下調(diào)LSINCT5對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251增殖、遷移和放療敏感性的影響

馮基高，莫業(yè)和，徐鵬翔，胡德獻，歐陽一彬，劉達遠，張彩彩

(1海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，?？?570311；2海南醫(yī)學院)

下調(diào)LSINCT5對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251增殖、遷移和放療敏感性的影響

馮基高1，莫業(yè)和1，徐鵬翔1，胡德獻1，歐陽一彬1，劉達遠1，張彩彩2

(1海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，?？?570311；2海南醫(yī)學院)

目的觀察下調(diào)LSINCT5對人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251增殖、遷移能力和放療敏感性的影響。方法采用慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定干擾LSINCT5的細胞株(U251 sh LSINCT5細胞)，得到干擾效率高的sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組和轉(zhuǎn)染GV248的對照組細胞進行后續(xù)實驗。采用噻唑藍比色法(MTS)觀察細胞培養(yǎng)0、24、48、72 h時增殖能力變化，劃痕修復實驗觀察細胞遷移能力的變化，Western blotting法檢測細胞中細胞黏附分子(E-cadherin)、緊密連接蛋白-1(Zo-1)、細胞骨架蛋白(Vimentin)表達，MTS法觀察X射線儀下分別照射0、2、4、8 Gy后細胞增殖能力。結(jié)果sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組培養(yǎng)48、72 h時細胞增殖能力均較對照組低(P均<0.05)。sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組細胞的修復距離均較對照組短，P均<0.05。與對照組相比，sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組E-cadherin、Zo-1表達高，Vimentin表達低(P均<0.05)。sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組在2、4 Gy劑量照射時細胞增殖能力均較對照組低(P均<0.05)。結(jié)論下調(diào)人膠質(zhì)瘤細胞系U251中LSINCT5的表達，能抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移，并增強細胞放療敏感性。

長鏈非編碼RNA LSINCT5；膠質(zhì)瘤；細胞增殖；細胞遷移；上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；放療敏感性

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的50%～60%[1]。腦膠質(zhì)瘤的惡性程度高，具有高度的侵襲、遷移及增殖能力，尤其是高級別膠質(zhì)瘤，單純手術(shù)往往難以到達滿意療效，常需術(shù)后對患者輔以放療，以降低復發(fā)率、提高遠期生存率[2]。但放療存在很大的個體差異，且隨著時間延長，癌組織可發(fā)生放療抵抗，導致放療失敗。因此，如何提高膠質(zhì)瘤的放療敏感性，是臨床工作中面臨的重要問題。長鏈非編碼RNA(lncRNA)家族是近年新發(fā)現(xiàn)的重要的表觀調(diào)控因子，與惡性腫瘤有緊密聯(lián)系。LSINCT5作為lncRNA中的一員，已被發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，并與患者的臨床表現(xiàn)及腫瘤細胞的生物學效應有著密切的關(guān)系[3～5]。2014年6月～2016年9月，本研究通過體外實驗的方法，探討下調(diào)人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251中LSINCT5的表達對細胞生物學效應和放療敏感性的影響，為揭示人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的確切機制及其臨床診治工作提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細胞系U87、U251、U373、A172、SHG44、U118、U138、T98G及人胚腎細胞293T均來自中國醫(yī)學科學院研究中心。膠質(zhì)瘤細胞系培養(yǎng)采用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS，Hyclone)，293T細胞系培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS，均于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 高表達LSINCT5細胞系篩選 采用RT-PCR法。采用RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code No. 9108)分別抽提細胞總RNA，超微量分光光度計(NanoDrop2000)檢測RNA濃度。取5 μg RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)，采用SYBR Green熒光實時定量PCR反應體系(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)檢測其表達水平。熒光定量PCR儀(ABI 7500)進行反應分析，反應條件：預變性94 ℃ 4 min，擴增條件為94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。LSINCT5上游引物:CAGGTTGCTGATGTCCTTGG，下游引物：ACCCAGAGAACATCAGACTTCA，擴增引物大小為173 bp。以β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列：TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物序列：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA，片段大小為186 bp。采用2-ΔΔCt法計算LSINCT5相對表達量。U251細胞系LSINCT5相對表達量(2.300±0.407)高于U87(1.006±0.309)、U373(1.112±0.184)、A172(0.460±0.170)、SHG44(0.767±0.104)、U118(1.456±0.161)、U138(0.314±0.130)、T98G(0.799±0.179)，P均<0.05。選擇U251進行下述試驗。

1.3 U251 sh LSINCT5細胞的構(gòu)建 ①慢病毒包裝：接種293T細胞于6孔板，待細胞融合度80%左右，將packing質(zhì)粒(psPAX2，1.5 μg/皿)、envelop質(zhì)粒(pMD2.G，1.5 μg/皿)及4 μg目的質(zhì)粒與10 μL Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific)轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫放置20 min。同時無血清DMEM處理293T細胞，將混合液均勻滴入細胞中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)8 h，更換DMEM+10%FBS培養(yǎng)。48、72 h后收集上清液并用0.45 μm濾器過濾。②慢病毒感染：接種U251細胞于6孔板，待細胞融合度40%左右，RPMI1640+10% FBS與病毒懸液2∶1培養(yǎng)細胞，同時加入3 μL Polubrene，重復感染2 d，1 μg/mL puromycin篩選細胞至細胞生長狀態(tài)良好。實驗分為sh LSINCT5 1#、2#、3#、4#組及對照組，分別插入如下序列，sh LSINCT5 1#：TGGGTCTATTTCTGTCCTTTCTGGT；sh LSINCT5 2#：ATCAATACAGTCAGCACTGAATCTT；sh LSINCT5 3#：TGGCTTTGGAGCTGGAGGAGACAGCG；sh LSINCT5 4#：GCTCTTGCCTGCTGAGTGGAAAGATC；GV248：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA。質(zhì)粒構(gòu)建具體步驟參見文獻[6]。細胞系篩選完成后收集細胞系RNA并保種，通過RT-PCR技術(shù)觀察干擾效果。sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組LSINCT5相對表達量分別為0.127±0.006、0.134±0.025，干擾效率均在70%以上，低于對照組(1.200±0.092)，P均<0.05。選取sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞增殖活力觀察 采用噻唑藍比色法(MTS)法。將對數(shù)生長期對照組、sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組細胞以1 000個細胞每孔的細胞密度接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液(設置5個平行孔)，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，在0、24、48、72 h時將MTS溶液(Promega)與培養(yǎng)基以1∶5的比例混合均勻，替換舊培養(yǎng)基避光培養(yǎng)1 h，多孔板酶標儀檢測490 nm處吸光度，以吸光度值代表細胞增殖活力。

1.5 細胞遷移能力觀察 采用劃痕修復實驗。培養(yǎng)對數(shù)生長期的上述3組細胞于6孔板中，待細胞長滿后使用滅菌100 μL一次性移液槍頭垂直水平面在細胞中進行劃痕，每孔5條，PBS小心沖洗細胞3次后，加入無血清培養(yǎng)基，于0、24 h顯微拍照觀察劃痕修復程度。

1.6 細胞中細胞黏附分子(E-cadherin)、緊密連接蛋白-1(Zo-1)、細胞骨架蛋白(Vimentin)表達檢測 采用Western blotting法。收集對數(shù)生長期細胞，加入胰酶消化，離心棄上清，PBS洗滌。加入300 μL IP裂解液與10 μL蛋白酶抑制劑，置離心管中，冰上裂解90 min，最大轉(zhuǎn)速4 ℃，15 min離心提取蛋白質(zhì)，BCA法行蛋白定量(Pierce Chemical)分析并根據(jù)各蛋白濃度將不同細胞株蛋白量調(diào)至一致。配制10%丙烯酰胺膠，待膠凝固后上樣，80 V穩(wěn)壓跑膠30 min，120 V穩(wěn)壓跑膠1 h，濕轉(zhuǎn)至PVDF(Millpore)膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光液曝光顯影。一抗E-cadherin抗體(Abcam，ab15148)、Zo-1抗體(Abcam，ab59720)、Vimentin抗體(Abcam,ab92547)、β-actin抗體(santa cruz，sc-4778)濃度比為1∶1 000，以β-actin作為內(nèi)參，二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L(FITC，ab6785)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor?488，ab150077)，濃度比為1∶2 000，ImageLab軟件進行灰度掃描，以灰度值表示蛋白濃度。

1.7 細胞放射敏感性觀察 將對數(shù)生長期上述3組細胞以4×103/孔接種至96孔板中，在X射線儀下分別照射0、2、4、8 Gy，過程中無菌操作，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h左右，MTS法檢測細胞增殖能力。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 見表1。

表1 各組細胞增殖能力比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 各組細胞遷移能力比較 sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組細胞的修復距離分別為(0.381±0.226)、(0.745±0.262)mm，均短于對照組的(1.470±0.435)mm，P均<0.05。

2.3 各組細胞E-cadherin、Zo-1、Vimentin表達比較 見表2。

表2 各組細胞E-cadherin、Zo-1、Vimentin表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.4 各組細胞放射敏感性比較 見表3。

表3 各組細胞放射敏感性比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

lncRNA是長度超過200 nt的非編碼RNA(ncRNA)，和眾多ncRNA一樣缺少開放閱讀框，不參與蛋白質(zhì)的翻譯，近年來發(fā)現(xiàn)其可通過多種表觀遺傳調(diào)控機制發(fā)揮生物學作用，包括染色質(zhì)重塑、細胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控及RNA降解等[7]。由于lncRNA數(shù)量龐大及功能廣泛，其與腫瘤的關(guān)系也逐步引起重視。LSINCT5是lncRNA家族中的成員之一，基因位于5p15.33染色體上，長度為2.6 kb[8]。有研究顯示，LSINCT5在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤中高表達，且可通過多種機制在惡性腫瘤細胞中發(fā)揮促細胞增殖、轉(zhuǎn)移及抗凋亡等生物學作用，包括促進抗凋亡因子核旁斑點結(jié)構(gòu)蛋白1及凋亡因子Caspase-3的表達[9～11]，其中細胞凋亡是影響惡性腫瘤細胞放化療敏感性的關(guān)鍵因素[12]。基于上述研究，本實驗擬探究LSINCT5對膠質(zhì)瘤細胞生物學效應的影響及其與膠質(zhì)瘤放療抵抗的關(guān)系。

膠質(zhì)瘤中以膠質(zhì)母細胞瘤及星型膠質(zhì)瘤最為常見，其中膠質(zhì)母細胞瘤及多種間變性星型膠質(zhì)瘤在WHO的分級中均屬于高級別膠質(zhì)瘤，其惡性程度高，局部浸潤能力強，膠質(zhì)母細胞瘤患者平均生存期僅1年左右，5年生存率低于3.3%。目前膠質(zhì)瘤主要采用手術(shù)治療[13]，但由于腦組織本身結(jié)構(gòu)疏松，且多數(shù)膠質(zhì)瘤惡性程度高，腫瘤浸潤生長，與腦組織分界不清，除少數(shù)患者瘤體部位較好、體積小、惡性程度低外，大部分患者難以做到手術(shù)全部切除，故臨床中往往術(shù)后配合放療或化療等，以延緩膠質(zhì)瘤的復發(fā)，延長患者生存期。放療雖然可在短時間內(nèi)縮小腫瘤體積，但隨著放療劑量的累積，未被射線殺死的膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)發(fā)生“4R”，即放射損傷修復、再氧合作用、細胞周期的再分布及細胞再增生[14]，成為放射抵抗細胞，最終導致放療失敗、腫瘤復發(fā)。許多針對腫瘤細胞放療抵抗的研究顯示，放療抵抗的發(fā)生與許多調(diào)控表觀遺傳的分子聯(lián)系緊密，其中就包括lncRNA。徐小雯等[15]在HT29、SW480、RKO、Lovo和HCT116結(jié)直腸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)3種與放療敏感性密切相關(guān)的lncRNA，包括NR_05532、NR_015441和NR_033374，其基因表達水平與細胞放療抵抗呈正相關(guān)。Jing等[16]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR在宮頸癌細胞中可促進細胞的增殖轉(zhuǎn)移能力，還可以通過影響p21基因的表達誘導宮頸癌細胞的抗輻射能力。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ROR可通過p53/miR-145途徑促進結(jié)直腸癌細胞放療抵抗的發(fā)生。

E-cadherin的減少或缺失是EMT最主要的標志性變化，它是細胞間連接黏附的重要分子，并參與維持細胞極性。許多研究顯示，E-cadherin的下調(diào)與癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系[18]。Zo-1在細胞中起到封閉細胞間間隙的作用，其下調(diào)可導致細胞間緊密連接的中斷，從而促進癌細胞的擴散[19]。Vimentin是成纖維細胞中等纖維的主要成分之一，其表達上調(diào)往往意味著細胞具有發(fā)生EMT的傾向[20]。本研究結(jié)果表明，sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組在48、72 h時細胞增殖能力及細胞修復距離均較對照組低，且與對照組相比，sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組E-cadherin、Zo-1表達高，Vimentin表達低；顯示干擾LSINCT5的表達后，U251的增殖、遷移能力下降，E-cadherin、Zo-1表達上調(diào)，且Vimentin表達下調(diào)。提示LSINCT5可能通過促進膠質(zhì)瘤細胞EMT過程，促進細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sh LSINCT5 1#組、sh LSINCT5 3#組在2、4 Gy劑量照射時細胞增殖能力均較對照組低。可見，U251 sh LSINCT5細胞放射敏感性明顯增強，提示LSINCT5可能參與膠質(zhì)瘤放療抵抗形成的過程。

綜上可見，下調(diào)人膠質(zhì)瘤細胞系U251中LSINCT5的表達，能抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移，并增強細胞放療敏感性。接下來的研究中，我們將通過體內(nèi)實驗進一步確認LSINCT5的促癌效應，并對其可能存在的相互作用分子進行深入探究，確定其可能的靶標分子，為人腦膠質(zhì)瘤的臨床診治提供新的依據(jù)。

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Effectofdown-regulationofLSINCT5onproliferation,migration,andradiosensitivityofhumangliomacelllineU251

FENGJigao1,MOYehe,XUPengxiang,HUDexian1,OUYANGYibin,LIUDayuan,ZHANGCaicai

(1TheSecondAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570311,China)

ObjectiveTo investigate the effect of down-regulation of LSINCT5 on proliferation, migration ability, and radiosensitivity of human glioma cell line U251.MethodsLentiviral transfection was used to construct stable LSINCT5 interference cells (U251 shLSINCT5 cells), and the cells in the sh LSINCT5 1# group and sh LSINCT5 3# group with high efficiency of interference and the cells in the control group (transfected with GV248) were used for the subsequent experiments. MTS method was used to detect the changes of cell proliferation abilities at 0, 24, 48, and 72 h. Scratch healing assay was used to detect the changes of cell migration abilities. Western blotting was used to detect the expression of E-cadherin, Zo-1 and Vimentin. MTS assay was used to detect the changes of cell proliferation abilities at 0, 2, 4, 8 Gy under X-ray.ResultsThe proliferation abilities of the sh LSINCT5 1# group and sh LSINCT5 3# group were significantly lower than that of the control group at 48 and 72 h (allP<0.05). The repair distance of the sh LSINCT5 1# and sh LSINCT5 3# groups were significantly lower than that of the control group (P<0.05). Compared with the control group, the expression levels of E-cadherin and Zo-1 in the sh LSINCT5 1# group and sh LSINCT5 3# group increased, and the expression of Vimentin decreased (allP<0.05). The proliferation abilities of sh LSINCT5 1# group and sh LSINCT5 3# group were lower than that of the control group at 2 and 4 Gy doses (bothP<0.05).ConclusionDown-regulation of LSINCT5 expression in human glioma cell line U251 can inhibit cell proliferation and metastasis, and increase radiosensitivity of cells.

long non-coding RNA LSINCT5; glioma; cell proliferation; cell migration; epithelial mesenchymal transition; radiosensitivity

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.008

R739.41

A

1002-266X(2017)38-0027-04

馮基高(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為神經(jīng)外科相關(guān)疾病的診斷和治療。E-mail: gaoxingf2016@163.com

張彩彩(1983-)，女，博士，講師，主要研究方向為神經(jīng)生物學。E-mail: olderfeng@163.com

2017-04-03)