大蒜素通過抑制caspase-12減輕巨噬源性泡沫細胞凋亡*

康攀攀， 劉映雪， 郭甜甜， 張公安， 李東軒， 田 華， 周 健， 秦樹存△， 姚樹桐, △

(泰山醫(yī)學(xué)院 1動脈粥樣硬化研究所， 2人口與計劃生育學(xué)院， 3口腔醫(yī)學(xué)院，4生命科學(xué)學(xué)院， 5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000； 6承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

大蒜素通過抑制caspase-12減輕巨噬源性泡沫細胞凋亡*

康攀攀1, 6， 劉映雪2▲， 郭甜甜3， 張公安4， 李東軒5， 田 華1， 周 健6， 秦樹存1△， 姚樹桐1, 5△

(泰山醫(yī)學(xué)院1動脈粥樣硬化研究所，2人口與計劃生育學(xué)院，3口腔醫(yī)學(xué)院，4生命科學(xué)學(xué)院，5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000；6承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

目的研究大蒜素對巨噬源性泡沫細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路關(guān)鍵分子半胱天冬酶-12(caspase-12)的影響，并探討可能的分子機制。方法體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞，分別給予大蒜素(12.5、25和50 mg/L)和4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA；4 mmol/L)預(yù)處理1 h后，加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL； 100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM；4 mg/L)處理24 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞活力和凋亡情況；采用相應(yīng)的試劑盒測定細胞內(nèi)caspase-3和培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的活性；采用Western blot技術(shù)檢測caspase-12的表達變化；油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；酶比色法測定細胞內(nèi)總膽固醇含量。結(jié)果與ERS抑制劑PBA相似，大蒜素可減輕ox-LDL所致的巨噬細胞損傷，表現(xiàn)為細胞活力增加、LDH漏出減少、細胞凋亡率和caspase-3活性降低(P<0.05)；ERS誘導(dǎo)劑TM可導(dǎo)致巨噬細胞活力下降，LDH漏出增多及細胞凋亡率升高(P<0.05)，大蒜素可明顯阻斷TM的上述作用；大蒜素明顯抑制ox-LDL所致的caspase-12活化(P<0.05)；與TM組相比，大蒜素也可顯著抑制TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化(P<0.05)。另外，大蒜素還可顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積和泡沫細胞形成(P<0.05)。結(jié)論大蒜素可減少 ox-LDL 所致的巨噬源性泡沫細胞凋亡，其機制可能與抑制caspase-12活化有關(guān)。

大蒜素； 半胱天冬酶-12； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬細胞； 細胞凋亡

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，AS斑塊破裂是導(dǎo)致急性心血管事件如心源性猝死和急性心肌梗死的主要原因，而斑塊中巨噬源性泡沫細胞凋亡因可促進斑塊壞死核心增大、減少細胞外基質(zhì)的分泌而成為斑塊不穩(wěn)定性的重要因素[1]。研究表明，由半胱天冬酶(caspase)-12和C/EBP同源蛋白等分子介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑是介導(dǎo)巨噬細胞凋亡的重要機制，并與易損斑塊的形成有著密切關(guān)系，因此減輕巨噬細胞ERS凋亡途徑對增強粥樣斑塊穩(wěn)定性、降低急性心腦血管事件的發(fā)生率具有重要意義[2]。大蒜是中國等亞洲國家常見的藥食兩用食品，因其具有抗細菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)血糖和免疫功能等生物活性而備受世人青睞[3-4]。大蒜素(allicin)是從大蒜鱗莖中提取的一種具有揮發(fā)性的硫化物，為大蒜的主要功能成分之一。研究表明大蒜素可降低膽固醇[5]，并通過抑制氧化應(yīng)激減輕氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡[6]。本課題組既往研究證實，大蒜素可改善高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮細胞功能，減輕肝損傷，并與非諾貝特具有協(xié)同作用[7]。王喜歡等[8]在ApoE-/-小鼠AS模型中研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可顯著減少主動脈根部斑塊面積以及腹腔巨噬細胞泡沫化的形成。但是大蒜素是否可通過抑制caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡途徑減輕巨噬源性泡沫細胞凋亡，國內(nèi)外尚未見報道。本實驗分別在ox-LDL和ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞損傷模型上研究大蒜素對細胞凋亡和caspase-12活化的影響，以探討其對巨噬細胞的作用及機制。

材 料 和 方 法

1細胞和試劑

鼠源RAW264.7巨噬細胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司；大蒜素注射液和RIPA裂解液分別購自上海禾豐制藥有限公司和北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑藍 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-y-l)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT] 和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒分別購自Genview和南京凱基生物科技公司；兔抗caspase-12多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG分別購自Abcam和北京中杉金橋公司；caspase-3活性測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和組織/細胞總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒分別購自南京建成生物和北京普利萊公司；抗β-actin抗體、TM、ERS抑制劑4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)和油紅O染色試劑均購自Sigma；ECL增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒和PVDF膜分別購自Pierce和Millipore；其余試劑均為分析純。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)與實驗分組 巨噬細胞RAW264.7用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為研究大蒜素對ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細胞凋亡的作用，細胞隨機分為：(1)正常對照(control)組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)ox-LDL組：培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)不同濃度大蒜素預(yù)處理(allicin+ox-LDL)組：培養(yǎng)液中先加入大蒜素(12.5、25和50 mg/L)預(yù)處理1 h[9]，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)PBA預(yù)處理(PBA+ox-LDL)組：培養(yǎng)液中先加入4 mmol/L PBA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。上述各組細胞均于加入ox-LDL后24 h收集處理。另外，為了進一步驗證大蒜素與ERS的關(guān)系，我們設(shè)置了如下實驗，細胞隨機分為3組：(1)control組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)TM組：加入4 mg/L TM處理細胞24 h；(3)allicin+TM組：先給予50 mg/L大蒜素預(yù)處理1 h，再加入4 mg/L的TM處理24 h。

2.2細胞活力和LDH活性的測定 各組細胞接種于96孔板后每孔加入0.5 g/L的MTT，37 ℃避光培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，水平振蕩10 min，采用多功能酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度(A)值。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力以其A值占正常對照組A值的百分比表示。另外按照LDH活性檢測試劑盒說明書測定各組培養(yǎng)液中LDH活性以評價細胞膜損傷情況。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡 細胞經(jīng)處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液中，加入Annexin V-FITC和PI各5 μL室溫避光孵育15 min。細胞凋亡率采用流式細胞儀分析測定。細胞總凋亡率(%)= 早期凋亡率(Annexin V+/PI-)+ 晚期凋亡率(Annexin V+/PI+)。

2.4細胞內(nèi)caspase-3活性的測定 收集處理后的細胞用PBS洗滌1次，以裂解液裂解15 min，4 ℃ 16 000 ×g離心15 min，取上清液采用Bradford法測定蛋白濃度。在96孔板中將10 μL上清液、80 μL反應(yīng)緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃孵育2 h。在多功能酶標(biāo)儀405 nm處讀取A值，相同條件獲取標(biāo)準曲線并計算樣品caspase-3活性。以正常對照組caspase-3活性為100%，其余各組細胞caspase-3活性以其占正常對照組的百分比表示。

2.5Western blot分析 依據(jù)本課題組前期報道的方法[10]提取細胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉、洗滌后與caspase-12多克隆抗體(1∶800)4 ℃孵育過夜，以β-actin為內(nèi)參照。洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫孵育2 h?？乖?抗體復(fù)合物以增強化學(xué)發(fā)光法顯示，采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶累積吸光度(integrated absorbance，IA)值，以靶蛋白IA值與β-actinIA值的比值反映靶蛋白的相對水平。

2.6油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積 將細胞培養(yǎng)于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，經(jīng)PBS潤洗3次，4%甲醛溶液固定30 min，PBS潤洗后用油紅O染色液染色15 min，蒸餾水潤洗后蘇木素染色 2 min，水性封片劑封固。Olympus BX51顯微鏡觀察并采圖，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析實驗結(jié)果，細胞內(nèi)脂滴(油紅O陽性)含量以細胞平均IA值表示。

2.7細胞內(nèi)TC含量的測定 按照組織/細胞TC測定試劑盒說明書測定細胞內(nèi)TC含量，并以細胞中每克蛋白所含的TC量(μmol/g)表示。

3統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1大蒜素減輕ox-LDL或TM誘導(dǎo)的巨噬細胞損傷

分別以 12.5、25、50和100 mg/L大蒜素處理 RAW264.7巨噬細胞24 h，除100 mg/L大蒜素處理組細胞活力較正常對照組降低(P<0.05)外，其它各組細胞活力與正常對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，表明12.5～50 mg/L的大蒜素對細胞無明顯毒性作用，見圖1A。100 mg/L ox-LDL作用后，細胞活性明顯降低，大蒜素與PBA均可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細胞損傷，表現(xiàn)為細胞活力增加和LDH漏出減少(P<0.05)，見圖1B、C。

此外在ERS誘導(dǎo)劑TM造成的巨噬細胞損傷模型上也觀察到大蒜素的類似保護作用，表現(xiàn)為與TM組比較，allicin+TM組細胞活力增加和LDH漏出減少(P<0.05)，見圖1D、E。

2大蒜素抑制ox-LDL或TM誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡

與ox-LDL組比較，大蒜素預(yù)處理組的細胞凋亡率和caspase-3活性均明顯降低，尤以50 mg/L大蒜素預(yù)處理組最為顯著(P<0.01)，結(jié)果與PBA預(yù)處理組相似，見圖2A、B；另外，大蒜素也可使TM所致的細胞凋亡率降低32.3%(P<0.05)，見圖2C，提示大蒜素可能通過抑制ERS信號通路減輕巨噬細胞凋亡。

3大蒜素抑制ox-LDL或TM誘導(dǎo)的caspase-12活化

與ox-LDL處理組比較，25 mg/L和50 mg/L大蒜素預(yù)處理組cleaved caspase-12水平分別減少了37.6%和51.6%(P<0.05)，其對caspase-12活化的抑制作用與PBA相似；此外，大蒜素也可抑制TM所致的caspase-12活化(P<0.05)，見圖3。

4大蒜素抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細胞形成

油紅O染色和細胞內(nèi)TC測定結(jié)果均顯示，與正常對照組比較，ox-LDL 組巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著增加(P<0.01)，而大蒜素則明顯抑制 ox-LDL 所誘導(dǎo)的細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積(P<0.05)，提示大蒜素可抑制巨噬源性泡沫細胞形成，見圖4。

Figure 1. Allicin inhibited the cell injury and LDH leakage of RAW264.7 cells induced by ox-LDL or TM. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group;&P<0.05vsTM group.

圖1大蒜素抑制ox-LDL或TM所致的RAW264.7巨噬細胞損傷

討 論

巨噬細胞與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是晚期AS粥樣斑塊中巨噬源性泡沫細胞凋亡是造成粥樣斑塊破裂進而導(dǎo)致急性心腦血管事件的關(guān)鍵因素[1]。ox-LDL是導(dǎo)致巨噬源性泡沫細胞形成和凋亡的獨立危險因素，在 AS發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，因此減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細胞凋亡對于AS相關(guān)疾病的防治具有重要意義。一項隨機對照臨床試驗結(jié)果顯示，與安慰劑對照組比較，冠心病患者服用大蒜片劑3個月后頸動脈內(nèi)膜中層厚度增加速度明顯受到抑制[11]。作為大蒜中的主要功能成分，大蒜素對AS的防治作用及機制研究近年來國內(nèi)外有較多報道。大蒜素能有效降低老年高脂血癥患者血脂水平[12]，減輕血管內(nèi)皮細胞損傷[6-7, 9]，并減少ApoE-/-小鼠AS斑塊面積[8]。本實驗結(jié)果顯示，大蒜素明顯減輕ox-LDL所引起的巨噬細胞損傷，表現(xiàn)為細胞活力增加、LDH漏出減少、細胞凋亡率和caspase-3活性降低。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白合成、折疊的主要場所和調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)平衡的重要細胞器。缺氧、氧化應(yīng)激和膽固醇超負荷等因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，出現(xiàn)以未折疊/錯誤折疊蛋白聚集和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)。一定程度的ERS可通過暫時性抑制蛋白合成、上調(diào)分子伴侶表達和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，促進細胞生存。但是過強或長時間ERS則可誘發(fā)細胞凋亡，其中caspase-12是介導(dǎo)ERS相關(guān)凋亡途徑的重要分子之一[13]。在生理狀態(tài)下，caspase-12以酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè)，而在ERS時被特異激活，通過激活caspase-9和caspase-3而誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。有研究表明，ox-LDL可通過激活caspase-12誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡[15]。本課題組前期研究亦表明ox-LDL和晚期糖基化白蛋白通過激活caspase-12誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，而蜂膠醇提物和載脂蛋白A1模擬肽D4F則通過抑制該信號通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡[10, 16-17]。本實驗結(jié)果顯示，大蒜素減輕ox-LDL所致巨噬細胞損傷的作用與ERS抑制劑PBA相似，同時可減輕ERS誘導(dǎo)劑TM所誘導(dǎo)的細胞損傷。另外，大蒜素不僅可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化，還可以減輕TM所致的caspase-12活化，表明大蒜素可通過抑制caspase-12活化減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡。

Figure 2. Allicin inhibited RAW264.7 cell apoptosis induced by ox-LDL or TM. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group;&P<0.05vsTM group.

圖2大蒜素抑制ox-LDL或TM所致的RAW264.7巨噬細胞凋亡

Figure 3. Allicin inhibited caspase-12 activation in the RAW264.7 cells induced by ox-LDL or TM. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group;&P<0.05vsTM group.

圖3大蒜素抑制ox-LDL或TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化

細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積是導(dǎo)致巨噬細胞泡沫化和ERS凋亡途徑激活的重要因素[18-19]。本課題前期工作證實，ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，進而觸發(fā)ERS反應(yīng)，而D4F可抑制巨噬細胞泡沫化和ERS凋亡途徑介導(dǎo)的細胞凋亡[20-22]。文獻報道大蒜素可減少ApoE-/-小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化的形成[8]。本實驗結(jié)果顯示，大蒜素可抑制 ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，提示大蒜素對caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡途徑的抑制作用可能與減輕脂質(zhì)蓄積有關(guān)。

Figure 4. Allicin inhibited intracellular lipid accumulation in the RAW264.7 cells. A: intracellular lipid droplets (scale bar=20 μm); B: total cholesterol (TC) content. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖4大蒜素抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可減輕 ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細胞凋亡，其機制可能與抑制caspase-12活化有關(guān)。

[1] Gonzalez L, Trigatti BL. Macrophage apoptosis and necrotic core development in atherosclerosis: a rapidly advancing field with clinical relevance to imaging and therapy[J]. Can J Cardiol, 2017, 33(3):303-312.

[2] Scull CM, Tabas I. Mechanisms of ER stress-induced apoptosis in atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(12):2792-2797.

[3] Schwingshackl L, Missbach B, Hoffmann G. An umbrella review of garlic intake and risk of cardiovascular disease[J]. Phytomedicine, 2016, 23(11): 1127-1133.

[4] Majewski M. Allium sativum: facts and myths regarding human health[J]. Rocz Panstw Zakl Hig, 2014, 65(1):1-8.

[5] Lu Y, He Z, Shen X, et al. Cholesterol-lowering effect of allicin on hypercholesterolemic ICR mice[J]. Oxid Med Cell Longev, 2012, 2012: 489690.

[6] Chen X, Pang S, Lin J, et al. Allicin prevents oxidized low-density lipoprotein-induced endothelial cell injury by inhibiting apoptosis and oxidative stress pathway[J]. BMC Complement Altern Med, 2016, 16:133.

[7] Li W, Wang D, Song G, et al. The effect of combination therapy of allicin and fenofibrate on high fat diet-induced vascular endothelium dysfunction and liver damage in rats[J]. Lipids Health Dis, 2010, 9:131.

[8] 王喜歡， 張金華， 胡亞南， 等. 大蒜素對高脂飲食 ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的影響[J]. 中國動脈硬化雜志, 2017, 25(2):140-144.

[9] 萬 強， 楊玉萍， 劉中勇. 大蒜素對 PM2.5 損傷 EA.hy926內(nèi)皮細胞的保護作用及機制[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2016, 32(5):692-697.

[10] 李嚴嚴， 徐曉燕， 張家君， 等. 蜂膠醇提物通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(12): 2202-2208.

[11] Mahdavi-Roshan M, Zahedmehr A, Mohammad-Zadeh A, et al. Effect of garlic powder tablet on carotid intima-media thickness in patients with coronaryartery disease: a preliminary randomized controlled trial[J]. Nutr Health, 2013, 22(2):143-155.

[12] 王 瑞， 樊 潁， 肖林平， 等. 大蒜素對老年高脂血癥患者血脂及體質(zhì)量指數(shù)的影響[J]. 心臟雜志, 2016, 28(5):565-567.

[13] 姚樹桐， 秦樹存. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和防治中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):364-368.

[14] Morishima N, Nakanishi K, Takenouchi H, et al. An endoplasmic reticulum stress-specific caspase cascade in apoptosis. Cytochrome c-independent activation of caspase-9 by caspase-12[J]. J Biol Chem, 2002, 277(37): 34287-34294.

[15] Hong D, Bai YP, Gao HC, et al. Ox-LDL induces endothelial cell apoptosis via the LOX-1-dependent endoplasmic reticulum stress pathway[J]. Atherosclerosis, 2014, 235 (2):310-317.

[16] 李金國， 郝 奇， 劉映雪， 等. 晚期糖基化白蛋白通過激活caspase-12途徑誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡[J]. 生理學(xué)報, 2016, 68(6):733-739.

[17] 田 華， 李嚴嚴， 丁明德， 等. 載脂蛋白A-I模擬肽D4F通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2015，31(10):1750-1755.

[18] Devries-Seimon T, Li Y, Yao PM, et al. Cholesterol-induced macrophage apoptosis requires ER stress pathways and engagement of the type A scavenger receptor[J]. J Cell Biol, 2005, 171(1):61-73.

[19] Feng B, Yao PM, Li Y, et al. The endoplasmic reticulum is the site of cholesterol-induced cytotoxicity in macrophages[J]. Nat Cell Biol, 2003, 5(9):781-792.

[20] Yao S, Yang N, Song G, et al. Minimally modified low-density lipoprotein induces macrophage endoplasmic reti-culum stress via toll-like receptor 4[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1821(7): 954-963.

[21] Yao S, Zong C, Zhang Y, et al. Activating transcription factor 6 mediates oxidized LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in macrophages by up-regulating CHOP expression[J]. J Atheroscler Thromb, 2013, 20(1): 94-107.

[22] Yao S, Tian H, Miao C, et al. D4F alleviates macrophage-derived foam cell apoptosis by inhibiting CD36 expression and ER stress-CHOP pathway[J]. J Lipid Res, 2015, 56(4): 836-847.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Allicin attenuates macrophage-derived foam cell apoptosis by inhibiting caspase-12

KANG Pan-pan1, 6, LIU Ying-xue2, GUO Tian-tian3, ZHANG Gong-an4, LI Dong-xuan5, TIAN Hua1, ZHOU Jian6, QIN Shu-cun1, YAO Shu-tong1, 5

(1InstituteofAtheroscleroofsis,2CollegeofPopulationandFamilyPlanning，3SchoolofDentistryandOralHealth，4CollegeofLifeSciences，5CollegeofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China；6AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity，Chengde067000，China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;yst228@126.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of allicin on apoptosis and caspase-12 activation of macrophage-derived foam cells, and to elucidate the underlying molecular mechanisms.METHODSRAW264.7 macrophages were pretreated with allicin (12.5, 25 and 50 mg/L) or 4-phenylbutyric acid (PBA, 4 mmol/L) for 1 h and then treated with oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL, 100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were examined by MTT assay and flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, respectively. The activities of caspase-3 in the cells and lactic dehydrogenase (LDH) in the medium were measured. The protein levels of caspase-12 were determined by Western blot. The intracellular lipid accumulation was measured with oil red O staining and the content of intracellular total cholesterol was determined by enzymatic colorimetry.RESULTSSimilar to the endoplasmic reticulum stress (ERS) inhibitor PBA, allicin inhibited ox-LDL-induced injury of RAW264.7 macrophages in a concentration-dependent manner, as determined by the increased cell viability and the decreased LDH leakage, apoptosis and caspase-3 activity. The decrease in cell viability and increases in LDH leakage and apoptosis induced by TM (an ERS inducer) were also suppressed by allicin. Moreover, similar to PBA, allicin remarkably inhibited ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12. Furthermore, allicin remarkably attenuated ox-LDL-induced lipid accumulation in the RAW264.7 cells and foam cells formation in a concentration-dependent manner.CONCLUSIONAllicin may inhibit macrophage-derived foam cell apoptosis induced by ox-LDL, and the mechanism is partially related to suppressing the activation of caspase-12.

Allicin; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophages; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 1951- 07

2017- 04- 06

2017- 05- 10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81570410； No. 81370381)；泰山醫(yī)學(xué)院國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(No. 201510439099； No. 201510439126)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(No. 2013WS0319)

△通訊作者 秦樹存 Tel: 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com; 姚樹桐 Tel： 0538-6225010； E-mail: yst228@126.com

▲并列第1作者

R285.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.005