. Effects of fermentation process parameters on the antioxidant activity of green beer. Sci Technol Food Industr, 2012, 33(21): 156–159 (in Chinese). 李會品, 孫桂芳, 趙謀明, 等. 發(fā)酵工藝參數(shù)對嫩啤酒抗氧化力的影響. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(21): 156–159.

[8] Saison D, De Schutter DP, Overlaet-Michiels W, et al. Effect of fermentation conditions on staling indicators in beer. J Am Soc Brew Chem, 2009, 67(4): 222–228.

[9] Leitao C, Marchioni E, Bergaentzlé M, et al. Effects of processing steps on the phenolic content and antioxidant activity of beer. J Agric Food Chem, 2011, 59(4): 1249–1255.

[10] Wu MJ, Clarke FM, Rogers PJ, et al. Identification of a protein with antioxidant activity that is important for the protection against beer ageing. Int J Mol Sci, 2011, 12(9): 6089–6103.

[11] Costa MSD, Gon?alves C, Ferreira A, et al. Further insights into the role of methional and phenylacetaldehyde in lager beer flavor stability. J Agric Food Chem, 2004, 52(26): 7911–7917.

[12] Bamforth CW. The science and understanding of the flavour stability of beer: a critical assessment. Brauwelt Int, 1999, 17(2), 98–110.

[13] Andersen ML, Outtrup H, Skibsted LH. Potential antioxidants in beer assessed by ESR spin trapping. J Agric Food Chem, 2000, 48(8): 3106–3111.

[14] Cheng DL. The breeding ofproducing compatible level of SO2and studies on the flavor stability of beer[D]. Tianjin: Tianjin University of Science&Technology, 2005 (in Chinese). 程殿林. 適量高產(chǎn)SO2菌種選育與啤酒風味穩(wěn)定性的研究 [D]. 天津: 天津科技大學, 2005.

[15] Yoshida S, Imoto J, Minato T, et al. Development of bottom-fermentingstrains that produce high SO2levels, using integrated metabolome and transcriptome analysis. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(9): 2787–2796.

[16] Chen YF, Yang X, Zhang SJ, et al. Development ofproducing higher levels of sulfur dioxide and glutathione to improve beer flavor stability. Appl Biochem Biotechnol, 2012, 166(2): 402–413.

[17] Chen L, Wan XJ, Yin H, et al. Screening of brewer's yeast strain TK-10 with high antioxygenic property and its industrial fermentation. Food Ferment Industr, 2012, 38(7): 77–81 (in Chinese). 陳璐, 萬秀娟, 尹花, 等. 抗氧化啤酒酵母菌株TK-10的選育及工業(yè)生產(chǎn)驗證. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(7): 77–81.

[18] Iijima K, Ogata T. Construction and evaluation of self-cloning bottom-fermenting yeast with highexpression. J Appl Microbiol, 2010, 109(6): 1906–1913.

[19] Wang ZY, Bai XJ, He XP, et al. Secretion expression of SOD1 and its overlapping function with GSH in brewing yeast strain for better flavor and anti-aging ability. J Ind Microbiol Biotechnol, 2014, 41(9): 1415–1424.

[20] Jiang K, Li Q, Gu GX. Improvement of beer anti-staling capability by genetically modifying industrial brewing yeast with high glutathione content. Chin J Biotech, 2007, 23(6): 1071–1076 (in Chinese). 蔣凱, 李崎, 顧國賢. 構(gòu)建高產(chǎn)谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究. 生物工程學報, 2007, 23(6): 1071–1076.

[21] Hashimoto N. Report of the Research Laboratories of Kirin Brewery Co., Ltd., No.9. Takasaki: Research Laboratories of Kirin Brewery Co., Ltd., 1966.

[22] Shen N. Screening of brewer's yeast of low acetaldehyde production[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2013 (in Chinese). 沈楠. 低產(chǎn)乙醛啤酒酵母的選育 [D]. 無錫: 江南大學, 2013.

[23] Wang JJ, Shen N, Yin H, et al. Development of industrial brewing yeast with low acetaldehyde production and improved flavor stability. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(3): 1016–1025.

[24] Sanchez GR, Solodovnikova N, Wendland J. Breeding of lager yeast withimproves stress resistance and fermentation performance. Yeast, 2012, 29(8): 343–355.

[25] Li XE, Wang JJ. Strengthening of cell wall structure enhances stress resistance and fermentation performance in lager yeast. J Am Soc Brew Chem, 2014, 72(2): 88–94.

[26] Wang JJ, Xu WN, Li XE, et al. Absence ofin lager brewing yeast results in aberrant cell wall composition and improved beer flavor stability. World J Microbiol Biotechnol, 2014, 30(6): 1901–1908.

[27] Berner TS, Arneborg N. The role of lager beer yeast in oxidative stability of model beer. Lett Appl Microbiol, 2012, 54(3): 225–232.

[28] Wu MJ, O’Doherty PJ, Fernandez HR, et al. An antioxidant screening assay based on oxidant-induced growth arrest in. Fems Yeast Res, 2011, 11(4): 379–387.

[29] Wolfe KL, Liu RH. Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessing antioxidants, foods, and dietary supplements. J Agric Food Chem, 2007, 55(22): 8896–8907.

[30] Li Q, Pan XQ, Gu GX. Improvement of beer flavor stability by screening anti-staling brewer’s yeast. Chin J Biotech, 2004, 20(6): 912–917 (in Chinese). 李崎, 潘學啟, 顧國賢. 選育抗老化啤酒酵母提高啤酒風味穩(wěn)定性的研究. 生物工程學報, 2004, 20(6): 912–917.

[31] Attfield PV, Bell PJL. Genetics and classical genetic manipulations of industrial yeasts//de Winde JH, Ed. Functional Genetics of Industrial Yeasts. Berlin Heidelberg: Springer, 2003: 17–55.

[32] Donalies UEB, Stahl U. Increasing sulphite formation inby overexpression ofand. Yeast, 2002, 19(6): 475–484.

[33] Hansen J, Kielland-Brandt MC. Inactivation ofin brewer’s yeast specifically increases SO2formation during beer production. Nat Biotechnol, 1996, 14(11): 1587–1591.

[34] Fan XY, He XP, Guo XN, et al. Increasing glutathione formation by functional expression of the γ-glutamylcysteine synthetase gene in. Biotechnol Lett, 2004, 26(5): 415–417.

[35] Zhang JN, He XP, Guo XN, et al. Genetically modified industrial brewing yeast with high-glutathione and low-diacetyl production. Chin J Biotech, 2005, 21(6): 942–946 (in Chinese). 張吉娜, 何秀萍, 郭雪娜, 等. 低雙乙?？估匣【平湍腹こ叹臉?gòu)建. 生物工程學報, 2005, 21(6): 942–946.

[36] WangJJ. Genetic modification and application studies of industrial brewing yeast strains[D]. Beijing: University of Chinese Academy of Sciences, 2011 (in Chinese). 王金晶. 工業(yè)啤酒酵母菌的遺傳修飾與應用研究[D]. 北京: 中國科學院研究生院, 2011.

[37] Akada R. Genetically modified industrial yeast ready for application. J Biosci Bioeng, 2002, 94(6): 536–544.

[38] Saerens SMG, Duong CT, Nevoigt E. Genetic improvement of brewer’s yeast: current state, perspectives and limits. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 86(5): 1195–1212.

[39] Caesar R, Palmfeldt J, Gustafsson JS, et al. Comparative proteomics of industrial lager yeast reveals differential expression of theand non-parts of their genomes. Proteomics, 2007, 7(22): 4135–4147.

[40] Nakao Y, Kanamori T, Itoh T, et al. Genome sequence of the lager brewing yeast, an interspecies hybrid. DNA Res, 2009, 16(2): 115–129.

[41] Walther A, Hesselbart A, Wendland J. Genome sequence of, the world’s first pure culture lager yeast. G3-Genes Genom Genet, 2014, 4(5): 783–793.

[42] Baker E, Wang B, Bellora N, et al. The genome sequence ofand the domestication of lager-brewing yeasts. Mol Biol Evol, 2015, 32(11): 2818–2831.

(本文責編 郝麗芳)

Advances in anti-staling brewer’s yeast

Jingjing Yang1,2,3, Jinjing Wang1,2, Yongxian Li1,2, Feiyun Zheng1,2, Junhui Zhong3, and Qi Li1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 Labovatory of Brewing Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3 China Resources Snow Breweries (China) Company Limited, Beijing 100005, China

Brewer’s yeast is crucial in beer fermentation, mainly beer flavor diversity and stability. Beer flavor stability is one of the most influential beer quality aspects, and screening or breeding brewer’s yeast with enhanced anti-staling capacity will be an effective solution. In recent decades, with the progress of genetic engineering and detailed description of brewer’s yeast genome, great efforts have been made to improve brewer’s yeast. This review highlights recent advances in classical and genetic engineering improvement of yeasts to produce more antioxidant compounds or less beer aging substances and precursors. Therein, improvement targets, evaluation methods and development strategies of anti-staling brewer’s yeast are also discussed. Furthermore, hotspot and future trend of anti-staling yeast strain development are also proposed.

beer, brewer’s yeast, anti-staling, antioxidant, flavor stability, strain improvement

Supported by:Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2013AA102106-03), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571942, 31601558), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20150159), Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. JUSRP51306A, JUSRP51402A, JUDCF13008).

江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(PAPD)，國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2013AA102106-03)，國家自然科學基金 (Nos. 31571942, 31601558)，江蘇省自然科學基金(No. BK20150159)，江蘇基礎研究資助項目(Nos. JUSRP51306A, JUSRP51402A, JUDCF13008)資助。

August 22, 2016; Accepted:December 2, 2016

Qi Li. Tel: +86-510-85918176; Fax: +86-510-85805219; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn

網(wǎng)絡出版時間：2017-01-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170116.1006.002.html