畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)Ⅲ型類人膠原蛋白及其胃粘膜修復功能

李偉娜，尚子方，段志廣，李林波，賀婧，范代娣

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畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)Ⅲ型類人膠原蛋白及其胃粘膜修復功能

李偉娜1,2，尚子方1,2，段志廣1,2，李林波1,2，賀婧1,2，范代娣1,2

1 西北大學化工學院陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點實驗室，陜西西安 710069 2 西北大學化工學院陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術研究中心，陜西西安 710069

為提高重組畢赤酵母發(fā)酵重組人Ⅲ型膠原蛋白產(chǎn)量，采用響應面對其生長階段的BMGY培養(yǎng)基(Buffered minimal glycerol-complex medium) 組成進行優(yōu)化。通過Placket-Burman試驗，得出酵母提取物、蛋白胨、甘油對膠原蛋白產(chǎn)量有顯著影響，通過Box-Behnken中心組合實驗以及Design-Expert分析軟件建立了以膠原蛋白產(chǎn)量為響應值的響應方程，得到最適濃度分別為酵母提取物1.13%，蛋白胨1.61%，甘油0.86%。經(jīng)實驗驗證，在最優(yōu)BMGY培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)12 h后，所得到畢赤酵母干重為4.41 g/L，生長階段的菌重量增加了26%。在22 L發(fā)酵罐中通過高密度發(fā)酵，產(chǎn)量達到4.71 g/L。該重組膠原蛋白對大鼠乙酸灼傷胃粘膜有明顯修復作用，為生物醫(yī)用材料的應用制備奠定了基礎。

畢赤酵母，重組人Ⅲ型膠原蛋，響應面優(yōu)化法，胃粘膜

膠原蛋白是結(jié)締組織中最主要的結(jié)構蛋白，對維持細胞形態(tài)、維護生物組織和器官的正常生理功能和損傷修復都有著重要作用[1-2]。因良好的生物相容性、生物可吸收性和促新細胞形成等特征，廣泛應用于包括生物醫(yī)用材料、化妝品、食品工業(yè)、醫(yī)藥和印染等領域[3]。相比酸、堿水解法或酶解法從動物的皮和骨組織中提取并純化過程中易帶來病毒隱患、生物功效和臨床療效不穩(wěn)定等問題，利用基因工程技術重組表達膠原蛋白成為研究熱點和研究方向[4-5]。

嗜甲醇酵母菌主要應用于基因工程蛋白的表達[4,6]。相比哺乳動物細胞，具有真核蛋白質(zhì)合成途徑的不要求復雜的生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，在基因水平上比較容易操縱[7]。一般可以通過培養(yǎng)基的優(yōu)化設計、發(fā)酵過程關鍵參數(shù)的調(diào)控以及甲醇誘導等發(fā)酵控制策略實現(xiàn)的高密度發(fā)酵[8]。Placket-Burman (PB) 設計是一種高效篩選重要影響因素的統(tǒng)計方法[9]，近年來應用廣泛的響應面分析方法 (RSM) 可預測響應值以及研究因素間交互作用，并且已成功應用于多例發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化中[10-11]。

消化性潰瘍是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，一般認為主要與胃粘膜的攻擊因子和防御因子之間的失衡有關，以胃粘膜防御能力的減弱為主。服用抗酸性藥物如西咪替丁、沙漠替丁等可緩解，但易引起多種并發(fā)癥[12]。結(jié)合類人膠原蛋白具有的良好生物學相容性、細胞黏附性、促新細胞形成和止血功能，推測膠原蛋白對于粘膜治愈方面能夠發(fā)揮很大的優(yōu)勢[10-14]。

重組膠原蛋白發(fā)酵屬于分段式發(fā)酵，與產(chǎn)物生成緊密相關的誘導階段發(fā)酵已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化[15]，因此本研究對菌體生長階段所需具有緩沖能力的甘油混合培養(yǎng)基 (BMGY培養(yǎng)基參數(shù)，包括酵母提取物、蛋白胨、甘油、硫酸銨、酵母氮堿和生物素等) 進行優(yōu)化。首先通過PB設計確定對膠原蛋白產(chǎn)量影響的重要參數(shù)并以RSM進行優(yōu)化，然后在22 L生物工程(Bioengineering) 發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵。最后，以造模成功率最高 (接近100%)、穩(wěn)定性良好的大鼠乙酸性胃黏膜損傷模型研究類人膠原蛋白對乙酸性胃潰瘍的修復作用，探究重組人Ⅲ型膠原蛋白對胃潰瘍治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司。巴氏畢赤酵母GS115宿主菌株為本實驗室保存。表達載體穿梭質(zhì)粒pPIC9k購自Invitrogen 公司。實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠20只，體重100?120 g，購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心。

1.2 儀器

瑞士Bioengineering 22 L發(fā)酵罐，發(fā)酵在線控制器，空氣壓縮機；純氧瓶；高速冷凍離心機，湖南湘儀有限公司；電子分析天平：瑞士Mettler 公司；蛋白電泳儀：美國BioRad公司；酶標儀Power Wave XS2：美國Gene公司；分光光度計Model 2082PCS：美國UNICO；真空冷凍干燥機：美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種和培養(yǎng)基

選擇本實驗室自構建的重組GS115為實驗菌種，表達載體為pPIC9k。AOX1基因的啟動子受甲醇強烈誘導，使其能夠利用甲醇作為唯一碳源快速生長并表達分泌性人Ⅲ型膠原蛋白[16]。GS115中重組人Ⅲ型膠原蛋白載體的構建和蛋白的表達方法參考文獻[16]。

1.3.2 細胞生長條件

生長階段的細胞在YPD (酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%) 中培養(yǎng)，30 ℃、24 h。在25 mL BMGY緩沖培養(yǎng)基 (酵母提取物1%，蛋白胨2%，0.1 mol/L pH 6.0磷酸鉀緩沖液，酵母氮堿1.34%，生物素4×10–5%，甘油1%) 中操作，220 r/min、18 h后，室溫1 500?3 000×離心5 min，收集菌體細胞。輕輕倒出上清液，將底部菌體重懸至600為1.0，然后在BMMY (buffered methanol- complex medium) 培養(yǎng)基中誘導表達[15]，培養(yǎng)基成分為發(fā)酵培養(yǎng)基成分：酵母提取物1.19%、蛋白胨2.1%、甲醇1.18%、酵母氮堿0.3%、硫酸銨0.77%和生物素4.5×10–5%。

1.3.3 分析方法

分光光度計通過濁度測定600的細胞密度。用BandScan 5.0軟件分析膠原蛋白SDS-PAGE條帶所占比例，然后乘以其對應的總蛋白含量，計算出相應膠原蛋白含量。

1.3.4 過程參數(shù)優(yōu)化

通過PB設計確定重要參數(shù)。篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中對畢赤酵母細胞生長量有顯著影響的濃度參數(shù)：酵母提取物、蛋白胨、甘油、酵母氮堿、硫酸銨和生物素。對每個因素分別選取高、低水平，以膠原蛋白產(chǎn)量作為響應值，PB試驗設計如表1所示。用Design-Expert 8 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA)軟件對各因素效應分別進行檢驗，根據(jù)因素置信度高低，選取顯著因素作進一步考察。

表1 因素水平PB試驗設計對應細胞生長結(jié)果及各因素效應的統(tǒng)計分析

Note:2=95.33%;2(adj)=89.72%;aNon-significant at<0.05;bSignificant positive effect;cSignificant negative effect.

響應面法分析。重要參數(shù)確定后采用快速爬坡實驗進行三因素三水平實驗設計，每個因素分別設計因素水平中心點和最低、最高水平，細胞干重為響應值。因素與編碼水平如表2所示，根據(jù)Box-Behnken試驗設計及輸入變量預測二次方程。運用Design-Expert 8軟件響應面分析程序?qū)?7組試驗的響應值進行回歸分析，經(jīng)過回歸方程擬合，根據(jù)回歸方程的方差分析及模型可信度分析，以驗證模型的有效性。

1.3.5 畢赤酵母高密度發(fā)酵

在22 L發(fā)酵罐中對畢赤酵母進行大規(guī)模誘導表達，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，罐壓0.1 Mpa，溶氧維持在20%以上。當600為20左右時，發(fā)酵罐中接種2 L BMGY種子培養(yǎng)基。甘油間歇補料，開始補甘油 (含12 mL/L PTM1微量元素的50%甘油)，補料速度為每L初始發(fā)酵體積18 mL/h，溫度和pH分別維持在28.5 ℃和5；流加甘油階段，攪拌速度逐漸增加到900 r/min；培養(yǎng)液溶氧水平突然增加，表明培養(yǎng)基中的甘油消耗完全。以含12 mL/L PTM1微量元素溶液的純甲醇啟動誘導，采取60 s控制階段以維持30%左右的溶解氧水平。誘導維持約78 h，定時收集樣品以檢測培養(yǎng)上清液中的細胞生長 (600)和蛋白濃度。

表2 BBD試驗因素編碼水平、試驗設計和實驗結(jié)果

Note:1=(1?1.2)/0.1;2=(2?1.5)/0.2;3= (3?0.8)/0.1.

1.3.6 蛋白的分離純化

收集酵母發(fā)酵液，4 ℃、8 000 ×離心20 min，收集上清。乙醇沉淀，溶解、過濾、硫酸銨分級沉淀，收集沉淀蛋白并用磷酸緩沖液 (PBS) 溶解。經(jīng)超濾樣品用CM瓊脂F(xiàn)ast Flow柱層析，上樣，用0.01 mol/L PBS (pH 6.0) 平衡柱子，然后用0?1.0 mol/L的氯化鈉溶液梯度洗脫，收集蛋白峰。層析后的樣品負載于Sephadex G-100脫鹽，紫外檢測波長為215 nm，收集目的蛋白[17]。

1.3.7 類人膠原蛋白修復大鼠的乙酸性胃潰瘍

將20只雄性大鼠分2組，每組10只，分籠喂養(yǎng)，在實驗室條件下正常喂養(yǎng)2 d，使其能夠更好地適應環(huán)境；胃潰瘍模型建立前24 h禁食不禁水。如圖1所示，大鼠腹腔注射麻醉藥麻醉后，仰臥固定，上腹部皮膚正中切口，切開腹腔找到胃，于胃體與幽門部分界處血管最少的區(qū)域內(nèi)，用微量注射器在胃竇前壁注入50 μL 20%乙酸溶液達胃壁肌層與漿膜層之間，將大網(wǎng)膜組織與注射部位的漿膜組織縫合一針，關閉腹腔，縫合，術后單籠飼養(yǎng)，模型建立完成。模型建立后第3天開始，每日灌胃給藥1次 (模型組為生理鹽水，實驗組為類人膠原蛋白)，灌胃量0.8 mL/200 g，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 d后脫臼處死。打開大鼠腹壁并結(jié)扎賁門、幽門，向胃內(nèi)注入1%甲醛溶液10 mL，然后將胃浸泡于10%甲醛溶液中固定15 min。沿胃大彎剪開胃壁，生理鹽水沖洗。

圖1 大鼠胃粘膜修復實驗建模過程中大鼠仰臥固定 (A)，切開大鼠腹壁在腹腔找到胃 (B)

2 結(jié)果與分析

2.1 PB設計實驗篩選參數(shù)

復雜的營養(yǎng)成分為微生物生長和生產(chǎn)次級代謝物所必需，營養(yǎng)原料是控制該菌體生長合成的關鍵[18]。從發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)：酵母提取物、蛋白胨、甘油、酵母氮堿、硫酸銨和生物素中篩選出對膠原蛋白產(chǎn)量有顯著影響的濃度參數(shù)，通過PB設計實驗對這6個因素進行12組實驗，結(jié)果見表1。PB設計得到的細胞干重變化范圍在2.42–3.33 g/L之間。通過檢驗篩選有顯著影響的變量。<0.05說明該因素對響應有顯著影響。如表1所示，為0.002的蛋白胨確定為最重要影響因素，其次為酵母提取物(0.003) 和甘油(0.004)。因此，選取這3個因素作為顯著因素用于后續(xù)優(yōu)化研究。

2.2 Box-Behnken設計實驗

采用響應面分析法中的Box-Behnken設計法，進一步研究關鍵因素，對篩選的3因素取3個水平，Box-Behnken設計及其實驗結(jié)果如表2，預測值和實驗值接近，實驗細胞干重最低、最高值分別為1.75 g/L，4.83 g/L。對細胞干重進行二次回歸擬合，得到對蛋白胨(1)、酵母提取物(2) 和甘油(3) 帶交互項和平方項的三元二次方程：

DCW= 4.43 – 0.0771+ 0.0592+ 0.923– 0.331–0.602–1.133–0.5812–0.2613– 0.04423。

上述擬合模型的2=95.87%，調(diào)整后的2= 89.67%，這表明該擬合模型只有約10.33%的變量無法被其解釋，說明該模型擬合性良好?；貧w方程的方差分析結(jié)果見表3，可以看出，該擬合模型的失擬項=0.051>0.05，表明模型失擬不顯著，另外=0.000，失擬值=0.945也說明回歸顯著，曲面效應顯著。

表3 用于細胞干重優(yōu)化的擬合多項式回歸方程的方差分析

2.3 響應曲面分析

3D響應面和2D等高線圖是回歸方程的圖形表示[19]，如圖2A、B、C所示，通過響應面及等高線圖，更直觀地判斷各兩兩因素對因變量 (細胞生長量) 的影響，優(yōu)化濃度范圍。

圖2A為甘油濃度取中間水平時，酵母提取物與蛋白胨對畢赤酵母菌體生長量的影響。等高線圖相對橢圓的輪廓可知，在整個酵母提取物濃度范圍內(nèi)，隨蛋白胨含量的增加，細胞生長量不斷提高，但是蛋白胨濃度高于1.5% (零水平) 時，細胞生長量隨蛋白胨濃度的增加而逐漸降低。和Plackett-Burman的結(jié)果相符合，蛋白胨在酵母提取物和蛋白胨對畢赤酵母菌體生長量的影響中占主要地位。

圖2B為當?shù)鞍纂藶榱闼綍r，在整個酵母濃度范圍內(nèi)，甘油低于0水平 (濃度0.7%–0.8%) 時，畢赤酵母菌體產(chǎn)量的增加隨著二者含量的增加而不斷提高；而甘油濃度高于零水平 (0.8%–0.9%) 時，其生長量隨甘油含量的增加而逐漸降低。因此，甘油在蛋白胨和甘油對畢赤酵母菌體生長量的影響中占主要地位。

圖2 酵母提取物與蛋白胨 (A)、酵母提取物與甘油 (B)、蛋白胨與甘油 (C) 交互影響膠原蛋白產(chǎn)量的響應面和等高線圖

圖2C為以酵母提取物濃度取中間水平時，在整個蛋白胨濃度范圍內(nèi)，畢赤酵母菌體生長量隨著甘油和蛋白胨濃度的增加而提高，而當甘油濃度高于零水平 (0.8%–0.9%) 時，其生長量隨甘油含量的增加而逐漸降低。由此可見，甘油在蛋白胨和甘油對畢赤酵母菌體生長量的影響中占主要地位。

2.4 模型驗證實驗結(jié)果分析

對回歸方程中的各個變量求一階偏導數(shù)，求得1、2、3對應真實值分別為酵母提取物1.13%，蛋白胨1.61%，甘油0.86%，再將真實值代入方程式中，算出細胞干重最優(yōu)值為4.44 g/L。

重新活化菌種，經(jīng)種子液培養(yǎng)，然后接種到BMGY培養(yǎng)液中，保持其他條件相同，經(jīng)過12 h BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，收獲菌體進行測定，所得畢赤酵母干重平均值為4.41 g/L。相對于之前未優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的畢赤酵母干重值3.50 g/L，高出26%。因此該響應面法對培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果可靠，達到了較好的優(yōu)化效果。

2.5 高密度發(fā)酵工藝

表達系統(tǒng)成本低、表達量高、能對外源基因進行正確翻譯和修飾等優(yōu)勢；近來在發(fā)酵罐培養(yǎng)重組蛋白表達方面的優(yōu)勢日益顯現(xiàn)[20-21]。

根據(jù)響應面優(yōu)化工藝控制參數(shù)，菌體生長曲線和目的蛋白表達曲線如圖3所示。已知經(jīng)BMMY發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化，誘導期表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組人Ⅲ型膠原蛋白的量成功增加了19.3%[15]。甲醇流加方式對細胞代謝的影響表明，相較脈沖方式，間歇甲醇流加更有利于目的蛋白的生產(chǎn)[22]。我們采取兩段式補料，在甲醇誘導補料初期，細胞開始從以甘油生長狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐约状紴樘荚凑T導表達的生長狀態(tài)需要一定適應期，如圖3A所示，第27小時甲醇誘導補料時，菌體細胞生長極其緩慢，在甲醇誘導初期前3 h設定甲醇流加量為3.6 mL/(h?L)，經(jīng)過3?5 h適應期，菌體逐漸適應利用甲醇為碳源的環(huán)境，菌體密度開始逐漸增加，目的蛋白也開始誘導表達。當酵母菌體細胞完全適應甲醇的代謝后，菌體生長繁殖增快，根據(jù)溶氧變化逐漸加大甲醇補加速率。隨著酵母菌體細胞密度的增加，蛋白表達量也逐漸增加。在甲醇誘導33 h左右，菌體濃度600達到240。

圖3 高密度發(fā)酵菌體生長和目的蛋白表達曲線(A) 和發(fā)酵中不同時間點蛋白SDS-PAGE分析 (B)

分析不同時間點發(fā)酵液上清蛋白SDS-PAGE，結(jié)果見圖3B。目的蛋白表達量逐漸增加，同時蛋白降解。當酵母細胞培養(yǎng)到54 h時，即誘導27 h左右，菌體量、目的蛋白表達量趨于穩(wěn)定，繼續(xù)發(fā)酵目的蛋白增加量不多，因菌體密度過大自溶釋放胞內(nèi)酶，造成對目的蛋白的降解。因此，甲醇誘導第33小時時，停止發(fā)酵。經(jīng)蛋白濃度檢測，發(fā)酵培養(yǎng)到60 h時，目的蛋白表達量最高，可達4.71 g/L。

2.6 類人膠原蛋白促進胃粘膜修復的生物功效

類人膠原蛋白可通過影響細胞膜，增強細胞貼壁生長功能而促進細胞生長[19]，以前課題組的實驗結(jié)果顯示類人膠原蛋白具有促進上皮細胞、成纖維細胞生長的功效[23-24]，能促進潰瘍愈合。課題組研究的外用類人膠原蛋白口腔粘膜修復液治療潰瘍安全有效，能顯著縮短潰瘍愈合時間，已經(jīng)獲得國家醫(yī)療器械注冊許可進入市場。本研究旨在研究實驗室構建的系列類人膠原蛋白在粘膜修復方面其他的潛在用途，課題組以胃潰瘍作為粘膜修復模型，建立了乙酸致慢性胃潰瘍模型[25]。本文利用重組類人膠原[26]、Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈修復大鼠的乙酸性胃潰瘍，研究HLC對乙酸性胃潰瘍的修復作用。

在本次動物實驗中，動物潰瘍模型建立后，分別用類人膠原蛋白與重組的類人Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈進行修復對比，觀察不同的人源型膠原HLC對乙酸性胃潰瘍的修復效果。由圖4可以看出，給藥膠原蛋白實驗組的大鼠胃粘膜都有一定程度的修復。在給藥1周后，其中類人膠原蛋白的修復效果最佳，已基本修復為正常水平，胃內(nèi)粘膜光滑未見潰瘍斑點，類人膠原Ⅰ型和Ⅲ型膠原α1鏈相對于模型組也有比較好的修復效果，但修復效果弱于類人膠原蛋白，而胃潰瘍后單純補給生理鹽水的模型組的潰瘍部位不能隨著時間延長自行修復。實驗結(jié)果同時顯示，類人膠原蛋白治療乙酸損傷胃黏膜大鼠時未發(fā)現(xiàn)毒副作用，大鼠生長正常 (圖5)。類人膠原蛋白及其系列重組人源型Ⅰ型、Ⅲ型膠原α1鏈均可用于胃潰瘍粘膜的修復，其作用效果初步獲得實驗驗證。

圖4 模型組(A) 與實驗組類人膠原蛋白 (B)、Ⅰ型(C) 和Ⅲ型 (D) 大鼠胃部解剖圖

圖5 健康對照組、模型對照組與實驗組類人膠原蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型大鼠給藥治療前后體重變化

后續(xù)還需要進一步通過以下兩方面實驗驗證：1) 確定類人膠原蛋白對胃潰瘍作用的量效關系。研究不同劑量的膠原蛋白在修復胃潰瘍模型時對潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率及對病灶部位的修復程度進行組織學觀察；2) 研究類人膠原蛋白對乙酸性胃潰瘍黏膜的修復機制。測定胃組織堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、腫瘤壞死因子(TNF-β) 的水平等，為進一步開發(fā)功效性藥食兼用的粘膜修復藥物提供基礎數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

對表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組人Ⅲ型膠原蛋白的BMMY發(fā)酵培養(yǎng)基成分 (酵母提取物1.13%、蛋白胨1.61%、甘油 0.86%、硫酸銨0.8%、酵母氮堿0.3%和生物素4.5×10–5%) 進行優(yōu)化，使得重組人Ⅲ型膠原蛋產(chǎn)量成功增加了19.3%。采取甲醇間歇流加補料，在22 L自控發(fā)酵罐上進行類人膠原蛋白高密度發(fā)酵，產(chǎn)量達到4.71 g/L，對于后期工業(yè)發(fā)酵過程的工藝優(yōu)化和生產(chǎn)成本的縮減有重要意義。實驗結(jié)果同時顯示，類人膠原蛋白治療乙酸損傷胃黏膜大鼠時未發(fā)現(xiàn)毒副作用，大鼠生長正常。類人膠原蛋白及其系列重組人源型Ⅰ型、Ⅲ型膠原α1鏈均可用于胃潰瘍粘膜的修復，其作用效果初步獲得實驗驗證。

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(本文責編 陳宏宇)

Production ofgastric-mucosa protective collagen Ⅲ by

Weina Li1,2, Zifang Shang1,2, Zhiguang Duan1,2, Linbo Li1,2, Jing He1,2, and Daidi Fan1,2

1 Shaanxi Key Laboratory of Degradable Biomedical Materials, School of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi, China 2 Shaanxi R&D Center of Biomaterials and Fermentation Engineering, College of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, Shaanxi, China

To improve collagen production by recombinant, we applied Placket-Burman and Box-Behnken design to optimize the fermentation medium. Through Placket-Burman design, three variables in the medium (concentration of yeast extract, peptone and glycerol) were selected for having significant effect on cell dry weight. Through Box-Behnken design regression coefficients analysis, a secondary degree polynomial equation was established, and the optimum levels of the three variables were yeast extract 1.13%, peptone 1.61% and glycerol 0.86%. During the growth period, an average cell dry weight of 4.41 g/L was obtained after 12 h fermentation, increased by 26%. Through high density fermentation, the production of recombinant human collagen (Ⅲ) was up to 4.71 g/L in 22 L fermentor. The recombinant human collagen (Ⅲ) exhibited good results to repair acetic acid induced gastric ulcer in rats.

, human collagen (Ⅲ), response surface methodology, gastric tissue

Supported by:Educational Commission of Shaanxi Province of China (No. 16JS104), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2015M582698), Scientific Research Foundation in Northwest University (No. 338050025).

陜西省教育廳重點實驗室科研計劃項目(No. 16JS104)，博士后科學基金面上項目 (No. 2015M582698)，西北大學科研啟動金 (No. 338050025) 資助。

October 14, 2016; Accepted: December 22, 2016

Daidi Fan. Tel: +86-29-88303360; E-mail: fandaidi66@126.com

網(wǎng)絡出版時間：2017-01-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170109.1235.001.html