低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡通過提高ROS水平促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞自噬性死亡*

劉美快， 袁哲英， 黃凱西， 李 慧， 姜海丹， 陳 斌

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科， 浙江 溫州 325000)

低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡通過提高ROS水平促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞自噬性死亡*

劉美快， 袁哲英， 黃凱西， 李 慧， 姜海丹， 陳 斌△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科， 浙江 溫州 325000)

目的探討低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡造影劑對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞自噬性死亡的作用，并分析自噬的激活機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞活力的影響。方法采用頻率20 kHz、功率80 mW的低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡造影劑處理人甲狀腺癌TPC1細(xì)胞，處理細(xì)胞60、120和240 s后，采用Live/Dead 實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞死亡和活力；Western blot分析微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)、自噬相關(guān)蛋白5(autophagy-related protein 5，ATG5)和SQSTM1/P62的蛋白水平變化；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)染色、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3轉(zhuǎn)染和透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量；2′, 7′-二氯二氫熒光素二乙酸脂(DCFDA)染色分析細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平，用N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cys-teine，NAC)抑制氧化應(yīng)激水平，分析ROS在自噬激活中的作用；ATG5 siRNA轉(zhuǎn)染抑制自噬水平并分析自噬性死亡的作用。結(jié)果低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡顯著促進(jìn)TPC1細(xì)胞死亡，抑制TPC1細(xì)胞活力(P<0.05)，并與處理時(shí)間顯著相關(guān)。相對(duì)于單純低強(qiáng)度超聲組和微泡組，超聲聯(lián)合微泡顯著升高LC3-Ⅱ和ATG5蛋白水平，抑制P62蛋白水平(P<0.05)。MDC染色、GFP-LC3轉(zhuǎn)染和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，超聲聯(lián)合微泡明顯增加TPC1細(xì)胞中自噬體的數(shù)量。超聲聯(lián)合微泡與單純低強(qiáng)度超聲組和微泡組相比，提高了細(xì)胞的ROS水平，而NAC顯著降低超聲聯(lián)合微泡提高的LC3-Ⅱ蛋白水平(P<0.05)。ATG5 siRNA抑制自噬并顯著增加細(xì)胞活力(P<0.05)。結(jié)論本研究說明低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡可能通過提高甲狀腺癌細(xì)胞中的ROS水平促進(jìn)細(xì)胞的自噬性死亡，從而引起甲狀腺癌細(xì)胞死亡。

甲狀腺癌； 低強(qiáng)度超聲； 微泡； 自噬； 活性氧簇

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，近來其發(fā)病率快速上升，在中國(guó)城市居民所有的惡性腫瘤中排名第十[1]。雖然手術(shù)治療和放射性碘治療對(duì)大多數(shù)的甲狀腺癌具有較好的效果，但是不同的病理類型、晚期、放射性碘耐受及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其在臨床的處理上仍較為棘手[2-3]。近年來，低強(qiáng)度超聲(low-intensity ultrasound，LIUS)在腫瘤治療中逐漸得到應(yīng)用，相對(duì)于高強(qiáng)度超聲通過產(chǎn)生高熱量來直接或者間接破壞腫瘤組織，低強(qiáng)度超聲主要依靠直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡或提高化療藥物的抗腫瘤作用來治療腫瘤，而聯(lián)合微泡(microbubbles，MBs)往往可以促進(jìn)超聲的治療效果[4]。但是在甲狀腺癌細(xì)胞中，低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡的作用尚不明確。

既往研究顯示自噬(autophagy)是細(xì)胞在應(yīng)激時(shí)的自我保護(hù)機(jī)制，但是其同樣是一種與凋亡相似的程序性死亡方式，過度的自噬會(huì)引起細(xì)胞的自噬性死亡(autophagic cell death)[5]。甲狀腺癌細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)存在自噬性死亡，近來發(fā)現(xiàn)自噬是治療甲狀腺癌的潛在靶點(diǎn)之一。研究報(bào)道低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡可以促進(jìn)腫瘤的凋亡[3, 6]，但是對(duì)于自噬性死亡的作用尚不清楚。本文擬將低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡作用于人甲狀腺癌PTC1細(xì)胞，通過檢測(cè)細(xì)胞活力、自噬和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)等指標(biāo)來了解低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)PTC1細(xì)胞自噬性死亡的作用，以及自噬的激活機(jī)制及其在促進(jìn)PTC1細(xì)胞死亡中的作用。

材 料 和 方 法

1試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine se-rum，F(xiàn)BS)和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自HyClone； Live/Dead試劑盒購(gòu)自Invitrogen；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技公司；2’, 7’-二氯二氫熒光素二乙酸脂(2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFDA)染色試劑盒和總蛋白提取試劑購(gòu)自碧云天公司；抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associate protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)、自噬相關(guān)蛋白5(autophagy-related protein 5,ATG5)、P62和β-actin抗體均購(gòu)自CST；N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cys-teine，NAC)和單丹磺酰戊二胺(monodansylcadave-rine， MDC)熒光染料購(gòu)自Sigma；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3腺病毒購(gòu)自上海漢恒生物公司。

2方法

2.1PTC1細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 人甲狀腺癌TPC1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，置于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中 37 ℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 2～3 d換1次培養(yǎng)基，每2～3 d傳代1 次。

實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照(control)組、單純低強(qiáng)度超聲(LIUS)組、單純微泡(MBs)組和低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡(LIUS+MBs)組。上述處理后，細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行低強(qiáng)度超聲處理[3, 6]， 0.25%胰酶消化后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至平底的35 mm 培養(yǎng)皿 。在超聲探頭與培養(yǎng)皿管間涂有耦合劑，將探頭輻射面垂直向上放置于培養(yǎng)皿底部，80 mW、20 kHz低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡造影劑，作用于細(xì)胞達(dá)60、120和240 s。當(dāng)聯(lián)合微泡處理時(shí)， SonoVue超聲造影劑在DMEM培養(yǎng)基中稀釋成2×109MBs/L的終濃度。超聲處理后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2Live/Dead 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞死亡率 24孔板中每孔種植1×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過夜。用80 mW、20 kHz低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡造影劑處理60、120和240 s后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h， 吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次。稀釋Calcein-AM成4 μmol/L，稀釋PI成6 μmol/L，加入含有Calcein-AM和PI的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。激光共聚焦顯微鏡下選用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)觀察細(xì)胞的死亡率。每組重復(fù)觀察6個(gè)平行樣品。

2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 PTC1細(xì)胞經(jīng)過上述處理后，在96孔板每孔鋪5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，將處理的液體更換成100 μL新鮮的培養(yǎng)基，再在每個(gè)孔中加入10 μL的CCK-8反應(yīng)劑，37 ℃中孵育1 h，最后在酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)測(cè)量并讀取吸光度(A)，所得值為相對(duì)于對(duì)照組的數(shù)值。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 使用含有1%苯甲基磺酰氟 (phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法來測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后通過濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，使用抗LC3-Ⅱ、P62和ATG5的抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST清洗3遍后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗在常溫下孵育2 h，再使用ECL發(fā)光液在成像系統(tǒng)上進(jìn)行曝光。蛋白質(zhì)條帶的半定量分析使用AlphaEaseFC 4.0軟件進(jìn)行分析。

2.5MDC 染色 MDC用來標(biāo)記細(xì)胞中酸性自噬泡。PTC1細(xì)胞經(jīng)處理后， 用PBS清洗3遍， 0.05 mmol/L MDC加入細(xì)胞中，37 ℃孵育30 min。PBS清洗3遍，紫外激發(fā)光倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。為了觀察細(xì)胞的自噬率，上述染色后的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2.6GFP-LC3轉(zhuǎn)染 消化細(xì)胞后，將細(xì)胞密度調(diào)整至50%～70%，培養(yǎng)基液體量為2 mL。使用GFP-LC3腺病毒進(jìn)行感染，MOI值為100，腺病毒滴度為1×1013/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)，腺病毒使用1 mL的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，具體計(jì)算方式為，6孔板細(xì)胞數(shù)量為(1～2)×106，MOI值為100，病毒數(shù)量為2×108，加入的腺病毒劑量為20 μL。加入腺病毒前，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清的培養(yǎng)基1 mL，把上述劑量的腺病毒溶解在無(wú)血清的培養(yǎng)基中。加入腺病毒后，在37 ℃孵育2 h，將無(wú)血清的培養(yǎng)基更換成正常培養(yǎng)基，然后將PTC1細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱孵育過夜，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果和轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量占據(jù)大部分細(xì)胞的時(shí)候，再進(jìn)行處理。處理后在玻璃培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。GFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞率在200倍下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.7透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察 上述低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡處理后，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，再分別使用刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上刮下來，注意避免過分損傷細(xì)胞，防止細(xì)胞破碎。將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)移至EP管，加入2%戊二醛4 ℃固定過夜，PBS漂洗，使用1%鋨酸4 ℃固定2 h，醋酸鈾4 ℃染色，70%→80%→90%→100%丙酮梯度脫水，預(yù)包埋，Epon 812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞定位，LKB-V型超薄切片機(jī)超薄切片，透射電鏡下觀察PTC1細(xì)胞。

2.8DCFDA染色 用DCFDA染色分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平。PTC1細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃底的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞經(jīng)過處理后，將10 μmol/L的DCFDA染液加入到細(xì)胞中， 37 ℃中孵育20 min。0.25%胰酶蛋白消化細(xì)胞，于激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm下，流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度。

2.9ATG5siNRA的轉(zhuǎn)染ATG5 siRNA的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[19]，正義序列為5’-AAUUCGUCCAAACCACACAUCUCGA-3’，并由上海吉瑪公司合成。PTC1細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，在6孔板中每孔加入2×105的細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的處理方法進(jìn)行干預(yù)。以非特異性的非靶向的siRNA作為對(duì)照RNA。轉(zhuǎn)染后，提取細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染的效果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 15軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，不同組之間的差異使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)PTC1細(xì)胞死亡并抑制細(xì)胞活力

本研究首先使用Live/Dead和CCK-8實(shí)驗(yàn)分別分析低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)人甲狀腺癌PTC1細(xì)胞死亡和活力的影響。正常對(duì)照組和單純低強(qiáng)度超聲組中，以胞漿的綠色熒光(活細(xì)胞)為主，偶見胞核的紅色熒光(死細(xì)胞)。在低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡組中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胞核的紅色熒光逐漸增多，而胞漿的綠色熒光逐漸減少，見圖1A。Live/Dead半定量分析發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡處理120 s和240 s后，細(xì)胞死亡率相對(duì)對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，見圖1B。CCK-8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡處理后，細(xì)胞的活力顯著下降(P<0.05)，見圖1C。

2低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)PTC1細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)升高

Western blot方法進(jìn)一步分析低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)PTC1細(xì)胞自噬水平的影響，低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡作用PTC1細(xì)胞120 s，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分析自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、ATG5和P62的蛋白表達(dá)水平。單純微泡組與對(duì)照組相比，LC3-Ⅱ、ATG5和P62的蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡組相對(duì)單純低強(qiáng)度超聲組和對(duì)照組，LC3-Ⅱ和ATG5水平均顯著提高(P<0.05)，P62水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。這提示低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡在PTC1細(xì)胞中激活自噬。

Figure 1. The effect of the low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) on PTC1 cell death and viability. A: Live/Dead assay for PTC1 cells treated with LIUS combined with MBs for 60 s, 120 s and 240 s; B: semi-quantity analysis of cell death percentage; C: the cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)PTC1細(xì)胞死亡和活力的影響

Figure 2. The effect of the low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) on autophagy-related proteins in the PTC1 cells. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsLIUS+MBs group.

圖2低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)人甲狀腺癌PTC1細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白水平的影響

3低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)PTC1細(xì)胞中自噬體的增加

為進(jìn)一步證實(shí)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)自噬的激活作用，用MDC染色、GFP-LC3轉(zhuǎn)染和TEM觀察細(xì)胞中酸性自噬泡和自噬體的數(shù)量。與對(duì)照組相比，低強(qiáng)度超聲組細(xì)胞中綠色熒光斑點(diǎn)明顯增加，而低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡處理120 s后進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞中酸性的綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)量的增加；GFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡比單純超聲和微泡組顯著增加細(xì)胞中綠色的點(diǎn)狀LC3熒光；TEM觀察發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡組中雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體數(shù)量顯著增加，見圖3。上述3個(gè)實(shí)驗(yàn)說明低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)PTC1細(xì)胞中自噬體數(shù)量增加。

4PTC1細(xì)胞內(nèi)ROS水平在低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡激活自噬中的作用

DCFDA染色分析PTC1細(xì)胞內(nèi)ROS水平，來探索自噬激活的機(jī)制。低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡相對(duì)于對(duì)照組和單純超聲組，顯著增加細(xì)胞中ROS水平(P<0.01)，見圖4A。公認(rèn)的氧化應(yīng)激抑制劑NAC可以顯著地逆轉(zhuǎn)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡導(dǎo)致的LC3-Ⅱ蛋白質(zhì)水平升高(P<0.01)，說明低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡導(dǎo)致的ROS水平升高，可能是自噬激活的機(jī)制之一，見圖4B。

5低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡引起的自噬性死亡對(duì)人甲狀腺癌PTC1細(xì)胞死亡和活力的影響

用RNAi方法沉默ATG5抑制自噬水平，進(jìn)一步分析自噬在低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)PTC1細(xì)胞的作用。細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATG5 siRNA 48 h后， Western blot發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞比較，ATG5表達(dá)明顯下降(P<0.05)，證實(shí)ATG5沉默的成功，見圖5A。低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡作用120 s，相對(duì)于轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞，Western blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了ATG5 siRNA的細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)明顯下降，證實(shí)ATG5沉默降低了細(xì)胞中自噬水平(P<0.05)，見圖5B。Live/Dead實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自噬抑制后細(xì)胞死亡率比低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡組明顯下降(P<0.05)，CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制自噬水平可以部分逆轉(zhuǎn)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用(P<0.05)，上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡引起的自噬性死亡參與了PTC1細(xì)胞的死亡或活力的下降，見圖5C、D。

Figure 3. Low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) increased the number of autophagosome in PTC1 cells. Mean+SD.n=6.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsLIUS group.

圖3低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)人甲狀腺癌PTC1細(xì)胞自噬體的增加

討 論

通過化學(xué)、物理或生物方法抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖或促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的死亡被認(rèn)為是治療甲狀腺癌可行方法之一[2]，尤其是耐受手術(shù)和放射性碘治療的甲狀腺癌，通過低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡抑制PTC1細(xì)胞生長(zhǎng)或許是將來有希望的一種治療方式。

不同于高強(qiáng)度超聲，低強(qiáng)度超聲的生物學(xué)作用需要依靠機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)。直徑小于10 μm的微泡是常用的超聲造影劑[7]。在低強(qiáng)度超聲作用下，微泡發(fā)生擊破和塌陷，一方面可以導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激, 另一方面在微泡和低強(qiáng)度超聲的聯(lián)合作用下引起細(xì)胞內(nèi)骨架損傷和DNA鏈斷裂，最終引起腫瘤細(xì)胞的死亡，但是自噬性死亡在其引起的細(xì)胞死亡中的作用尚不清楚[3, 8]。本文首先通過Live/Dead和CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)與單純的低強(qiáng)度超聲處理相比，長(zhǎng)時(shí)間的低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡處理不僅促進(jìn)PTC1細(xì)胞的死亡，更可以抑制細(xì)胞活力的下降。

自噬與甲狀腺癌的治療密切相關(guān)，一系列研究發(fā)現(xiàn)自噬與放射性碘吸收和治療的敏感性相關(guān)。Lin等[9]發(fā)現(xiàn)自噬的抑制可以促進(jìn)PTC1細(xì)胞對(duì)放療和阿霉素治療的耐受，但是促進(jìn)自噬卻可以提高PTC1細(xì)胞的化療和放療敏感性[3, 10]。通過ATG7 siRNA抑制自噬可以促使PTC1細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)的耐受[10]。因此治療甲狀腺癌患者，尤其是那些對(duì)傳統(tǒng)治療方法耐受的患者，激活自噬引起自噬性死亡或許是一種潛在的有效方法。

本文通過Western blot發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡作用下PTC1細(xì)胞中ATG5、SQSTM1/P62和LC3-Ⅱ 蛋白水平升高，證實(shí)自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白的改變；進(jìn)一步通過MDC染色、GFPL-LC3轉(zhuǎn)染和TEM等方法觀察到細(xì)胞中自噬泡數(shù)量的顯著增加。LC3-Ⅱ是位于自噬體膜上的經(jīng)典標(biāo)志物；P62與自噬特異性降解蛋白結(jié)合而作為自噬降解過程的 “運(yùn)輸者”，P62蛋白水平與自噬水平相反，反映自噬流水平和細(xì)胞中蛋白聚體的積聚程度[11]；ATG5是自噬形成過程中的關(guān)鍵蛋白，是 RNAi沉默抑制自噬激活的常用靶點(diǎn)[12]。本文使用ATG5 siRNA抑制低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡作用后自噬激活，卻發(fā)現(xiàn)PTC1細(xì)胞的死亡反而減少而細(xì)胞活力卻上升，這證實(shí)了自噬性死亡在低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡促進(jìn)PTC1細(xì)胞死亡和抑制細(xì)胞活力中的作用，這與其它治療甲狀腺癌的研究結(jié)果相似[4]。

Figure 4. The involvement of ROS production in autophagy activation induced by low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) in PTC1 cells. A: DCFDA staining for the ROS production in the PTC1 cells; B: Western blot for determining LC3-Ⅱ level in the cells treated with LIUS combined with MBs andN-acetyl-L-cysteine (NAC). Mean±SD.n=6.##P<0.01vsLIUS+MBs group.

圖4PTC1細(xì)胞內(nèi)ROS水平在低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡激活自噬中的作用

單純低強(qiáng)度超聲與細(xì)胞內(nèi)ROS生成的關(guān)系具有一定的爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)1 MHz的單純低強(qiáng)度超聲可以抑制H2O2細(xì)胞內(nèi)ROS的生成[13]；Feril等[14]發(fā)現(xiàn)1 MHz的低強(qiáng)度超聲對(duì)人白血病細(xì)胞的ROS生成沒有影響；但是低強(qiáng)度超聲也可以促進(jìn)金絲桃素引起巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS的合成[15]。本文發(fā)現(xiàn)雖然單純低強(qiáng)度超聲對(duì)PTC1細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有影響，但是微泡結(jié)合低強(qiáng)度超聲卻可以顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。更重要的是，ROS被認(rèn)為是激活自噬的重要機(jī)制之一。芹黃素通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平激活甲狀腺癌細(xì)胞的自噬性死亡[16]。ROS促進(jìn)自噬的具體機(jī)制分為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)兩方面，涉及大量的分子機(jī)制，包括ROS-FOXO3-LC3/BNIP3-autophagy信號(hào)通路、ROS-NRF2-P62-autophagy信號(hào)通路和ROS-TIGAR-autophagy信號(hào)通路等[17]，而低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡促進(jìn)的ROS如何激活自噬性死亡需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡導(dǎo)致PTC1細(xì)胞死亡并抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡和細(xì)胞內(nèi)ROS合成增加。通過ROS抑制劑NAC證實(shí)ROS在自噬激活中的作用；通過ATG5沉默抑制自噬證實(shí)自噬性死亡在PTC1細(xì)胞死亡和細(xì)胞活力下降中的作用。因此低強(qiáng)度超聲結(jié)合微泡可能通過促進(jìn)ROS合成增加來激活自噬性死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

Figure 5. The involvement of autophagic cell death induced by low-intensity ultrasound (LIUS) combined with microbubbles (MBs) in the death and viability of the PTC1 cells. A: Western blot for determining ATG5 level in the PTC1 cells afterATG5 siRNA transfection; B: Western blot for determining LC3-Ⅱ level in the PTC1 cells afterATG5 siRNA transfection; C: the result of Live/Dead assay for the PTC1 cells after autophagic inhibition; D: the result of CCK-8 assay for detecting the cell viability after autophagic inhibition. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLIUS+MBs group.

圖5低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡引起的自噬性死亡對(duì)人甲狀腺癌PTC1細(xì)胞死亡和細(xì)胞活力的影響

[1] Chen W, Zheng R, Zhang S, et al. Report of incidence and mortality in China cancer registries, 2009[J]. Chin J Cancer Res, 2013, 32(3):106-112.

[2] Handkiewicz-Junak D, Czarniecka A, Jarzab B. Molecular prognostic markers in papillary and follicular thyroid can-cer: current status and future directions[J]. Mol Cell Endocrinol, 2010, 322(1-2):8-28.

[3] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature, 2008, 451(7182):1069-1075.

[4] Yu T, Wang Z, Mason TJ. A review of research into the uses of low level ultrasound in cancer therapy[J]. Ultrason Sonochem, 2004, 11(2):95-103.

[5] 杜海磊， 邱偉華， 楊衛(wèi)平. 細(xì)胞自噬與腫瘤[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(2):401-404.

[6] Li Y, Wang P, Chen X, et al. Activation of microbubbles by low-intensity pulsed ultrasound enhances the cytotoxicity of curcumin involving apoptosis induction and cell motility inhibition in human breast cancer MDA-MB-231 cells[J]. Ultrason Sonochem, 2016, 33:26-36.

[7] Qiu Y, Zhang C, Tu J, et al. Microbubble-induced sonoporation involved in ultrasound-mediated DNA transfection in vitro at low acoustic pressures[J]. J Biomech, 2012, 45(8):1339-1345.

[8] Gong Y, Wang Z, Dong G, et al. Low-intensity focused ultrasound mediated localized drug delivery for liver tumors in rabbits[J]. Drug Deliv, 2016, 23(7):2280-2289.

[9] Lin CI, Whang EE, Abramson MA, et al. Autophagy: a new target for advanced papillary thyroid cancer therapy[J]. Surgery, 2009, 146(6):1208-1214.

[10] Lin CI, Whang EE, Donner DB, et al. Autophagy induction with RAD001 enhances chemosensitivity and radiosensitivity through Met inhibition in papillary thyroid cancer[J]. Mol Cancer Res, 2010, 8(9):1217-1226.

[11] Yoshida GJ. Therapeutic strategies of drug repositioning targeting autophagy to induce cancer cell death: from pathophysiology to treatment [J]. J Hematol Oncol, 2017, 10(1):67.

[12] Jiang LB, Cao L, Yin XF, et al. Activation of autophagy via Ca2+-dependent AMPK/mTOR pathway in rat notochordal cells is a cellular adaptation under hyperosmotic stress[J]. Cell Cycle, 2015, 14(6):867-879.

[13] Kim NK, Kim CY, Choi MJ, et al. Effects of low-intensity ultrasound on oxidative damage in retinal pigment epithelial cellsinvitro[J]. Ultrasound Med Biol, 2015, 41(5):1363-1371.

[14] Feril LB Jr, Kondo T, Cui ZG, et al. Apoptosis induced by the sonomechanical effects of low intensity pulsed ultrasound in a human leukemia cell line[J]. Cancer Lett, 2005, 221(2):145-152.

[15] Li X, Gao L, Zheng L, et al. The efficacy and mechanism of apoptosis induction by hypericin-mediated sonodynamic therapy in THP-1 macrophages[J]. Int J Nanomed, 2015, 10:821-838.

[16] Zhang L, Cheng X, Gao Y, et al. Apigenin induces autophagic cell death in human papillary thyroid carcinoma BCPAP cells[J]. Food Funct, 2015, 6(11):3464-3472.

[17] Li L, Tan J, Miao Y, et al. ROS and autophagy: interactions and molecular regulatory mechanisms[J]. Cell Mol Neurobiol, 2015, 35(5):615-621.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Low-intensity ultrasound combined with microbubbles activates auto-phagic death of thyroid cancer cells by promoting ROS production

LIU Mei-kuai, YUAN Zhe-ying, HUANG Kai-xi, LI Hui, JIANG Hai-dan, CHEN Bin

(DepartmentofUltrasound，TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:doctorchbe@126.com)

AIM: To investigate the effect of low-intensity ultrasound combined with microbubble contrast agent on autophagic death of thyroid cancer cells, and to analyze the mechanism of autophagy activation and its effect on cell viability.METHODSHuman thyroid cancer cell line TPC1 was treated with low-intensity ultrasound at 20 kHz frequency and 80 mW intensity combined with microbubbles. The cell death and viability were analyzed by Live/Dead assay and CCK-8 assay 60, 120 and 240 s after the treatment. The protein levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ (LC3-Ⅱ), autophagy-related protein 5 (ATG5) and SQSTM1/P62 were determined by Western blot. The number of intracellular autophagosomes was measured by the methods of monodansylcadaverine (MDC) staining, green fluorescent protein (GFP)-LC3 transfection and transmission electron microscopy. The level of reactive oxygen species (ROS) was mea-sured and the effect of ROS on autophagy activation was evaluated byN-acetyl-L-cysteine (NAC) treatment. The effect ofATG5 siRNA transfection on autophagy was analyzed for determining the role of autophagic death.RESULTSLow-intensity ultrasound combined with microbubbles significantly promoted TPC1 cell death and inhibited TPC1 cell viability (P<0.05) in a time-dependent manner. Compared with low-intensity ultrasound group and microbubble group, ultrasound combined with microbubbles significantly increased the protein levels of LC3-Ⅱ and ATG5, but inhibited the protein level of P62 (P<0.05). The results of MDC staining, GFP-LC3 transfection and transmission electron microscopy showed that ultrasound combined with microbubbles significantly increased the number of autophagosomes in the TPC1 cells. Compared with low-intensity ultrasound group and microbubble group, ultrasound combined with microbubbles increased the level of ROS, while NAC significantly reduced the protein level of LC3-Ⅱ (P<0.05). Thansfection withATG5 siRNA inhibited the autophagy, significantly decreased the percentage of cell death and increased cell viability (P<0.05).CONCLUSIONLow-intensity ultrasound combined with microbubbles promotes the autophagic cell death by increasing the level of ROS in thyroid cancer cells, leading to death of thyroid cancer cells.

Thyroid cancer; Low-intensity ultrasound； Microbubbles; Autophagy; Reactive oxygen species

1000- 4718(2017)11- 2000- 09

2017- 05- 12

2017- 09- 01

溫州市科技計(jì)劃(No. Y20170217)

△通訊作者 Tel: 0577-88069567； E-mail: doctorchbe@126.com

R736.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.013