轉(zhuǎn)色期間釀酒葡萄中花色苷的監(jiān)測及變化研究

閆衡++高娟

葡萄酒的色度是評價葡萄酒外觀質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，其色度的高低與葡萄酒中花色苷的種類與含量有著密切聯(lián)系。葡萄酒中花色苷來源于釀酒葡萄，因而葡萄酒的色度很大程度上取決于釀酒葡萄中花色苷的積累。

花色苷是葡萄與葡萄酒中重要的多酚類物質(zhì)，屬于水溶性植物色素，在葡萄轉(zhuǎn)色期期間于葡萄漿果的表皮細(xì)胞組織中合成，在液泡中積累，少數(shù)存紅葡萄的果肉細(xì)胞及葡萄籽中。最初合成的是花青素和花翠素的葡萄糖苷，然后轉(zhuǎn)變成其他類型的花色苷。不同種或品種葡萄都具有自己獨(dú)特的花色苷類型，其總量及組成比例對葡萄和葡萄酒的顏色至關(guān)重要。對釀酒葡萄中花色苷合成研究對夠提高葡萄及葡萄酒的感官品質(zhì)有著重要意義。

目前，國內(nèi)外對花色苷的研究主要集中在對葡萄及葡萄酒中花色苷種類的定性及其穩(wěn)定性方面，部分研究涉及到了花色苷功能活性。但針對葡萄在轉(zhuǎn)色過程中花色苷種類及含量的變化的監(jiān)測研究較少出現(xiàn)。

國內(nèi)外對于花色苷的檢測標(biāo)準(zhǔn)并未有明確規(guī)定。試驗(yàn)研究中常用方法主要有紙層析與薄層板層析、紫外-可見光譜法、高效液相色譜法、花色苷水解法等。其中，高效液相色譜法（HPLC）最為常見，可用于花色苷的定性和定量測定，但由于目前商業(yè)上可提供的花色苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限，所以高效液相色譜多與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）進(jìn)行花色苷的定性分析。

本試驗(yàn)使用錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，對已有花色苷檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，并針對轉(zhuǎn)色期間的三種釀酒葡萄的果皮中花色苷的變化進(jìn)行研究，討論了花色苷在轉(zhuǎn)色過程中種類及含量的變化趨勢，為葡萄中花色苷的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

材料與方法

試劑與儀器。Ultimate 3000型雙三元二維液相色譜儀（美國Dionex 公司）；Agilent 1290-6460超高效液相色譜儀-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；CP224S型分析天平（德國Sartorius公司）；100?L～1000?L移液器、20?L～200?L移液器（德國Witeg公司）；0.45?m有機(jī)相濾膜（中國上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

錦葵色素3-O-葡萄糖苷（98%，美國Chromadex公司）；蒸餾水（中國廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck公司）。

樣品葡萄來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，選取赤霞珠、品麗珠、西拉三個品種釀酒葡萄作為研究對象，自轉(zhuǎn)色期前每7天均勻取樣，至葡萄完全成熟。葡萄樣品采摘后低溫保藏。樣品酒來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2017年自種赤霞珠葡萄采用傳統(tǒng)釀造工藝釀成，釀成后低溫保藏。

實(shí)驗(yàn)方法。

（1）溶液配制與樣品處理。標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：準(zhǔn)確稱量5.0mg錦葵色素3-O-葡萄糖苷，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇：水=1：1（磷酸調(diào)pH=1.5）溶液溶解并定容，充分搖勻，配制成500mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃冷藏保存。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：準(zhǔn)確量取500mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.04mL、0.1mL、0.2mL、1mL、2mL、4mL，用甲醇：水=1：1（磷酸調(diào)pH=1.5）溶液定容至100mL容量瓶中并充分搖勻，配制成0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃冷藏保存。葡萄樣品處理：挑選著色均勻葡萄，剝出果皮均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取樣品5.00g于50 mL聚乙烯管，加入浸提液（甲醇：水=1：1，磷酸調(diào)pH=1.95）10mL，超聲10min，渦旋5 min，重復(fù)2次，14000 r/min冷凍離心5 min，取上層清液過0.45μm 有機(jī)膜后進(jìn)樣分析。葡萄酒樣品處理：葡萄酒樣品經(jīng) 0.45μm膜過濾后直接進(jìn)樣分析。

（2）色譜條件。對葡萄浸提液中花色苷的檢測色譜條件參考已有所檢測條件并加以驗(yàn)證，具體條件如下：色譜柱：CAPCELL PAK C18 ACR（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A：乙腈：水=60：40；B：乙腈：水=5：95（均使用磷酸調(diào)pH=1.5）；進(jìn)樣體積：10?L；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：520 nm；梯度洗脫程序見表1。

（3）質(zhì)譜條件。正離子掃描（ESI+，m/z 100～600），毛細(xì)管電壓：3.50kV；裂解電壓：125V；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L/min；脫溶劑氣溫度：300℃；脫溶劑氣流量：7L/min。

（4）數(shù)據(jù)處理。花色苷含量采用峰面積表示法，以色譜圖中花色苷響應(yīng)峰面積值表征花色苷含量，進(jìn)行同種花色苷含量的比較。

結(jié)果與討論

檢測方法考察。花色苷為極性化合物，溶于極性溶劑，在低pH下保持相對穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選用CAPCELL PAK C18 ACR色譜柱，乙腈、水混合液（磷酸調(diào)pH=1.5）作為流動相可對花色苷進(jìn)行較好分離錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液與葡萄酒樣品色譜圖如圖1及圖2所示。

（1）線性范圍和靈敏度。選取0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.2.2色譜條件” 進(jìn)行測定，繪制樣品濃度（橫坐標(biāo)x，mg/L）與峰面積（縱坐標(biāo)y，mAU*min）標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，且當(dāng)信噪比為3（S/N=3）時，錦葵色素3-O-葡萄糖苷最低檢出限（LOD）為0.2mg/L，回歸方程為y=1.8183x + 0.5919，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9999。結(jié)果表明，該方法在本實(shí)驗(yàn)檢測線性范圍內(nèi)，線性良好。

（2）樣品加標(biāo)回收率和精密度。在空白葡萄酒樣品中添加5mg/L、20mg/L、50mg/L錦葵色素3-O-葡萄糖苷標(biāo)工作溶液，渦旋混合放置20min，按進(jìn)行前處理操作后，按“色譜條件”進(jìn)樣測定，以濃度值計(jì)算加標(biāo)回收率。為得到錦葵色素3-O-葡萄糖苷測定方法的精密度，試驗(yàn)對每一添加濃度樣品重復(fù)測定8次。各花色苷的加標(biāo)回收率在97.18%-98.27%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏（RSD） 在0.31%～0.94%。方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。結(jié)果表明，該方法可對葡萄中花色苷進(jìn)行準(zhǔn)確測定，適用于本實(shí)驗(yàn)。endprint

釀酒葡萄果皮中花色苷變化。

（1）釀酒葡萄果皮中主要花色苷種類。本實(shí)驗(yàn)在葡萄轉(zhuǎn)色過程中，使用“色譜條件”對三種釀酒葡萄中花色苷進(jìn)行測定，結(jié)果與葡萄與葡萄酒中花色苷HPLC-MS/MS的分子離子與碎片離子峰譜庫信息進(jìn)行比對，完全成熟后的三種葡萄色譜圖如圖3所示。由圖可明顯看出，在成熟后（第10周）釀酒葡萄中，可明顯檢測到10種花色苷，檢測結(jié)果見表2所示。

與譜庫信息對比，實(shí)驗(yàn)檢出10種花色苷，主要為5種花色苷的單葡萄糖苷和它們相應(yīng)的衍生物，其中5個花色苷單體、3個?；ㄉ蘸?個其它花色苷，5個花色苷單體分別是飛燕草色素、矢車菊色素、牽?；ㄉ?、芍藥色素、錦葵色素單體葡萄糖苷。相應(yīng)峰l，2、3、4和5。5個花色苷單體的分子離子峰m/z分別為465、449、479、463和493，碎片離子峰m/z分別是303、287、317、301和331。其中，測得錦葵色素葡萄糖苷（峰5）在三種釀酒葡萄中響應(yīng)面積最大，含量最高，是檢測葡萄的第一特征花色苷。3個?；ㄉ障鄳?yīng)峰是7、8和10。經(jīng)檢測知其為矢車菊色素、牽?；ㄉ丶板\葵色素花色苷的第一衍生乙?；咸烟擒?，它們的分子離子峰m/z 分別為491、521和535，碎片離子峰m/z分別為287、317和331。其中錦葵色素的乙?；擒眨ǚ?0）的含量較高。此外還檢測到4-丙酮基錦葵色素葡萄糖苷（峰6）與4-乙烯基芍藥色素葡萄糖苷（峰9），其分子離子峰m/z 分別為561、625，碎片離子峰m/z分別為399、331。

轉(zhuǎn)色前對三種釀酒葡萄果皮花色苷檢測發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮中不包含任何花色苷，葡萄呈現(xiàn)青綠色。轉(zhuǎn)色前期，葡萄呈現(xiàn)淡紫色，果皮中花色苷主要為5種單體花色苷，其中錦葵色素含量最高。隨著轉(zhuǎn)色的進(jìn)行，葡萄顏色不斷加深，最后呈現(xiàn)紫紅色。此時，葡萄果皮中花色苷種類繁多，為5種單體花色苷與其他物質(zhì)反應(yīng)生成的衍生花色苷，包括乙酰化花色苷、香豆酰化花色苷、咖啡?；ㄉ盏?。本實(shí)驗(yàn)中檢測到三種釀酒葡萄成熟后果皮花色苷以單體花色苷、乙酰化花色苷為主。

（2）總量變化。以中所檢測到的10種花色苷作為研究對象，以個花色苷峰面積作為定量標(biāo)準(zhǔn)，對三種釀酒葡萄在轉(zhuǎn)色過程中總花色苷變化趨勢進(jìn)行研究，總花色苷變化趨勢圖如圖4所示。

由圖4可以得知，三種釀酒葡萄中花色苷總量呈先上升，后趨于平緩，略有下降的趨勢。其中，1～5周花色苷總量變化緩慢，5～8周三種釀酒葡萄中花色苷總量均顯著增加，8周以后，花色苷總量趨于穩(wěn)定，赤霞珠略有降低。三種釀酒葡萄中，西拉中花色苷含量總量最高（552.24mAU*min），赤霞珠與品麗珠中花色苷總量差異不大，最大響應(yīng)面積值分別為367.96mAU*min、389.05mAU*min。赤霞珠中花色苷積累早于其它兩種葡萄，西拉次之。這種現(xiàn)象可能是由葡萄品種間差異所導(dǎo)致。

（3）釀酒葡萄果皮花色苷種類及變化。對釀酒葡萄中10種花色苷進(jìn)行分類分析，可分為單體花色苷類、乙?；ㄉ疹惻c其它花色苷類三類。3種釀酒葡萄中三類花色苷在轉(zhuǎn)色過程中含量變化趨勢如圖5所示。

由圖5可以看出，三種釀酒葡萄中均含三類花色苷，其中，單體花色苷含量最高，赤霞珠、品麗珠、西拉中單體花色苷最高含量響應(yīng)面積分別為284.31mAU*min、262.85mAU*min、381.21mAU*min。單體花色苷積累較早，但不同品種釀酒葡萄單體花色苷合成時間有所差異，赤霞珠、西拉在轉(zhuǎn)色第3周起，單體花色苷大量生成，而品麗珠中單體花色苷在轉(zhuǎn)色第4周起開始大量積累。赤霞珠、西拉中單體花色苷在轉(zhuǎn)色第8周時相應(yīng)面積達(dá)到最大值，隨后含量有所降低，這是由于轉(zhuǎn)色第8周后，赤霞珠與西拉完全成熟，葡萄中單體花色苷不再或很少合成，又由于單體花色苷的不穩(wěn)定性，很容易與葡萄中其他物質(zhì)反應(yīng)生成新的衍生花色苷或其他不顯色物質(zhì)，因此單體花色苷含量有所下降。品麗珠單體花色苷積累晚于赤霞珠及西拉，轉(zhuǎn)色至第9周時單體花色苷并未達(dá)到最大值，可能是由于品種差異性導(dǎo)致品麗珠成熟晚于赤霞珠與西拉。

三種葡萄中乙?；ㄉ占捌渌ㄉ蘸铣删碛趩误w花色苷，且含量遠(yuǎn)低于單體花色苷，赤霞珠、品麗珠、西拉中乙酰基花色苷最高含量分別為75.64mAU*min、96.83mAU*min、160.90mAU*min。原因可能是乙酰化花色苷合成受單體花色苷及葡萄中代謝產(chǎn)物含量的制約。

其它花色苷包括很多種類，本實(shí)驗(yàn)中，選擇含量較高的4-丙酮基錦葵色素-3-O-葡萄糖苷與4-乙烯基芍藥色素-3-O-葡萄糖苷作為研究對象。由圖5可以看出，三種葡萄中其它花色苷積累晚于乙?；ㄉ?，且含量較少。整個轉(zhuǎn)色過程中，其它花色苷含量變化不大，說明其穩(wěn)定性較好

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜儀，采用CAPCELL PAK C18 ACR色譜柱，乙腈-水（磷酸調(diào)pH值為1.5）溶液作為流動相，使用紫外檢測器在檢測波長為520nm條件下對赤霞珠、品麗珠、西拉在轉(zhuǎn)色期間果皮中花色苷進(jìn)行檢測，使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對檢測到的各花色苷進(jìn)行定性，總結(jié)分析了三種釀酒葡萄在轉(zhuǎn)色期間果皮中花色苷種類及含量的變化趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)色期間釀酒葡萄中花色苷種類及含量均顯著增多，單體花色苷合成較早，但不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化成其他花色苷。在葡萄完全成熟后，花色苷總量有所下降，單體花色苷含量明顯降低，乙?；ㄉ占捌渌ㄉ招再|(zhì)較為穩(wěn)定，其總量相對保持不變。

作者簡介：

閆衡（1989-），女，漢族，陜西漢中，碩士研究生，助教，漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，研究方向：葡萄酒色澤研究、食品安全監(jiān)測；高娟（1989-），女，漢族，甘肅永昌，本科，助理工程師，單位：甘肅省金昌市食品檢驗(yàn)檢測中心，研究方向：食品安全質(zhì)量控制。endprint