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    高壓氧及Notch信號(hào)阻斷劑對(duì)大鼠顱腦損傷后海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響

    2017-11-16 16:11:29楊永凱張帆韋浩
    中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥 2017年28期
    關(guān)鍵詞:顱腦損傷高壓氧

    楊永凱+張帆+韋浩

    [摘要]目的 觀察高壓氧及Notch信號(hào)阻斷劑(DAPT)對(duì)大鼠顱腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響。方法 100只成年健康Wistar大鼠隨機(jī)平均分為假手術(shù)組、顱腦損傷組、DAPT{N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-Sphenylglycinet-butylester}組、高壓氧組及二甲基亞砜(DMSO)組,應(yīng)用改良的自由落體方法制備腦損傷模型,用免疫熒光雙標(biāo)記染色法觀察傷后7、14、21 d及28 d大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化。結(jié)果 顱腦損傷組、DAPT和高壓氧組海馬區(qū)BrdU/nestin雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),在傷后7 d為(14.2±1.3)、(11.4±1.7)個(gè)和(22.3±1.5)個(gè),在傷后14 d為(9.6±0.7)、(6.9±2.1)個(gè)和(13.8±1.4)個(gè),在傷后7 d較傷后14 d明顯增多(P<0.05);與顱腦損傷組比較,DAPT組在傷后7 d及14 d雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05);高壓氧組在傷后7 d及14 d雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。結(jié)論 高壓氧能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化,Notch信號(hào)阻斷劑抑制了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化。

    [關(guān)鍵詞]高壓氧;顱腦損傷;神經(jīng)干細(xì)胞;Notch通路;增殖分化

    [中圖分類號(hào)] R651.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2017)10(a)-0007-04

    [Abstract]Objective To observe the effects of hyperbaric oxygen therapy and DAPT on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Methods 100 adult Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,traumatic brain injury group,DAPT group,hyperbaric oxygen therapy group and DMSO group.Animal models of craniocerebral trauma were made using the improved free-fall method in the rats.The proliferation and differentiation of neural stem cells of the DG brain tissue was detected by BrdU labeling fluorescence immunocytochemistry at the 7,14,21 d and 28 d after injury.Results The BrdU and nestin positive cells of the traumatic brain injury group,DAPT group and hyperbaric oxygen therapy group began to increase from the 7 d(14.2±1.3,11.4±1.7,22.3±1.5) to the 14 d after injury (9.6±0.7,6.9±2.1,13.8±1.4).Compared with the 14 d,the BrdU and nestin positive cells significantly increased 7 d after injury (P<0.05).Compared with the traumatic brain injury group,the BrdU and nestin positive cells significantly decreased in the DAPT group 7 d and 14 d after injury (P<0.05).Compared with the traumatic brain injury group,the BrdU and nestin positive cells significantly increased in the hyperbaric oxygen therapy group 7 d and 14 d after injury (P<0.05).Conclusion Hyperbaric oxygen therapy can enhance the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Notch signal channel blocker can restrain the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.

    [Key words] Hyperbaric oxygen;Traumatic brain injury;Neural stem cells;Notch signal channel;Proliferation and differentiation

    急性顱腦損傷是神經(jīng)外科的常見(jiàn)疾病,其致死率、致殘率高,目前治療顱腦損傷的方法中傳統(tǒng)手術(shù)及藥物的治療效果仍不盡滿意,因此要尋找其它有效的治療方法。干細(xì)胞治療是目前認(rèn)為對(duì)顱腦損傷患者比較有效的治療方法。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞終生存在于側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)等腦內(nèi)某些特定的區(qū)域。腦損傷后可誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞開(kāi)始增殖、分化來(lái)進(jìn)行修復(fù)[1-2]。Urrea等[3]研究表明,腦外傷后海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖在傷后早期即開(kāi)始增殖,于2~3 d時(shí)達(dá)到高峰。但是顱腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化能力十分有限,遠(yuǎn)不能達(dá)到臨床恢復(fù)的要求。因此,研究如何促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化,將為內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞治療帶來(lái)廣闊的前景。endprint

    高壓氧是目前治療顱腦損傷比較有效的治療方法,國(guó)內(nèi)大量臨床報(bào)道也表明高壓氧可以降低中樞神經(jīng)損傷的傷殘率和病死率。另外國(guó)內(nèi)潘長(zhǎng)福等[4]實(shí)驗(yàn)顯示小鼠顱腦損傷后海馬區(qū)Notch1及Hes1 mRNA明顯增高,推測(cè)認(rèn)為Notch信號(hào)激活可能與傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化有關(guān),因此本研究推測(cè)高壓氧能夠通過(guò)Notch信號(hào)促進(jìn)顱腦損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化。本研究采用大鼠顱腦損傷模型,用高壓氧及Notch信號(hào)阻斷劑DAPT{N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]–Sphenylglycinet-butylester}干預(yù)顱腦損傷后大鼠,觀察海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化情況,為高壓氧治療顱腦損傷提供理論依據(jù)。

    1對(duì)象與方法

    1.1對(duì)象

    健康成年雄性清潔級(jí)Wistar大鼠100只,鼠齡3~4個(gè)月,體重250~300 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物飼養(yǎng)溫度20~24 ℃,12 h后明/暗循環(huán),正常飲食,自由飲水。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將大鼠分為5個(gè)組,分別為假手術(shù)組、顱腦損傷組、DAPT組、高壓氧組及DMSO溶劑組,每組各20只。

    1.2主要試劑及儀器

    DAPT購(gòu)自美國(guó)Calbiochem 公司;DMSO購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司;顱腦定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);-80℃低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司);SHC2600/7500-8型醫(yī)用空氣加壓氧艙(上海七零一所楊園高壓氧艙有限公司)。

    1.3大鼠顱腦損傷模型的制作

    應(yīng)用Feeney′s自由落體硬膜外撞擊方法[5]建立大鼠顱腦損傷模型,具體方法:損傷裝置由底板、固定支架、垂直導(dǎo)桿、下落擊錘和聚乙烯撞擊圓錐組成。撞擊圓錐頭端直徑4 mm,高2.5 mm。用10%水合氯醛(0.4 ml/l00 g體重)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后,將其頭部固定于立體定向儀上,剪去顱頂部皮毛,消毒皮膚后,沿中線右側(cè)切開(kāi)頭皮,分離骨膜,用磨鉆于中線旁2 mm,緊挨冠狀縫后開(kāi)直徑5 mm的圓形窗,硬膜保持完整。依據(jù)改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分(modified neurological severity score,mNSS),大鼠中型顱腦損傷的致傷沖擊力為400 g·cm,用20 g砝碼于20 cm高處通過(guò)金屬導(dǎo)桿墜落,撞擊置于硬膜上的圓錐上致中型顱腦損傷,用骨臘封閉骨窗,縫合頭皮,置鼠籠喂養(yǎng)。

    mNSS通過(guò)運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)、感覺(jué)試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)等反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng),綜合評(píng)價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重程度,是目前應(yīng)用較廣泛的腦損傷后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能的評(píng)估方法。其分?jǐn)?shù)越低,表明神經(jīng)運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能越接近正常,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)[6]。應(yīng)用mNSS評(píng)分對(duì)大鼠顱腦損傷模型進(jìn)行鑒定,使大鼠具有相同的顱腦損傷程度,本實(shí)驗(yàn)將評(píng)分為7~12分的中型顱腦損傷大鼠列為研究對(duì)象。

    1.4給藥及高壓氧治療方法

    ①假手術(shù)組:僅切開(kāi)頭皮和顱骨開(kāi)窗而不致?lián)p傷腦組織;②顱腦損傷組:按顱腦損傷模型方法建立;③DAPT組:DAPT{N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]–Sphenylglycinet-butylester}為γ分泌酶抑制劑,是特異性的Notch信號(hào)阻斷劑,溶于二甲基亞砜(DMSO)溶劑中保持穩(wěn)定,顱腦損傷模型成功后腹腔注射DAPT,每次腹腔注射100 mg/kg體重[7],隔日注射1次,連續(xù)28 d。④高壓氧組:大鼠顱腦損傷模型成功后3 h內(nèi)進(jìn)行高壓氧治療,先用純氧充分洗艙10 min后,在20 min內(nèi)勻速加壓至2.0 ATA(0.2 MPa)穩(wěn)壓60 min,其間用純氧通風(fēng)10 min,艙內(nèi)氧濃度>96%。穩(wěn)壓結(jié)束后用20 min勻速減壓至常壓出艙。每天1次,共28 d。⑤DMSO溶劑組:按照與DAPT等體積腹腔注射顱腦損傷大鼠。以上5組根據(jù)顱腦損傷后處死動(dòng)物的時(shí)間(顱腦損傷后7、14、21、28 d)隨機(jī)分為4個(gè)亞組,每個(gè)亞組5只大鼠。

    1.5 BrdU標(biāo)記及組織免疫熒光雙標(biāo)記染色

    5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU),是一種嘧啶脫氧核苷類似物,在DNA合成期(S期),代替胸腺嘧啶摻入,標(biāo)記新生細(xì)胞,可判斷分化細(xì)胞是否來(lái)源于神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs),各組干預(yù)后分別于顱腦損傷后7、14、21 d及28 d處死大鼠,處死前2 d開(kāi)始腹腔注射BrdU(50 mg/kg)每天2次,每次間隔8 h。取腦標(biāo)本時(shí)行4%多聚甲醛灌流后,再將腦置于4%多聚甲醛中浸置4~6 h后,取海馬齒狀回腦組織用PBS漂洗,經(jīng)乙醇常規(guī)脫水,二甲苯透明后,浸蠟包埋,連續(xù)5 μm厚切片,組織切片按免疫組織化學(xué)染色操作步驟完成后使用激光共聚焦顯微鏡采集試驗(yàn)結(jié)果。參照Kuhn等[8-9]方法,計(jì)算雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),每個(gè)亞組5只大鼠,每只大鼠取非連續(xù)的3張切片,每張切片選取2個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。

    1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    在激光共聚焦顯微鏡下觀察,在BrdU/nestin熒光染色切片中,可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞由TRITC標(biāo)記為紅色,神經(jīng)元特異性抗原nestin陽(yáng)性細(xì)胞由FITC標(biāo)記為綠色,BrdU/nestin陽(yáng)性雙標(biāo)細(xì)胞顯示為黃色。檢測(cè)結(jié)果顯示,假手術(shù)組在傷后各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BrdU/nestin雙標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞;在傷后7 d及14 d顱腦損傷組、DAPT組和高壓氧組BrdU/nestin雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯增多,與顱腦損傷組比較,高壓氧組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05),DAPT組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05),DMSO溶劑組對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響不大。且顱腦損傷組、DAPT組、高壓氧組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)在傷后7 d較傷后14 d明顯增多(P<0.05)(表1)。endprint

    3討論

    BrdU作為標(biāo)志物可以標(biāo)記活躍的增殖細(xì)胞,但不能單獨(dú)反映神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,nestin是一個(gè)廣泛用于識(shí)別神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記,免疫熒光BrdU/nestin雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞可以反映新增殖的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)用高壓氧及DAPT干預(yù)顱腦損傷大鼠后,與顱腦損傷組比較,在傷后7 d及14 d高壓氧組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯增多,提示高壓氧促進(jìn)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖;DAPT組較顱腦損傷組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示DAPT可能抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。

    臨床報(bào)道高壓氧可以降低中樞神經(jīng)損傷的傷殘率和病死率[10-12]。劉海等[13]研究認(rèn)為高壓氧使大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化加強(qiáng),脊髓損傷后的神經(jīng)功能得到改善,提示高壓氧的治療作用可能與激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有關(guān)。王曉莉等[14]研究表明高壓氧可以促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,其機(jī)制與Wnt信號(hào)活化有關(guān)。而Notch信號(hào)通路同Wnt信號(hào)通路相似,也與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)。

    Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體和CSLDNA結(jié)合蛋白3部分組成,配體與受體結(jié)合后,Notch受體相繼發(fā)生兩次蛋白水解。第2次是由γ-分泌酶在跨膜區(qū)靠近胞膜內(nèi)的位點(diǎn)切割蛋白,使具有核定位信號(hào)的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域(NICD)釋放人細(xì)胞質(zhì),進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合蛋白CSL相互作用,導(dǎo)致下游的Hes基因激活,參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生,故Hes 1的表達(dá)受Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)。DAPT是一種特異性抑制γ-分泌酶活性的化學(xué)分子,被公認(rèn)為Notch信號(hào)通路的有效阻斷劑,能抑制Notch信號(hào)通路,筆者前期的實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)DAPT通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路的活性有抗腦膠質(zhì)瘤作用[15]。將DAPT運(yùn)用于神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中,鏡下可見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量明顯減少,神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所形成的神經(jīng)球的直徑也明顯減小;相反的,過(guò)表達(dá)Notch 1、Hes 1和Hes 5能夠促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和自我更新[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用DAPT干預(yù)顱腦損傷大鼠,DAPT組較顱腦損傷組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示DAPT抑制了大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,說(shuō)明Notch信號(hào)通路參與了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化。

    本實(shí)驗(yàn)中顱腦損傷組、DAPT組、高壓氧組雙標(biāo)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)在傷后7 d較傷后14 d明顯增多,提示顱腦損傷大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化在傷后7 d達(dá)到高峰。這與He等[18]的研究結(jié)果相一致:大鼠腦缺血損傷后6 h海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)nestin,傷后7 d后達(dá)到高峰,持續(xù)時(shí)間4周。本研究結(jié)果對(duì)臨床上高壓氧治療時(shí)機(jī)的啟示:對(duì)于顱腦損傷的患者高壓氧治療應(yīng)盡早進(jìn)行,盡量在傷后7 d內(nèi)開(kāi)始高壓氧治療。

    綜上所述,本研究通過(guò)高壓氧及Notch信號(hào)阻斷劑對(duì)顱腦損傷后大鼠進(jìn)行干預(yù),證實(shí)高壓氧可以通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠顱腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化,為今后進(jìn)一步深入研究Notch信號(hào)調(diào)控人神經(jīng)再生機(jī)制提供理論基礎(chǔ),為將來(lái)臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Trouche S,Bontempi B,Roullet P,et al.Recruitment of adult-generated neurons in to functional hippocampal networks contributes to updating and strengthening of spatial memory[J].PNAS,2009,106(14):5919-5924.

    [2]Dhivyaa A,Deborah AL,Ryan JF,et al.Brain injury expands the numbers of neural stemcells and progenitors in the SVZ by enhancing their responsiveness to EGF[J].Asn Neuro,2009,1(2):95-111.

    [3]Urrea C,Castellanos DA,Sagen J,et al.Widespread cellular proliferationand focal neurogenesis after traumatic brain injury in therat[J].Restor Neurol Neurosci,2007,25(1):65-76.

    [4]潘長(zhǎng)福,阮瓊芳,沈曉黎,等.腦外傷后小鼠海馬區(qū)notch信號(hào)的表達(dá)變化[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(4):338-340.

    [5]Hallahan AR,Pritchard JI,Hansen S,et al.The SmoA 1 mouse model reveals that notch signalling is critical for the growth and survival of sonic hedgehog-in duced medulloblastomas [J].Cancer Res,2004,64(21):7794-7800.

    [6]De stroper BD,Annaert W,Cape P,et al.A presenilin 1-dependent γ-secrelase like Protease mediates release of Notch intra.cellular domain[J].Nature,1999,398(6727):518-522.

    [7]chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats [J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.endprint

    [8]Kuhn HG,Dickinson-Anson H,Gage FH.Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat:Age-related decrease of neuronal progenitor proliferation [J].J Neurosci,1996,16(6):2027-2033.

    [9]Costa SR,Ketty BR,Bardgett RD,et al.Exploitation of immunofluorescence for the quantification and characterization of small numbers of Pasteuria endospores[J].FEMS Microbiol Ecol,2006,58(3):593-600.

    [10]Asamoto S,Sugiyama H,DoiH,et al.Hyperbaric oxygen(HBO) therapy for acute traumatic cervical spinal cord injury[J].Spinal Cord,2000,38(9):538-540.

    [11]種玉飛,陳紅,尤春景.高壓氧對(duì)干細(xì)胞增殖與分化的影響[J].中國(guó)康復(fù),2011,26(3):227-228.

    [12]李志才,宋一平,穆小萍,等.高壓氧治療脊髓損傷的療效觀察[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2008,30(3):150-151.

    [13]劉海,王忠誠(chéng),安沂華,等.高壓氧對(duì)大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2006,12(5):369-371.

    [14]王曉莉,楊于嘉,王慶紅,等.高壓氧促HIBD新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過(guò)程中Wnt-3蛋白的變化[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2007,9(3):241-246.

    [15]楊永凱,楊衛(wèi)忠,石松生,等.DAPT抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[J].福建醫(yī)藥雜志,2009,31(1):83-85.

    [16]Hu YY,Zheng MH,Cheng G,et al.Notchsignaling contributes to the maintenance of both normal neuralstem cells and patient-derived glioma stem cells.BMC cancer2011,11:82.

    [17]Jeon SJ,F(xiàn)ujioka M,Kim SC,et al.Notch signaling alterssensory or neuronal cell fate specification of inner ear stem cells.J Neurosci 2011,31(23): 8351-8.

    [18]He Z,Cui L,Meschia JF,et al.Hippocampal progenitor cellsexpress nestin following cerebral ischemia in rats[J].Neuroreport,2005,16(14):1541-1544.

    (收稿日期:2017-07-25 本文編輯:任 念)endprint

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