東北林蛙PDK1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

鞏珊珊 邵 婕 曲俐俐 柴龍會 張晶鈺 肖向紅

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)稿件運(yùn)行過程

東北林蛙PDK1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

鞏珊珊 邵 婕 曲俐俐 柴龍會 張晶鈺 肖向紅*

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)稿件運(yùn)行過程

東北林蛙；PDK1基因；基因克??；生物信息學(xué)分析

PDK1是PI3K/Akt信號通路中的一個重要的激酶。在哺乳動物中，PI3K/Akt信號通路是一條保守的通路，通過激活下游的因子對糖代謝、脂肪代謝以及蛋白質(zhì)代謝，細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等起調(diào)節(jié)控制作用。本研究基于東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中鑒定出PDK1基因3條Unigene序列，并通過RACE法克隆了PDK1基因的全長cDNA，命名為rdPDK1，其全長為1 990 bp，開放閱讀框長1 674 bp，編碼557個氨基酸。進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測該基因編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量63.7 kD，等電點(diǎn)為7.21。該蛋白第82～344個和443～549個氨基酸是2段保守結(jié)構(gòu)域STKc激酶域和PH調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。同源性分析表明rdPDK1蛋白與HsPDK1蛋白氨基酸序列一致率為79%，相似率為100%；與MmPDK1蛋白氨基酸序列一致率為80%，相似率為100%。本研究結(jié)果有望為進(jìn)一步研究東北林蛙PI3K/Akt信號通路中PDK1基因的特性及功能奠定基礎(chǔ)。

各種生長因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合時，如胰島素，IGF1、PDGF等，與受體相聯(lián)系的磷脂酰肌3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)會被激活，內(nèi)膜脂成分PIP2被PI3K磷酸化轉(zhuǎn)化成PIP3，PIP3作為第二信使與蛋白的PH(pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)域結(jié)合控制一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-2]。PDK1((3-phosphoinositide dependent protein kinase1)與PKB(Protein Kinase B or Akt)均具有PH結(jié)構(gòu)域與之結(jié)合并被激活。PDK1通過與 PIP3或PIP2結(jié)合，招募PKB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，PKB完全活化，激活下游因子，如GSK3β、S6K、叉頭轉(zhuǎn)錄因子等，從而調(diào)節(jié)糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝，細(xì)胞增殖分化、生存與凋亡，引起糖原合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白合成、細(xì)胞生長、擴(kuò)散和抗凋亡等效應(yīng)[2-5]。隨著深入的了解，PDK1已被人們廣泛關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。

PDK1是第一個從組織中提取純化的通過PIP3磷酸化PKB活化環(huán)(T環(huán)，Thr308)的酶[1]。作為AGC蛋白激酶家族中的一員，絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1需要磷酸化Ser241殘基才能被激活，同理與其他AGC家族成員，但其結(jié)構(gòu)和功能卻有所不同[6-7]。在哺乳動物中，PDK1編碼556個氨基酸，分子量約63 kD，是單體多肽酶，擁有2個保守結(jié)構(gòu)域，激酶活化結(jié)構(gòu)域和PH調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，而其他AGC激酶除PKB外均不具PH結(jié)構(gòu)域，且PDK1與PKB的PH結(jié)構(gòu)域位置不同，PDK1的PH結(jié)構(gòu)域位于C末端，而PKB的PH結(jié)構(gòu)域位于N末端的催化結(jié)構(gòu)域中[7]。在PDK1的激酶結(jié)構(gòu)域中還存在一個疏水基團(tuán)PIF袋，用于調(diào)節(jié)其他底物，如S6K、RSK、SGK等[8-9]。

在免疫沉淀反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，生長因子或胰島素不能直接激活PDK1，而化學(xué)計(jì)量法發(fā)現(xiàn)，PDK1可以通過分子間作用介導(dǎo)其自身磷酸化。然而只有當(dāng)存在某些刺激時，PDK1才能完全活化激活下游底物，在無任何刺激時，其活性保持在閾值以下，因其存在的2個結(jié)構(gòu)域：PIF疏水基團(tuán)和PH結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致了PDK1激活下游底物的機(jī)制不一致[6]。因PKB擁有PH結(jié)構(gòu)域，在PIP3存在的情況下，PDK1與PKB的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，從而在膜上定位，構(gòu)象發(fā)生改變，PDK1迅速磷酸化激活PKB，使之具有活性，發(fā)生一系列反應(yīng)[10-12]。因AGC激酶家族其他成員不具有PH結(jié)構(gòu)域，因此是否存在PIP3對其活化沒有影響，而是通過控制疏水基序磷酸化而促進(jìn)S6K和SGK活化[3]。

除了PI3K信號通路外，PDK1在很多信號通路中都具有關(guān)鍵性作用。其在病理狀態(tài)下，會導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病及癌癥的發(fā)生。在胰島素信號通路中，胰島素傳導(dǎo)受損會造成胰島素抵抗，降低糖耐受，導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)，特異性PDK1的激動劑可以提高治療糖尿病的效率，同樣特異性PDK1的抑制劑則可大大提高癌癥治療的可能性[3]。因此，人們越來越關(guān)注對于PDK1的研究。

東北林蛙(Ranadybowskii)屬于無尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、林蛙屬，主要分布于中國東北部(黑龍江、吉林、遼寧)、內(nèi)蒙古、俄羅斯(遠(yuǎn)東地區(qū))、蒙古(東部)、日本、韓國及朝鮮半島等地，東北林蛙是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的兩棲動物，由其雌性輸卵管干制成的哈士蟆油是我國傳統(tǒng)的中藥材，在市場上供不應(yīng)求，其作為重要的經(jīng)濟(jì)動物，具有較高的經(jīng)濟(jì)研究價(jià)值[13-15]。現(xiàn)如今在世界范圍內(nèi)兩棲類的數(shù)量呈銳減趨勢[16-17]，東北林蛙作為中國東北部的優(yōu)勢物種同樣面臨瀕臨的危險(xiǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失[18-19]。有研究顯示溫度的變化及生態(tài)環(huán)境的破壞是造成兩棲類數(shù)量下降的主要原因之一[15，17]。本實(shí)驗(yàn)室已有研究顯示，在低溫狀態(tài)下，東北林蛙體內(nèi)葡萄糖含量會大量積累，作為抗凍保護(hù)物質(zhì)抵制細(xì)胞外液結(jié)冰，維持生命[20]。PI3K/PKB信號通路具有多種功能，包括調(diào)控細(xì)胞生長分化，細(xì)胞生存凋亡，糖代謝，脂肪代謝，蛋白質(zhì)代謝等，且PDK1是PI3K/PKB信號通路中一個關(guān)鍵性的激酶[6，21]，也有研究證實(shí)，在PDK1缺乏的脂肪細(xì)胞中，胰島素誘導(dǎo)激活PKB及S6K的作用被抑制，從而抑制糖原合成及跨膜蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的轉(zhuǎn)位[7]。但其在東北林蛙抵抗溫度變化中的作用未知。

我們根據(jù)對東北林蛙皮膚的轉(zhuǎn)錄組測序克隆了rdPDK1的基因全長，分析其編碼氨基酸結(jié)構(gòu)、信號肽以及功能位點(diǎn)，與其他物種的同源性比較，對其進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮沂緍dPDK1的基因功能特性，為更深一步研究奠定基礎(chǔ)，且希望通過對東北林蛙PDK1的研究能為我們針對PI3K信號通路在東北林蛙抗低溫機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物為健康的雄性東北林蛙，2～3齡，2015年9月采自于黑龍江省伊春市友好林場，平均體重(20±2)g。首先準(zhǔn)備數(shù)個通風(fēng)容器，將東北林蛙低密度放置于通風(fēng)容器中，4℃通風(fēng)櫥中培養(yǎng)2～3周后用于實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)期間2 d換1次經(jīng)活性炭過濾的水，除去容器中水總體積的2/3，保留1/3，其他期間不可隨意移動容器。

1.2 主要試劑

試劑：RNA提取試劑TRIzol?Reagent(Ambion，美國)；PrimeScriptTMRTase、樣品保存液、pMD18-T(TaKaRa，日本)；Biowest Agarose瓊脂糖(Biowest，美國)；rTaqDNA聚合酶、dNTPs、D2 000Mrker、DNA膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)。

1.3 mRNA 序列和引物

東北林蛙的PDK1 mRNA(Messenger RNA)來自于東北林蛙皮膚的基因組序列(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，the Beijing Genomics Institution(BGI，China)有注釋。引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer Premier 5，用于擴(kuò)增cDNA片段和末端(RACE法)PCR。

1.4 RNA提取和cDNA合成

取實(shí)驗(yàn)動物東北林蛙雙毀髓處理固定于蛙板上，提取心臟、肝臟、肌肉、腎臟等組織于RNA樣品保存液中，放置于液氮中迅速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中備用。待提取RNA時，將樣品保存液吸出，加入1 mL Trizol試劑，勻漿機(jī)勻漿，RNA提取實(shí)驗(yàn)過程按照Trizol試劑說明書進(jìn)行，最后將獲得的RNA沉淀溶于超純水中，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢驗(yàn)其濃度、純度及其有無蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，經(jīng)分光光度計(jì)定量檢測其濃度和純度。將RNA溶液保存于-80℃以備后續(xù)試驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行cDNA合成，取3 μL 總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA保存于-20℃，用于克隆rdPDK1基因的中間片段。按照RACE法說明書使用P5′RT引物合成cDNA用于5′末端克?。话凑誖ACE法說明書用3′CDS引物合成cDNA用于3′末端快速擴(kuò)增。

1.5 東北林蛙PDK1基因中間片段、3′末端、5′末端的克隆

引物設(shè)計(jì)：基于我們實(shí)驗(yàn)室對東北林蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，我們獲得了3條rdPDK1的Unigene序列，分別為Unigene97712(480 bp)、Unigene105918(915 bp)、Unigene100407(556 bp)。通過Unigene序列，我們使用Primer Premier 5軟件對擴(kuò)增rdPDK1的中間片段進(jìn)行了特異性引物的上設(shè)計(jì)，PDK1S和PDK1A。P3′S及RACE法說明書中3′CDS引物用于擴(kuò)增3′末端，P5′RT、P5′S和P5′A引物用于擴(kuò)增5′末端(表1)。首先我們進(jìn)行了最普通的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，利用特異性引物PDK1S和PDK1A進(jìn)行中間片段擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4℃變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min30 s，30個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃無限循環(huán)結(jié)束擴(kuò)增。3′末端擴(kuò)增：94℃變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃無限循環(huán)結(jié)束擴(kuò)增。5′末端擴(kuò)增：首先將cDNA環(huán)化，然后將環(huán)化cDNA進(jìn)行PCR，94℃變性2 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min30 s，30個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃無限循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束。將所有PCR所獲產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，獲取與預(yù)測堿基數(shù)相近的單一條帶，經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，送生工基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

東北林蛙PDK1cDNA全長序列被遞交到NCBI，(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)用于獲得可能的開放閱讀框和氨基酸序列；(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用于蛋白同源序列比對；(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)用于獲得蛋白的保守區(qū)域；軟件ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam/)用于預(yù)測蛋白的理論分子式、分子量、等電點(diǎn)等；跨膜結(jié)構(gòu)通過TMHMM在線服務(wù)器(http：//cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)進(jìn)行預(yù)測；Predict Protein(http：//www.predictprotein.org/)用于預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使用NetPhos 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)檢測氨基酸可能的磷酸化位點(diǎn)；軟件Clustalx用于進(jìn)行各個物種間的氨基酸序列的多重序列比對；軟件MEGA用于進(jìn)化樹構(gòu)建；其他物種的氨基酸序列從GenBank中獲得(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北林蛙PDK1基因的克隆

首先對3條Unigene序列進(jìn)行BLAST分析，預(yù)測已知片段所在位置，經(jīng)BioEdit分析，發(fā)現(xiàn)Unigene105918和Unigene100407為反向互補(bǔ)序列，對Unigene100407進(jìn)行反向互補(bǔ)得到正義鏈，且與Unigene105918進(jìn)行拼接。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用到的引物

Tab.1 The primers used in the experiment

采用經(jīng)Prime Primer 5設(shè)計(jì)的特異性引物(PDK1S、PDK1A)進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳獲得與預(yù)計(jì)分子量大小相符的特異性條帶(圖1a)，經(jīng)測序獲得578個堿基片段，該片段序列經(jīng)BioEdit分析與已知Unigene97712的下游和Unigene105918的上游序列都有部分重疊，將其輸入NCBI中進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示其與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的PDK1的同源性最高，可確定其為同一序列。由特異性引物P3′S利用RACE法進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，同樣將產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，獲得與預(yù)計(jì)分子量大小相符的特異性條帶(圖1b)，經(jīng)測序獲得290個堿基片段，分析該片段，與Unigene100407下游序列一致。由特異性引物P5′RT、P5′S和P5′A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)計(jì)大小分子量相符的特異性條帶(圖1c)，克隆后測序得到1條466 bp的片段，該片段序列經(jīng)序列比對分析與Unigene97712序列一致。

將所得片段與已知Unigene序列拼接后得到PDK1的cDNA全長序列(圖2)，全長共包含1 990 bp，其中開放閱讀框?yàn)? 674 bp，編碼557個氨基酸。該序列5′非翻譯區(qū)(5′UTR)為90 bp，3′非翻譯區(qū)(3′UTR)為226 bp，序列如圖所示依次從左至右排列。

圖1 東北林蛙PDK1基因中間片段(a)、3′端(b)和5′端(c)擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Cloning of PDK1 in Rana dybowskii，Intermediate(a)、3′(b)、5′(c)注：M.D 2 000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)Note：D 2 000 DNA Marker

圖2 東北林蛙的PDK1核苷酸序列Fig.2 PDK1 of nucleotide sequence in Rana dybowskii

2.2 東北林蛙PDK1基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 東北林蛙PDK1基因編碼氨基酸的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用ExPASy軟件，對rdPDK1基因編碼氨基酸進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示rdPDK1的分子式為C2858H4438N770O844S20，分子量為63.7 kD，等電點(diǎn)為7.21，親水性為-0.497，證明rdPDK1為親水性蛋白(圖3)，不穩(wěn)定系數(shù)為54.6，說明其為不穩(wěn)定蛋白。

圖3 東北林蛙PDK1氨基酸親水性/疏水性分析Fig.3 The hydrophilic/ hydrophobic analysis of PDK1 in Rana dybowskii

2.2.2 東北林蛙PDK1蛋白的結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI分析東北林蛙PDK1蛋白有2個保守功能區(qū)，分別為STKc激酶結(jié)構(gòu)域和PH調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。STKc(a.a.82～344，E=3.38e-171)和PH(a.a.443～549，E=1.16e-67)(圖4)。

圖4 PDK1蛋白的結(jié)構(gòu)域分析圖Fig.4 Protein structure domain distribution of PDK1

2.2.3 東北林蛙PDK1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

PredictProtein對東北林蛙PDK1氨基酸二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測呈現(xiàn)結(jié)果如下(圖5)，無規(guī)則卷曲為該蛋白二級結(jié)構(gòu)中的主要構(gòu)成部分，約為61.0%，α螺旋和β折疊分別占20.8%和18.1%。其次，軟件TMHMM-2.0結(jié)果顯示鏈延伸(Extended strand)范圍內(nèi)無跨膜結(jié)構(gòu)域的存在。

2.2.4 東北林蛙PDK1蛋白序列與其他物種PDK1蛋白序列多重比對

使用ClustalX軟件對東北林蛙PDK1蛋白的氨基酸序列與HsPDK1(Homospecies)蛋白的氨基酸序列，MmPDK1(Musmouse)進(jìn)行多重比對，結(jié)果如圖6。

圖5 東北林蛙PDK1氨基酸的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 The secondary structure domain predictionof PDK1 in Rana dybowskii

圖6 東北林蛙與其他物種間PDK1蛋白序列的多重比對Fig.6 Multiple alignment of PDK1 amino sequences and other species 注：東北林蛙(Rd)、人(Hs，AAC51825.1)和鼠(Mm，AAC96115.1)，*表示相同氨基酸 Note：Rana dybowskii(Rd)、Homo sapiens(Hs，AAC51825.1)and Mus musculus(Mm，AAC96115.1)，*and represents the same amino acid

2.2.5 東北林蛙PDK1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

使用NetPhos2.0預(yù)測RdPDK1可能的磷酸化位點(diǎn)(表2)，蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)13個，絲氨酸(Ser)位點(diǎn)32個，酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)9個。

表2 東北林蛙PDK1氨基酸的磷酸位點(diǎn)預(yù)測

Tab.2 Prediction of phosphate sites of PDK1 amino acids in Rana dybowskii

2.2.6 東北林蛙PDK1蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建

使用MEGA5.1軟件對各物種氨基酸序列進(jìn)行比對構(gòu)建進(jìn)化樹，分析各個物種間PDK1蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。如圖7所示，東北林蛙與爪蟾(Xenopus)類親緣關(guān)系最近，與人(Homosapiens)、黑猩猩(Pantroglodytes)等哺乳動物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 不同物種的PDK1氨基酸序進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.7 Phylogenetic relationship of PDK1 proteins in different species 氨基酸序列來源于GenBank，人(Homo sapiens)：AAC51825.1；家鼠(Mus musculus)：AAC96115.1；原雞(Gallus gallus)：NP_001012547.1；褐家鼠(Rattus norvegicus)：NP_112343.1；斑馬魚(Danio rerio)：NP_991262.1；黑猩猩(Pan troglodytes)：JAA29491.1；非洲爪蟾(Xenopus laevis)：XP_018094630.1；熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)：XP_002938460.2；亞洲水牛(Bubalus bubalis)：XP_006059775.1；土撥鼠(Cavia porcellus)：XP_012997135.1；中華鱉(Pelodiscus sinensis)：XP_014429204.1；西洋鮭(Salmo salar)：XP_014014409.1.

3 討論

我們首先利用東北林蛙轉(zhuǎn)錄組序列獲得了東北林蛙的PDK1全長(rdPDK1)，然后對其序列進(jìn)行分析。其全長為1 990 bp，開放閱讀框1 674 bp，編碼557個氨基酸，氨基酸結(jié)構(gòu)中存在2個保守結(jié)構(gòu)域，1個是位于第443～549個氨基酸的C末端的PH結(jié)構(gòu)域，1個是位于N末端的第82～344個氨基酸STKc激酶結(jié)構(gòu)域。證實(shí)rdPDK1屬于PDK1蛋白家族。

對其進(jìn)行同源性分析，rdPDK1蛋白與人的PDK1蛋白(Homosapiens，HsPDK1)一致率為100%和79%；與原雞的PDK1蛋白(Gallusgallus，GgPDK1)一致率為99%和81%；與家鼠的PDK1蛋白(Musmusculus，MmPDK1)一致性為100%和80%；與野豬的PDK1蛋白(Susscrofa，SsPDK1)一致性為100%和79%。且在進(jìn)行多重序列比對時，rdPDK1的氨基酸與人和鼠的PDK1氨基酸一致性極高，證明在進(jìn)化過程中PDK1蛋白相對保守，并沒有發(fā)生過多的突變。使用MEGA5.1軟件進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)rdPDK1蛋白與XlPDK1、XtPDK1蛋白親緣關(guān)系最近，可見兩棲類動物之間差距較小，與哺乳動物人、黑猩猩等之間的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

自1997年發(fā)現(xiàn)的這個AGC激酶家族的新成員絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1，到目前為止已被公認(rèn)為是一個PI3K信號通路上的一個重要的關(guān)鍵分子，PDK1通過調(diào)節(jié)各種激酶調(diào)控細(xì)胞代謝、細(xì)胞應(yīng)答，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、生存凋亡等功能[21]。在對PDK1的進(jìn)一步研究過程中發(fā)現(xiàn)，PDK1除了可以激活A(yù)kt以外，還可以激活PKA、PKC、p70S6-K、RSK、PAK、PRK等23種下游分子；因PDK1擁有自我磷酸化激活功能，可持續(xù)擁有活性，從而使底物構(gòu)象持續(xù)發(fā)生改變，被磷酸化激活，露出錨定位點(diǎn)，被PDK1捕捉到并與之結(jié)合，增強(qiáng)結(jié)合能力；作為一種適用于遺傳分析的單拷貝基因，在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中已取得了一定的研究成果[6，22]。由于其重要的地位及在各種疾病中的作用，人們越來越關(guān)注對PDK1的研究。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有大量研究顯示，在低溫脅迫下東北林蛙體內(nèi)葡萄糖濃度會大幅度增長，且冬眠恢復(fù)期后生理機(jī)能恢復(fù)正常，無任何病歷產(chǎn)生，如糖尿病等。PDK1是絲氨酸/蘇氨酸Akt被完全激活的首要分子，以至于控制糖原合成激酶GSK3β及糖原合成酶GS的活性，控制葡萄糖代謝。我們希望可以通過我們的實(shí)驗(yàn)來解析兩棲類冬眠期的生理狀態(tài)，為低溫生理學(xué)帶來理論數(shù)據(jù)支持以及可以發(fā)現(xiàn)合理的方式來治療諸如糖尿病等疾病。

[1] Cantrell D A.Phosphoinositide 3-kinase signalling pathways[J].Journal of Cell Science，2001，114(8)：1439 -1445.

[2] 王平章，王欣，羅楹，等.3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1激活A(yù)GC家族激酶的機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21(6)：723-31.

[3] Mora A，Komander D，Van Aalten D M，et al.PDK1，the master regulator of AGC kinase signal transduction[J].Seminars in Cell & Developmental Biology，2004，15(2)：161-170.

[4] 申力，郝友進(jìn)，羅錢春，等.蔥蠅PDK1基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，31(1)：30-36.

[5] Sarbassov D D，Guertin D A，Ali S M，et al.Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex[J].Science，2005，307(5712)：1098-1101.

[6] 李欣.PDK1結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].攀枝花學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31(2)：92-95.

[7] 劉革修.3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1結(jié)構(gòu)和功能[J].生命科學(xué)，2005，17(5)：387-391.

[8] Biondi R M，Cheung P C，Casamayor A，et al.Identification of a pocket in the PDK1 kinase domain that interacts with PIF and the C-terminal residues of PKA[J].The Embo Journal，2000，19(5)：979-988.

[9] Bayascas J R.PDK1：the major transducer of PI 3-kinase actions[M]//Phosphoinositide 3-kinase in Health and Disease.Springer Berlin Heidelberg，2010：9-29.

[10] Dunn E F，Connor J H.Dominant inhibition of Akt/protein kinase B signaling by the matrix protein of a negative-strand RNA virus[J].Journal of Virology，2011，85(1)：422-431.

[11] Stockman B J，Kothe M，Kohls D，et al.Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments[J].Chemical Biology & Drug Design，2009，73(2)：179-188.

[12] Calleja V，Ameer-Beg S M，Vojnovic B，et al.Monitoring conformational changes of proteins in cells by fluorescence lifetime imaging microscopy[J].Biochemical Journal，2003，372(1)：33-40.

[13] 謝鋒，葉昌緩，費(fèi)梁，等.中國東北地區(qū)林蛙屬物種的分類學(xué)研究(兩棲綱：蛙科)[J].動物分類學(xué)報(bào)，1999，24(2)：224-231.

[14] Niu Shudong，Shi Xuecan，Zhang Jingyu，et al.Cloning，characterization，and expression analysis of MyD88 inRanadybowskii[J].Applied Bochemistry and Biotechnology，2016，179(2)：294-306.

[15] 趙文閣.黑龍江省兩棲爬行動物志[M].北京：科學(xué)出版社，2008.

[16] Whittaker K，Koo M S，Wake D B，et al.Global declines of amphibian[J].Encyclopedia of Biodiversity，2013，691-699.

[17] Rohr J R，Raffel T R，Romansic J M，et al.Evaluating the links between climate，disease spread，and amphibian declines[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105(45)：17436-17441.

[18] Xu Kai，Zhu Dongze，Wei Ying，et al.Broad distribution of ranavirus in free-rangingRanadybowskiiin Heilongjiang，China[J].EcoHealth，2010，7(1)：18-23.

[19] Lau M W N，Stuart S N，Chanson J S，et al.Conservation needs of amphibians in China：a review[J].Science in China(Series C：Life Sciences)，2007，50(2)：265-276.

[20] 李秀峰.低溫脅迫下東北林蛙血糖和相關(guān)酶的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2012.

[21] Toker A，Newton A C.Cellular signaling：pivoting around PDK-1[J].Cell，2000，103(2)：185-188.

[22] 李曉艷.神經(jīng)節(jié)苷脂聯(lián)合依達(dá)拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠PI3K、Akt、PDK1和GSK3β蛋白表達(dá)的影響[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2015.

Ranadybowskii；PDK1 gene；Gene cloning；Bioinformatics analysis

Cloning and Bioinformatics Analysis of PDK1 Gene in Rana dybowskii

Gong Shanshan Shao Jie Qu Lili Chai Longhui Zhang Jingyu Xiao Xianghong*

(College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

PDK1 is an important kinase in the PI3K/Akt signal pathway.The PI3K/Akt signal pathway is a conserved pathway in mammals which，by activating downstream factors，regulates the metabolism of sugar，fat，and protein as well as cell differentiation，proliferation，and apoptosis.In this study，we identified three Unigene sequences of PDK1 gene according to the transcriptome database and cloned the full-length cDNA of PDK1 gene by RACE.The full-length cDNA of PDK1 was named rdPDK1. The full-length cDNA sequence was 1 990 bp and the open reading frame was 1 674 bp，which encoded a protein of 557 amino acids.Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by this gene had a relative molecular mass of 63.7 kD and an isoelectric point of 7.21.The amino acids 82 to 344 and 443 to 549 of the protein are two conserved domains STKc and PH，respectively.The identity of RaPDK1 protein with HsPDK1 protein was 79%，and the similarity rate was 100%.The identity of RaPDK1 protein with MmPDK1 protein was 80% and the similarity rate was 100%.The results may provide a basis for the further study of the characterization and function of PDK1 gene inRanadybowskiiPI3K/Akt signal pathway.

2017-03-14

修回日期：2017-05-17

發(fā)表日期：2017-11-10

Q959.5

A

2310-1490(2017)04-641-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31672309)

鞏珊珊，女，26歲，碩士研究生；主要從事野生動物生理生態(tài)學(xué)研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com