臭豆腐鹵水凍干前后揮發(fā)性成分的比較研究

石 聰，賀 靜，蔣立文*，李 跑

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

臭豆腐鹵水凍干前后揮發(fā)性成分的比較研究

石 聰1，2，賀 靜1，2，蔣立文1，2*，李 跑1，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

為研究長沙具有地方代表性的3種臭豆腐鹵水真空冷凍干燥前后揮發(fā)性成分的差異，在發(fā)酵成熟的鹵水中加入一定數(shù)量保護(hù)劑后進(jìn)行真空冷凍干燥，檢測臭豆腐鹵水凍干前后微生物總數(shù)的變化并利用固相微萃取（SPME）結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對3種臭豆腐鹵水及其凍干粉復(fù)水后揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，3種鹵水凍干前后揮發(fā)性成分分別為43、47，49、53，31、40種，均集中了大量揮發(fā)性成分的主要組分，3種凍干粉復(fù)水后能快速啟動發(fā)酵，培養(yǎng)12 h基本達(dá)到南方臭豆腐鹵水的發(fā)酵效果，為鹵水標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了可能。

臭豆腐；鹵水；凍干粉；揮發(fā)性成分

臭豆腐是我國南方備受人們喜愛的地方特色小吃之一，具有濃郁的地域特色。它是將白豆腐通過鹵水浸泡著色油炸后直接蘸食。因此臭豆腐鹵水的制作是南方臭豆腐風(fēng)味形成的關(guān)鍵工藝。制作鹵水的原料一般包括莧菜梗、竹筍、豆豉、香菇等植物性原料，需要在自然條件下經(jīng)過長時間堆積自然發(fā)酵后才能形成具有特殊“臭味”，這個過程是微生物、原料內(nèi)源酶等多重因子作用的結(jié)果[1-3]。因此鹵水制作是一個復(fù)雜的發(fā)酵過程，一般難以復(fù)制，不便于工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)化。

近年來，對臭豆腐中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究越來越多，亓順平等[4-7]就臭豆腐鹵水研究了其揮發(fā)性風(fēng)味成分，基本上確定了臭豆腐中具有“臭”味的主要揮發(fā)性物質(zhì)為苯酚、吲哚之類的物質(zhì)。鹵水為液態(tài)物質(zhì)，借鑒乳酸菌直投式發(fā)酵劑（direct vat set，DVS）大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)技術(shù)和原理，考慮將含有大量活菌的鹵水進(jìn)行濃縮探討制作發(fā)酵劑的可能性。將其采用真空冷凍干燥方法制作凍干粉，有利于鹵水更好的貯存、運(yùn)輸與銷售，加快臭豆腐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對臭豆腐鹵水制成凍干粉及其前后風(fēng)味差異的研究較為鮮見。

本試驗(yàn)采用真空冷凍干燥的方法將幾種鹵水制成凍干粉，再使用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）法測定鹵水制成凍干粉復(fù)水后的揮發(fā)性成分[8]，探究臭豆腐鹵水凍干前后微生物總數(shù)的變化、鹵水制成凍干粉復(fù)水后揮發(fā)性成分的變化趨勢及核心氣味物質(zhì)的變化，以期為臭豆腐工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1#臭豆腐鹵水：來源于企業(yè)用于生產(chǎn)的老鹵水；2#臭豆腐鹵水、3#臭豆腐鹵水：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室自制；脫脂乳粉：河南明瑞食品添加劑有限公司；麥芽糊精、谷氨酸鈉、甘油（均為食品級）：德國三顆星食品物料公司。豆腐黃漿水：購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)濱湖農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

PL4002分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；GC-MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；固相微萃?。⊿PME）裝置：美國Supelco公司；TALBOYS磁力攪拌器：天津賽力斯自動化科技有限公司；DW-HL828超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥箱：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鹵水的來源及制作

鹵水1#：來源于生產(chǎn)企業(yè)的老鹵水；

鹵水2#：原料為香菇1.3 kg、瀏陽豆豉0.45 kg、豆腐0.2 kg、豆腐黃漿水0.45 kg、春筍0.3 kg、青菜0.5 kg、涼開水2 kg，另加入0.52 kg鹵水1#，按配比洗凈、瀝干、切碎、煮透和冷卻后放入缸中，室溫條件下自然發(fā)酵11個月；

鹵水3#：除不加入鹵水1#，其他配方與鹵水2#一致，室溫條件下自然發(fā)酵11個月。

1.3.2 鹵水凍干粉制作的工藝流程

鹵水的預(yù)處理：取發(fā)酵成熟的鹵水上清液100 g→加入穩(wěn)定保護(hù)劑：脫脂奶粉（10 g）、麥芽糊精（10 g）、谷氨酸鈉（10 g）、甘油（3 g）[9-10]→分裝：傾注到平皿3/4，保鮮膜封口，用注射器扎數(shù)個孔→預(yù)冷凍處理：-80℃急速冷凍3～4 h→真空冷凍干燥：冷凍干燥（-40 ℃）36 h，得到樣品，3個樣品標(biāo)號為凍干1#、凍干2#、凍干3#

1.3.3 方法

（1）揮發(fā)性成分的檢測

固相微萃?。喝?mL鹵水或用黃漿水復(fù)水后的凍干粉樣品，加入10 mL的頂空進(jìn)樣瓶中，蓋上密封墊和鋁帽，密封后于磁力攪拌器上，60℃加熱的條件下平衡20 min，然后通過隔墊插入已活化好的SPME萃取頭，推出纖維頭，纖維頭距樣品液面約10 mm，頂空吸附30 min后，插入氣相色譜進(jìn)樣口解吸，時間為5 min。

萃取頭的老化：萃取頭在使用前，必須進(jìn)行老化。將85 μm（PA SPME）萃取頭于280 ℃老化0.5 h，直至無干擾峰出現(xiàn)。

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm）；載氣：氦氣（He）；柱流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：240℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度50℃，保留2min；然后以5℃/min的速度升溫至200℃，保留14min；再以15℃/min的速度升溫至240℃，無保留。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為200℃，電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，燈絲電流為150 μA，電子能量為70 eV，掃描質(zhì)量范圍為45～500 m/z。

定性定量分析：總離子流色譜圖經(jīng)美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014S標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性鑒定出揮發(fā)性成分，采用面積歸一法進(jìn)行定量分析，得到各成分在臭豆腐鹵水揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的相對含量

（2）凍干前后微生物總數(shù)的比較

采用國標(biāo)GB 4789.2—2010《菌落總數(shù)測定》中的方法測定3種鹵水凍干前后微生物總數(shù)的變化，3個重復(fù)。

（3）凍干后復(fù)水發(fā)酵試驗(yàn)

將凍干后獲得的鹵水粉劑10 g加入1 000 mL豆腐黃漿水中進(jìn)行發(fā)酵，控制溫度30℃，時間12 h，然后按照臭豆腐制作流程浸泡豆腐并油炸試味，比較前后的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干前后微生物總數(shù)的比較

鹵水樣品凍干前后細(xì)菌總數(shù)的變化結(jié)果見表1。

表1 凍干前后微生物總數(shù)的變化Table 1 Change of total microbial before and after lyophilization

由表1可知，3種鹵水凍干前后微生物數(shù)均在1012個/mL（g）以上，凍干后微生物數(shù)量有所減少，這可能是因?yàn)椴糠治⑸镌趦龈蛇^程中受環(huán)境影響而死亡，但凍干過程對鹵水中微生物數(shù)量影響不大，基本滿足南方臭豆腐生產(chǎn)要求。

2.2 三種臭豆腐鹵水及凍干粉的揮發(fā)性成分GC-MS分析

鹵水1#、鹵水2#、鹵水3#及制成凍干粉復(fù)水揮發(fā)性成分的GC-MS分析總離子流色譜圖結(jié)果見圖1。

圖1 三種鹵水及其凍干粉揮發(fā)性成分的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in three kinds of the ripening brine and lyophilized powder analysis by GC-MS

對GC-MS分析檢測的成分進(jìn)行譜庫檢索和其他方法核對及確認(rèn)，3種鹵水及制成凍干粉中揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果見表2。

表2 3種臭豆腐鹵水及其凍干粉中揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量Table 2 Relative contents of volatile components in three kinds of ripening brine and lyophilized powder

2.3 氣味物質(zhì)組分分類分析

3種鹵水及其凍干粉復(fù)水后各大類物質(zhì)相對含量的比較結(jié)果見圖2，3種鹵水及其凍干粉中相同物質(zhì)含量的比較結(jié)果見圖3。

圖2 3種鹵水及其凍干粉復(fù)水后各大類物質(zhì)相對含量的比較Fig.2 Comparison of relative contents of volatile components in three kinds of ripening brine and lyophilized powder after rehydration

圖3 3種鹵水及其凍干粉中相同物質(zhì)相對含量的比較Fig.3 Comparison of the relative contents of the same substances in the three kinds of ripening brine and lyophilized powders

2.3.1 酚類

酚類化合物都具有特殊的芳香氣味，易被氧化。由圖2可知，本研究檢測到3種鹵水和相應(yīng)的凍干粉揮發(fā)性成分中酚類物質(zhì)種類分別為7、5、3、3、5、4種。但含量均較高，分別為36.27%、28.78%、18.91%、27.34%、31.97%、79.38%。由圖3可知，苯酚和4-甲基苯酚是3種鹵水和凍干粉復(fù)水后均存在的物質(zhì)，且4-甲基苯酚含量較高，分別達(dá)到25.06%、24.94%、16.79%、26.94%、28.09%、78.64%，4-甲基苯酚具有窖泥臭[11]，被認(rèn)為是鹵水的主體物質(zhì)。對比凍干粉制作前后，鹵水1#在制成凍干粉后酚類物質(zhì)略微下降，但差異不大，鹵水2#和凍干3#中酚類物質(zhì)含量均明顯高于鹵水中酚類物質(zhì)。鹵水3#凍干粉中4-甲基苯酚含量較高，這可能是凍干過程集中了大部分的鹵水中的物質(zhì)，且在凍干過程其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了該物質(zhì)所致。酚類化合物對臭豆腐香氣起增強(qiáng)作用，對產(chǎn)品的穩(wěn)定性起到一定作用[12]。表明凍干過程對臭豆腐品質(zhì)有積極作用。

2.3.2 吲哚類

由圖2、圖3可知，本研究檢測到吲哚、3-甲基吲哚是鹵水和凍干粉復(fù)水后均存在的物質(zhì)，且含量較高，3種鹵水和相應(yīng)的凍干粉中3-甲基吲哚含量分別為47.06%、32.04%、0.17%、0.05%，28.54%、13.62%，3-甲基吲哚有腐爛的、令人作嘔的臭氣、衛(wèi)生球以及大糞臭，但極度稀釋后有成熟的水果的香味[13-14]，對臭豆腐的臭香味起到重要作用，3-甲基吲哚在鹵水和凍干粉中含量相差不大，在鹵水2#中含量較低，這可能與鹵水2#發(fā)酵程度有關(guān)，鹵水2#在自然發(fā)酵11個月的條件下可能沒有發(fā)酵完全，因此含量較低。且3-甲基吲哚被認(rèn)為是臭豆腐鹵水的核心物質(zhì)之一[15]，研究表明鹵水在制成凍干粉前后吲哚類物質(zhì)含量相差不大。

2.3.3 酸類

由圖2、圖3可知，3種鹵水含酸類物質(zhì)的種類較為豐富，占總含量的2.20%～51.18%。乙酸和丙酸是3種鹵水和凍干粉復(fù)水后均檢測到的物質(zhì)，丙酸是由糖類發(fā)酵而來，結(jié)合文獻(xiàn)報道莧菜在發(fā)酵過程中含酸類物質(zhì)較多[16]，發(fā)酵酸筍中乙酸含量較高[17]。由表2可知，在制成凍干粉復(fù)水后酸類物質(zhì)的變化比較顯著，鹵水1#在制成凍干粉后酸類物質(zhì)的總量是增加的，鹵水2#和3#在制成凍干粉后含量下降，凍干過程對酸類物質(zhì)影響較大。研究表明，酸類物質(zhì)雖然在氣味上帶來不愉快的氣味，但對臭豆腐的氣味不會產(chǎn)生消極的影響[15]，因此凍干過程雖然對酸類物質(zhì)有一定影響，但不會對臭豆腐風(fēng)味造成不利影響。

2.3.4 醇類

由表2可知，3種鹵水凍干粉復(fù)水后的揮發(fā)性成分中醇類物質(zhì)分別占總量的1.00%、9.42%、23.53%、30.62%、0.34%、3.69%。研究表明，鹵水的醇類物質(zhì)的含量與發(fā)酵程度有關(guān)，發(fā)酵初期的醇類物質(zhì)比較少，發(fā)酵程度越高，醇類物質(zhì)含量更高[18]。原料中瀏陽豆豉和香菇中酯類物質(zhì)的含量較高[19-20]。鹵水中醇類物質(zhì)主要來源于原料發(fā)酵，并最終構(gòu)成成品鹵水揮發(fā)組分中的主體物質(zhì)，三種鹵水凍干粉中醇類物質(zhì)含量明顯高于鹵水中的醇類物質(zhì)，鹵水在制成凍干粉后酯類物質(zhì)呈上升趨勢，凍干粉對臭豆腐的風(fēng)味具有促進(jìn)作用。

2.3.5 其他類

本研究檢測到3種鹵水和凍干粉復(fù)水后揮發(fā)性成分中酯類物質(zhì)含量在0.16%～3.50%。鹵水的制作原料中瀏陽豆豉含酯類比較豐富，鹵水中酯類物質(zhì)在發(fā)酵初期數(shù)量較多，但總量較少，對比3種鹵水和凍干粉酯類物質(zhì)占總量的含量，無顯著性差異。由圖2、圖3可知，凍干過程對鹵水中酯類物質(zhì)影響不大，3種鹵水和相應(yīng)的凍干粉揮發(fā)性成分中酮類物質(zhì)含量在0.43%～2.87%，結(jié)合文獻(xiàn)報道，鹵水的制作原料瀏陽豆豉不含有酮類物質(zhì)[18]，香菇和莧菜在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生較多的酮類物質(zhì)[16，20]，因此這3種鹵水含酮類物質(zhì)較少可能與鹵水的發(fā)酵程度和原料的種類有關(guān)，且鹵水在制成凍干粉后其含量變化不顯著。3種鹵水及其凍干粉復(fù)水后的揮發(fā)性成分含硫醚類物質(zhì)0.06%～0.56%，硫醚類化合物香氣閾值極低，一般表現(xiàn)為令人不愉快的氣味[17，19]，氣味持久難消，因此凍干粉中硫醚類化合物含量的降低對于臭豆腐的香氣成分具有促進(jìn)作用。鹵水1#凍干粉和鹵水3#中檢出醛類物質(zhì)為0.02%、0.10%，其他樣品中均未檢出。這與鹵水制作的原料有很大關(guān)系，通過對比相關(guān)原料可知，瀏陽豆豉和香菇中含醛類物質(zhì)均較少[19-20]。鹵水在制成凍干粉前后在含醛類物質(zhì)上差異不大。僅鹵水1號含烷烴類物質(zhì)，占總含量的1.55%，其他鹵水和凍干粉中均不含烷烴類物質(zhì)，這可能與發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系，鹵水在發(fā)酵初期含烷烴類物質(zhì)較少，在發(fā)酵兩年以上才會含有比較多的烷烴類物質(zhì)[18]。凍干粉的制作對于鹵水中烷烴類物質(zhì)影響不大。

2.4 快速發(fā)酵后的前后比較

3種鹵水凍干粉采用豆腐黃漿水于30℃復(fù)水發(fā)酵12 h后，浸泡臭豆腐并油炸，參照商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10527—2009《臭豆腐（臭干）》中臭豆腐的試味要求，樣品具有臭豆腐應(yīng)有的風(fēng)味，樣品前后差別不大，基本達(dá)到南方臭豆腐鹵水的發(fā)酵效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用GC-MS法對臭豆腐鹵水及凍干粉復(fù)水后進(jìn)行萃取，3種鹵水凍干前后揮發(fā)性成分總數(shù)分別為：43、47；49、53；31、40。凍干前后相同的揮發(fā)性組分相對含量分別為84%、72%；96%、96%；70%、95%。3種鹵水和凍干粉中共同存在揮發(fā)性物質(zhì)有6種，相對含量在32%～95%。對比鹵水凍干前后揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量差異不大。

3種鹵水和凍干復(fù)水后的主體揮發(fā)性成分差異不大，凍干后均集中了大量揮發(fā)性成分的主要組分，對鹵水氣味的核心物質(zhì)影響不大，鹵水凍干粉時宜選擇合適的鹵水原料配方以及發(fā)酵比較成熟的鹵水進(jìn)行制作，使臭豆腐鹵水更具風(fēng)味，以加速臭豆腐工業(yè)化的應(yīng)用。

快速發(fā)酵證明方法具有一定的可行性，下一步的研究應(yīng)該將臭豆腐鹵水制作中關(guān)鍵微生物如乳酸菌、酵母菌，采用多菌種混合發(fā)酵方法進(jìn)行制備，優(yōu)化凍干保護(hù)劑，然后制取凍干粉，為可能的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化安全化奠定基礎(chǔ)。

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Comparative study on the volatile components in the ripening brine for fermented stinky tofu before and after lyophilization

SHI Cong1,2,HE Jing1,2,JIANG Liwen1,2*,LI Pao1,2
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

In order to study the difference of volatile components in three kinds of the ripening brines for fermented stinky tofu before and after vacuum freeze-drying in Changsha,the ripening brines were vacuum-freeze dried with addition of a certain amount of protective agent.Microbial changes were detected in the brines before and after lyophilization.The volatile components of three kinds of the ripening brines and the freeze-dried powder were analyzed with SPME and GC-MS.The results showed that the volatile components before and after lyophilization were 43,47;49,53;31,40 species,respectively.All of them were concentrated in the main components of volatile components.The fermentation can start rapidly with addition of rehydrated lyophilized powder,and the fermentation performance basically met the requirement for the ripening brine with cultivation 12 h,which provided a possibility for standardized production.

fermented stinky tofu;brine;lyophilized powder;volatile components

TS214.2

0254-5071（2017）10-0154-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.032

2017-06-27

國家自然科學(xué)基金項目（31571819）

石 聰（1994-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ獭?/p>

*通訊作者：蔣立文（1968-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。