耐藥肝癌細(xì)胞p62表達(dá)與順鉑敏感性的關(guān)系

鄭志明，鄒海鵬，林碧華，龍冰清

(1中山市小欖人民醫(yī)院，廣東中山528415；2濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院；3廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；4廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

·論著·

耐藥肝癌細(xì)胞p62表達(dá)與順鉑敏感性的關(guān)系

鄭志明1，鄒海鵬2，林碧華3,4，龍冰清1

(1中山市小欖人民醫(yī)院，廣東中山528415；2濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院；3廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；4廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的觀察順鉑耐藥的肝癌細(xì)胞中p62的表達(dá)情況，及p62基因沉默后耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化。方法培養(yǎng)肝癌親本細(xì)胞HepG2、Huh7，通過(guò)濃度梯度法建立順鉑耐藥細(xì)胞模型，采用Western blotting法檢測(cè)親本HepG2、Huh7細(xì)胞和耐藥HepG2、Huh7細(xì)胞中的p62蛋白。將耐藥HepG2、Huh7細(xì)胞分為沉默組和耐藥組，分別轉(zhuǎn)染p62 siRNA和siRNA Negative Control。在轉(zhuǎn)染48 h后的0、1、2、3、4、5 d測(cè)算沉默組和耐藥組細(xì)胞存活率。轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行Hochest 33258染色觀察沉默組和耐藥組細(xì)胞凋亡核形態(tài)、計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染后48 h采用Western blotting法檢測(cè)沉默組與耐藥組細(xì)胞中的核因子紅細(xì)胞前體2相關(guān)因子2(Nrf2)，RT-PCR法檢測(cè)Nrf2蛋白下游的谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、NADP(H)醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素氧化酶1(HO-1)、多藥耐藥蛋白(Mrp)基因。結(jié)果耐藥的HepG2、Huh7細(xì)胞中p62蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于親本HepG2、Huh7細(xì)胞(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后的0、1、2、3、4、5 d沉默組HepG2、Huh7細(xì)胞存活率低于耐藥組(P均<0.05)。沉默組凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡率均高于耐藥組(P均<0.05)。沉默組細(xì)胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于耐藥組(P均<0.05)。結(jié)論順鉑耐藥的肝癌細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)上調(diào)；p62基因沉默后耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)，其機(jī)制可能與Nrf2及其下游基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

肝癌；肝癌細(xì)胞；耐藥；順鉑；p62；基因沉默；核因子紅細(xì)胞前體2相關(guān)因子2

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，中國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，肝癌發(fā)病率占世界總數(shù)的50.5%，病死率占世界總數(shù)的51.4%[2]。肝癌惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)期療效并不理想[3]?；熓侵委煾伟┑淖钪饕椒ㄖ?，但化療藥物耐藥問(wèn)題成為肝癌治療的瓶頸[4]。尋找肝癌化療耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子，闡明耐藥作用機(jī)制，對(duì)肝癌的治療具有重要意義。p62是一種多功能泛素化接頭蛋白，最早被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[5]。近年來(lái)研究表明，p62在多種腫瘤中異常表達(dá)，如肝癌[6]、胃癌[7]、肺癌[8]、結(jié)腸癌[9]、乳腺癌[10]等，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、抗凋亡等過(guò)程，與腫瘤患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[11,12]。目前關(guān)于p62與肝癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)系報(bào)道較少。本研究觀察了順鉑耐藥的肝癌細(xì)胞中p62的表達(dá)情況，選擇p62基準(zhǔn)值相對(duì)較低的順鉑耐藥肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7，以細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率和耐藥相關(guān)基因表達(dá)作為化療敏感性的指標(biāo)，觀察p62基因沉默后耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化，并探討其相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7均來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室規(guī)范培養(yǎng)保存。順鉑耐藥肝癌細(xì)胞株是本課題組前期經(jīng)過(guò)3個(gè)月小劑量濃度梯度法誘導(dǎo)建立而成，培養(yǎng)過(guò)程中重復(fù)測(cè)定其耐藥性，經(jīng)凍存再?gòu)?fù)蘇后耐藥性質(zhì)穩(wěn)定。順鉑購(gòu)自Selleck公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.05%胰蛋白酶液、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑購(gòu)自Thermofisher Scientific公司。Anti-SQSTM1/p62小鼠單克隆抗體(ab56416)、anti-核因子紅細(xì)胞前體2相關(guān)因子2(Nrf2)兔單克隆抗體(ab62352)、anti-p84兔單克隆抗體(ab131268)購(gòu)自Abcam公司。anti-α-tubulin兔多克隆抗體(11224-1-AP)購(gòu)自Proteintech Group公司。p62 siRNA片段及對(duì)應(yīng)的siRNA Negative Control購(gòu)自Invitrogen公司。Hoechest33258購(gòu)自阿拉丁公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。MTT購(gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green定量PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司。酶標(biāo)儀為Biotek公司產(chǎn)品。CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。Gallios流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 順鉑耐藥肝癌細(xì)胞模型建立及p62蛋白檢測(cè)

電子文檔由于創(chuàng)新性比較強(qiáng)，其保存過(guò)程中一定要注意其密級(jí)的界定，很多研究檔案或者研究數(shù)據(jù)在投放市場(chǎng)涉及科研機(jī)密，管理人員要及時(shí)與資源生產(chǎn)者聯(lián)系，確定使用范圍以及保密期限，方便電子文檔的使用。①對(duì)電子文檔使用范圍進(jìn)行界定，哪些電子文檔資源是可以在本校使用的，哪些是可以在行業(yè)內(nèi)進(jìn)行共享的，都需要與資源擁有者進(jìn)行協(xié)商。②涉及館外人員的電子文檔，在保存和使用中要與當(dāng)事人進(jìn)行協(xié)商，界定可使用的范圍，一方面要盡量保護(hù)讀者的權(quán)益的同時(shí)，也要盡量的保證電子文檔社會(huì)效益的發(fā)揮。

1.2.1 耐藥細(xì)胞模型建立 人肝癌親本細(xì)胞HepG2和Huh7用含10%FBS、1%青霉素+鏈霉素和1%谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用濃度梯度法誘導(dǎo)順鉑耐藥的肝癌細(xì)胞：用初始順鉑濃度0.1 μg/mL處理細(xì)胞后，可觀察細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)衰老，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)新的克隆，使其在0.1 μg/mL順鉑環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)，傳代2次后將順鉑濃度提升至0.15 μg/mL；重復(fù)上述步驟，梯度提高順鉑濃度至細(xì)胞能在1 μg/mL順鉑環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)，總誘導(dǎo)時(shí)間為3個(gè)月。耐藥細(xì)胞在1 μg/mL順鉑環(huán)境下，放入37.0 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

超微粉碎技術(shù)對(duì)靈芝中三萜類成分溶出的影響…………………………………………………… 張福君等（5）：599

1.3 p62基因沉默的耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性觀察

2.3 沉默組與耐藥組凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡率比較 沉默組細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞核固縮碎裂，染色質(zhì)凝集，呈大小不等碎塊狀濃染，耐藥組細(xì)胞核形態(tài)清晰，進(jìn)行正常細(xì)胞有絲分裂。沉默組凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡率均高于耐藥組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表3。

2.1 耐藥肝癌細(xì)胞中p62蛋白的表達(dá)變化 親本HepG2細(xì)胞及耐藥HepG2細(xì)胞中p62蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.25±0.05、0.58±0.16，親本Huh7細(xì)胞及耐藥Huh7細(xì)胞中p62蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.22±0.04、0.52±0.11，耐藥的HepG2、Huh7細(xì)胞中p62蛋白相對(duì)表達(dá)量分別高于親本HepG2、Huh7細(xì)胞(P均<0.05)。

用于評(píng)估被試參加團(tuán)輔的主觀感受，共包括4個(gè)開(kāi)放式題目，分別是參加團(tuán)輔后情緒變化、對(duì)團(tuán)輔內(nèi)容的評(píng)價(jià)、對(duì)自我的認(rèn)識(shí)、對(duì)本次團(tuán)輔的建議.在團(tuán)輔結(jié)束時(shí)進(jìn)行集體施測(cè)，當(dāng)場(chǎng)回收.

1.3.4 Nrf2蛋白及其下游靶基因檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后，采用Western blotting法檢測(cè)Nrf2蛋白。將HepG2、Huh7耐藥組和沉默組細(xì)胞用1×PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min，4 ℃下12 000 g離心，收集上清，按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，加入蛋白變性劑后沸水浴變性蛋白。各組樣品上樣量為30 μg，使用SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)分離蛋白，電濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至0.2 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，加入稀釋的一抗工作液(Anti-SQSTM1/p62小鼠單克隆抗體)，4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST漂洗3次。加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗。滴加新鮮配置的ECL化學(xué)發(fā)光液，在暗室中曝光顯影。用Photoshop軟件分析得到目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值，將二者比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用RT-PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的谷氨酸半胱氨酸合成酶(GCL)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、NADP(H)醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素氧化酶1(HO-1)、多藥耐藥蛋白(Mrp)基因。收集沉默組與耐藥組細(xì)胞，加入1 mL的TRIzol試劑裂解細(xì)胞，采用氯仿萃取異丙醇沉淀提取總RNA。隨后按PrimeScript RT reagent Kit說(shuō)明書(shū)操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；按SYBR Premix Ex Taq Ⅱ Kit說(shuō)明書(shū)操作，GAPDH為內(nèi)參(引物信息見(jiàn)表1)；在CFX96實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR反應(yīng)；以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 Nrf2下游靶基因及內(nèi)參基因引物序列

1.2.2 p62蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)p62蛋白。將HepG2、Huh7細(xì)胞及對(duì)順鉑耐藥的HepG2、Huh7細(xì)胞用1×PBS洗兩次，加入RIPA細(xì)胞裂解液(150 mmol/L NaCl、1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉、0.2%SDS、2%甘油)冰上裂解10 min，4 ℃下12 000 g離心，收集上清，按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，加入蛋白變性劑后沸水浴變性蛋白。各組樣品上樣量為30 μg，使用SDS-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)分離蛋白，電濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至0.2 μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉后，加入稀釋的一抗工作液(Anti-SQSTM1/p62小鼠單克隆抗體)，4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST漂洗3次。加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗。滴加新鮮配置的ECL化學(xué)發(fā)光液，在暗室中曝光顯影。用Photoshop軟件分析得到目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值，將二者比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

但事實(shí)卻是，想象和現(xiàn)實(shí)之間總存在著巨大的鴻溝。在擺弄過(guò)奧迪R8 RWS之后，勞拉表示：“它動(dòng)力強(qiáng)勁，但也一定程度上導(dǎo)致了轉(zhuǎn)向過(guò)度。當(dāng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)向過(guò)度的傾向時(shí)，發(fā)動(dòng)機(jī)的輸出會(huì)有些不太受控制，這一點(diǎn)和普通的奧迪R8完全不同?！绷硪稽c(diǎn)在于，降擋之后，那臺(tái)V10發(fā)動(dòng)機(jī)的轉(zhuǎn)速會(huì)突然飆升，導(dǎo)致車尾在制動(dòng)的過(guò)程中會(huì)突然喪失下壓力，進(jìn)一步增加了轉(zhuǎn)向不足的概率。

2 結(jié)果

1.3.2 細(xì)胞存活率測(cè)算 轉(zhuǎn)染48 h后，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況。將沉默組和耐藥組細(xì)胞消化后接種于96孔培養(yǎng)板中(200 μL，1×103個(gè)細(xì)胞)，全過(guò)程用添加順鉑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日開(kāi)始每天(共5 d)觀察兩組細(xì)胞的存活情況。具體方法：每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加入20 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h后加入160 μL的DMSO(選擇一個(gè)空白孔加入160 μL的DMSO作為空白對(duì)照)；酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(OD值)，根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞生存曲線。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.2 沉默組與耐藥組細(xì)胞存活率比較 轉(zhuǎn)染48 h后的0、1、2、3、4、5 d沉默組HepG2、Huh7細(xì)胞存活率低于耐藥組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

1.3.1 p62基因沉默方法 將耐藥的HepG2、Huh7細(xì)胞分為耐藥組和沉默組。待細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)增殖階段(密度為60%～70%)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，更換新的完全培養(yǎng)基。用Lipofectamine3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，沉默組轉(zhuǎn)染p62 siRNA(終濃度100 nmol/L)，耐藥組轉(zhuǎn)染siRNA Negative Control(終濃度100 nmol/L)。將細(xì)胞放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 凋亡細(xì)胞觀察及凋亡率測(cè)算 采用Hochest33258染色法觀察細(xì)胞凋亡情況。將沉默組和耐藥組細(xì)胞消化后接種于24孔培養(yǎng)板中(1 mL，6×104個(gè)細(xì)胞，板中事先鋪好細(xì)胞爬片)，培養(yǎng)過(guò)夜后棄除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，去除固定液，1×PBS洗兩次；加入0.5 mg/L的Hoechest33258染液避光室溫染色20 min，1×PBS洗兩次，避光風(fēng)干；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，視野中隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核固縮碎裂，染色質(zhì)凝集，呈大小不等碎塊狀濃染)。將沉默組與耐藥組細(xì)胞消化后離心棄上清，1×PBS洗兩次，按每孔106個(gè)細(xì)胞加入500 μL的Binding buffer充分重懸細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC染液混勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μL的PI染液混勻后避光孵育5 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞分析儀測(cè)算兩組細(xì)胞凋亡率。

圖1 轉(zhuǎn)染后0～5 d沉默組與耐藥組細(xì)胞存活率

2.4 沉默組與耐藥組細(xì)胞中Nrf2蛋白及其下游靶基因表達(dá)比較 沉默組細(xì)胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于耐藥組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表4。

3 討論

肝癌是中國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[2]，常規(guī)治療方法為手術(shù)切除，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且晚期肝癌患者不能進(jìn)行手術(shù)，因此化療是目前治療復(fù)發(fā)肝癌及晚期肝癌的首選方案[13～16]。然而，大量臨床實(shí)踐p62攜帶多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，是調(diào)控多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如N端的PB1區(qū)域能夠使其自身寡聚化及多聚化[18]，ZZ鋅指結(jié)構(gòu)可與NF-κB通路關(guān)鍵蛋白相互作用[19]，TBS序列能夠與TRAF6結(jié)合調(diào)控炎癥反應(yīng)[20]，C端的UBA結(jié)構(gòu)域能夠與泛素化蛋白相互作用從而促進(jìn)自噬途徑降解過(guò)程[21]。p62的這些結(jié)構(gòu)域決定了其功能的多樣性，主要涉及細(xì)胞存活、凋亡、選擇性自噬等方面。因此，探討p62在不同模型中的功能及其作用機(jī)制具有重要意義。本研究成功構(gòu)建了對(duì)順鉑耐藥的肝癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于親本細(xì)胞，耐藥細(xì)胞中p62蛋白高表達(dá)，預(yù)示p62在肝癌耐藥性中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染48 h后的0、1、2、3、4、5 d 檢測(cè)細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)沉默組HepG2、Huh7細(xì)胞存活率低于耐藥組細(xì)胞，沉默組凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡率均高于耐藥組細(xì)胞，提示干擾p62能夠增強(qiáng)耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，意味著p62可能在順鉑誘導(dǎo)耐藥過(guò)程中發(fā)揮核心作用，參與肝癌耐藥性的產(chǎn)生。

表2 轉(zhuǎn)染48 h后0～5 d沉默組與耐藥組細(xì)胞存活率比較

注：與耐藥組同類細(xì)胞相比，*P<0.05。

表3 沉默組與耐藥組凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡率比較

注：與耐藥組同類細(xì)胞相比，*P<0.05。表明肝癌細(xì)胞具有強(qiáng)耐藥性，嚴(yán)重影響化療效果[17]。因此，深入探究肝癌細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制，尋找耐藥相關(guān)的治療靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

表4 沉默組與耐藥組細(xì)胞中Nrf2蛋白及其下游靶基因表達(dá)比較

注：與耐藥組同類細(xì)胞相比，*P<0.05。

Nrf2是一個(gè)與腫瘤耐藥相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞的抗氧化應(yīng)答和誘導(dǎo)一系列抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)抗化療藥物在氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，起到保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用[15,22,23]。目前認(rèn)為受Nrf2調(diào)控的靶基因主要有三類：細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡蛋白如GCL和GST，第Ⅱ相解毒酶如NQO1和GST，ATP依賴性耐藥泵基因如Mrps等[22～24]。研究表明，p62在細(xì)胞中的作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Nfr2表達(dá)有關(guān)。而Nrf2被報(bào)道通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活下游基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞耐藥[14,15]。所以我們推測(cè)，p62對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥性的作用可能是通過(guò)調(diào)控Nrf2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，沉默組細(xì)胞中Nrf2蛋白及NQO1、GCL、GST、HO-1、Mrp mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于耐藥組，推測(cè)p62參與肝癌細(xì)胞耐藥可能與調(diào)控Nrf2及其下游基因表達(dá)有關(guān)。有研究表明p62的KIR結(jié)構(gòu)域能與Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷Keap1與Nrf2的相互作用，促使Keap1經(jīng)自噬降解，從而激活Nrf2[13]。關(guān)于本研究中p62具體是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控Nrf2，目前的數(shù)據(jù)不足以說(shuō)明此機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入研究來(lái)證實(shí)。

教師的歷史教學(xué)能力，不僅表現(xiàn)在對(duì)歷史事件與觀點(diǎn)講述上，還體現(xiàn)在對(duì)歷史事件與觀點(diǎn)的論證上。信息技術(shù)的發(fā)展，便于學(xué)生更好的獲取歷史信息，使學(xué)生能夠接觸大量的歷史事件與觀點(diǎn)。在此背景下，教師在完成教授學(xué)生主流歷史觀點(diǎn)任務(wù)后，還應(yīng)該提升自身歷史論證能力。而教師收集、選取史料中，事實(shí)上就是分析、總結(jié)歷史教材，是提升教師歷史論證能力的過(guò)程。在歷史教學(xué)中，教師有效的運(yùn)用史料教學(xué)，能夠體現(xiàn)歷史教學(xué)的魅力，并且還能夠提升歷史教學(xué)質(zhì)量，從而使學(xué)生學(xué)習(xí)到全面的歷史知識(shí)。

綜上所述，順鉑耐藥的肝癌細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)上調(diào)；p62基因沉默后耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)，其機(jī)制可能與Nrf2及其下游基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。p62可能成為逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞順鉑耐藥的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。

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Relationshipbetweenp62expressionincisplatin-resistantlivercancercellsandsensitivitytocisplatin

ZHENGZhiming1,ZOUHaipeng,LINBihua,LONGBingqing

(1XiaolanPeople′sHospitalofZhongshan,Zhongshan528415,China)

ObjectiveTo investigate the expression of p62 in cisplatin-resistant liver cancer cells and the chemotherapeutic sensitivity of p62-silenced cisplatin-resistant liver cancer cells to cisplatin.MethodsHuman liver cancer cell lines HepG2 and Huh7 were used to induce cisplatin-resistant cell lines by slowly increasing cisplatin concentrations. The protein expression of p62 was detected in parental cells and cisplatin-resistant cells by Western blotting. The liver cancer cisplatin-resistant cell lines (HepG2/CDDP and Huh7/CDDP) were divided into the p62-silenced group and cisplatin-resistant group, and were treated by p62 siRNA and siRNA Negative Controls, respectively. After 48-hour transfection, MTT assay was applied to detect cell viability of the two groups at 0, 1, 2, 3, 4, and 5 d. Apoptotic nuclear changes were evaluated with Hochest 33258 staining, and apoptotic cells were quantified. Meanwhile, the apoptosis rate was calculated by Annexin V-FITC/PI flow cytometry at 48 h after transfection. The protein expression of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) and the mRNA expression of its target genes glutamate cysteine ligase (GCL), glutathione S transferase (GST), quinone oxidoreductase 1 (NQO1), glutathione S transferase (GST), heme oxygenase-1(HQ-1) and multidrug resistance-associated protein (Mrp) was evaluated by Western blotting and RT-PCR, respectively.ResultsThe cisplatin-resistant cells (HepG2 and Huh7) expressed much higher protein levels of p62 than their parental cells (allP<0.05). The cell viability of the two groups at 0, 1, 2, 3, 4, and 5 d of the p62-silenced group was lower than that of the cisplatin-resistant cells (allP<0.05), and the apoptosis of cisplatin-resistant group increased as compared with that of the p62-silenced group (allP<0.05). The expression of Nrf2 protein and its target genes NQO1, GCL, GST, HO-1, and Mrp mRNA of the p62-silenced group was lower than that of the cisplatin-resistant group (allP<0.05).ConclusionsThe protein level of p62 is up-regulated in cisplatin-resistant liver cancer cells. Silencing p62 increases the sensitivity of liver cancer cells to cisplatin by down-regulating the expression of Nrf2 and its target genes.

liver carcinoma; liver cancer cells; drug resistance; cisplatin; p62; gene silencing; NF-E2-related factor 2

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.001

R735.7

A

1002-266X(2017)39-0001-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81272434)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(A2016395)；廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目(20172085)；中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B1061)。

鄭志明(1988-)，男，碩士，臨床藥師，主要研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。E-mail: zhiyu06224@163.com

龍冰清(1985-)，女，本科，藥師，主要研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。E-mail: zzm06224@yeah.net

2017-06-29)