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    響應(yīng)面優(yōu)化塔拉種子多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究

    2017-11-11 06:24:25趙寒梅袁德成楊逢建
    植物研究 2017年4期
    關(guān)鍵詞:塔拉自由基多糖

    趙寒梅 袁德成 楊逢建

    (東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

    響應(yīng)面優(yōu)化塔拉種子多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究

    趙寒梅 袁德成 楊逢建*

    (東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

    為獲得塔拉多糖超聲波提取的最佳工藝,利用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法,獲得多元二次線性回歸方程,以多糖提取率為響應(yīng)值做響應(yīng)面。并考察塔拉多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:塔拉多糖的最佳提取工藝條件為,超聲輔助提取超聲功率363 W,超聲溫度56℃,超聲時(shí)間23 min,料液比1∶17(g·mL-1),塔拉粗多糖的最大提取率(25.56%)與理論推測(cè)值(25.71%)相差較小。經(jīng)純化后塔拉多糖提取率為17.82%。以VC為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)不同純度的塔拉多糖進(jìn)行抗氧化性的研究,發(fā)現(xiàn)其純度越高,對(duì)ABTS自由基的清除能力越強(qiáng)。

    塔拉多糖;提??;響應(yīng)面法;抗氧化性

    塔拉(Caesalpiniaspinosa)屬豆科(Leguminosae)植物。其豆莢富含沒(méi)食子單寧50%~60%(干基計(jì)),是生產(chǎn)醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的重要原料[1]。它的種子即塔拉豆,其重量約占?xì)飧晒v的35%,塔拉豆內(nèi)含一層較厚的內(nèi)胚乳層,又稱塔拉膠,其主要成分為雜多糖,主要作為乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、改性劑及醫(yī)藥佐劑,可廣泛用于紡織、醫(yī)藥、石油,尤其是食品工業(yè)中。是我國(guó)作為單寧植物資源從南美洲引種栽培的經(jīng)濟(jì)植物。塔拉干果殼經(jīng)粉碎制成的塔拉粉是重要的化工原料,可用于生產(chǎn)塔拉單寧酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸和抗菌素增效劑等多種化工、醫(yī)藥產(chǎn)品[2]。

    目前,在塔拉多糖研究領(lǐng)域,文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少,塔拉多糖的分離純化是研究其理化性質(zhì)、生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),多糖的純化是其精制過(guò)程中非常重要的一步。本文采用超聲波法輔助提取[3~5]塔拉多糖,相較于熱水浸提和冷漬提取,提取率較高,也對(duì)其抗氧化性進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn),希望為塔拉多糖的多領(lǐng)域充分利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

    材料及試劑:塔拉豆,石油醚沸點(diǎn)(60~90℃)、無(wú)水乙醇、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸、ABTS、過(guò)硫化鉀、VC等均為分析純。

    儀器:臺(tái)式數(shù)控超聲波、電子天平、多功能粉碎機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、冰箱、電熱恒溫水浴鍋、磁力攪拌器、高速離心機(jī)、紫外可見分光光度計(jì)。

    1.2 塔拉粗多糖的提取

    1.2.1 塔拉種子的預(yù)處理

    塔拉種子經(jīng)55℃烘箱烘干48 h,粉碎過(guò)40目篩,再55℃烘干48 h,以1∶14的比例經(jīng)石油醚脫脂,連續(xù)3次,每次24 h,讓脫脂的塔拉粉末自然干燥,然后置于55℃烘箱中備用。

    1.2.2 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

    準(zhǔn)確稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖10.0 mg,置100 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,分別置于10 mL具塞試管中,加入蒸餾水補(bǔ)至2 mL,然后再加入6%苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0 mL。搖勻,沸水浴加熱20 min后,在冷水中冷卻至室溫。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。同時(shí)用2.0 mL蒸餾水做空白對(duì)照。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=14.986x-0.280 31,R2=0.994。

    采用苯酚—硫酸法[6~8],用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,通過(guò)所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[9~10]計(jì)算出多糖的含量,根據(jù)下式計(jì)算多糖得率:

    多糖得率%=比色皿測(cè)定濃度×樣品稀釋倍數(shù)×樣品溶液體積/試驗(yàn)樣品質(zhì)量×100

    (1)

    實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量式中:比色皿測(cè)定的多糖質(zhì)量濃度(mg·mL-1);樣品溶液稀釋倍數(shù)為125;樣品溶液體積為25 mL;實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量為4.0 g。

    1.2.3 多糖提取率

    以多糖提取率為指標(biāo),用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物,采用苯酚—硫酸法,在490 nm處測(cè)吸光度,得回歸方程y=14.986x-0.280 31,R2=0.994,通過(guò)回歸方程及測(cè)得的吸光度計(jì)算多糖得率。

    1.2.4 超聲輔助提取塔拉粗多糖

    準(zhǔn)確稱取塔拉粉末1.0 g,置于50 mL具蓋離心管中,在不同提取功率、提取溫度、提取時(shí)間、料液比的條件下進(jìn)行單次提取實(shí)驗(yàn),提取完成后在5 000 r·min-1的高速離心機(jī)中離心10 min,取上清,以4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉24 h,再5 000 r·min-1,離心5 min,取上清,棄沉淀,用苯酚—硫酸法測(cè)定粗多糖得率,選擇得率較高的3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

    1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

    為了更進(jìn)一步研究塔拉粗多糖提取過(guò)程中諸多因素之間的關(guān)系,根據(jù)超聲輔助提取的4組單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理選取超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間、液料比4個(gè)因素3個(gè)水平應(yīng)用響應(yīng)面[11~12]分析方法進(jìn)行單次工藝參數(shù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),最大程度的對(duì)塔拉籽粉進(jìn)行粗多糖提取。

    表1塔拉多糖提取實(shí)驗(yàn)因素與水平

    Table1Variablesandlevelsinresponsesurfacedesign

    因素ElementA提取功率Extractionpower(W)B提取溫度Extractiontemperature(℃)C提取時(shí)間Extractiontime(min)D料液比Materialliquidratio(g·mL-1)水平Level-130050151∶10035055201∶15140060251∶20

    1.2.6 塔拉多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用

    塔拉多糖可以通過(guò)捕捉脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的ROS,減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈長(zhǎng)度、阻斷或減緩脂質(zhì)過(guò)氧化的進(jìn)行,達(dá)到對(duì)ROS的直接清除作用;通過(guò)與產(chǎn)生ROS所必需的金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用,對(duì)ROS起間接清除作用,多糖環(huán)上的OH可與產(chǎn)生OH·等所必需的金屬離子絡(luò)合,使其不能產(chǎn)生啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化的OH·或使其不能分解脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的脂過(guò)氧化物,從而抑制ROS的產(chǎn)生;塔拉多糖還可通過(guò)提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性,從而發(fā)揮抗氧化的作用。

    取30 mg ABTS用7.35 mL蒸餾水溶解,配成濃度為7.4 mmol·L-1的ABTS儲(chǔ)備液。取10 mg K2S2O2用14.3 mL蒸餾水溶解,配成濃度為2.6 mmol·L-1的K2S2O2儲(chǔ)備液。取0.2 mL ABTS儲(chǔ)備液和0.2 mL K2S2O2儲(chǔ)備液混合,室溫條件下避光放置12 h,用蒸餾水稀釋40~50倍,在734 nm處測(cè)吸光度為0.7左右,即為ABTS+工作液。

    取4 mL ABTS+工作液和1 mL無(wú)水乙醇混合均勻,振搖10 s,靜置5 min后在734 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)0。取4 mL ABTS+工作液和1 mL多糖樣品混合均勻,振搖10 s,靜置5 min后在734 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)。

    純化前和純化后的多糖樣品的質(zhì)量濃度都分別4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定塔拉多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力。

    Y(%)=[(A0-A)/A0〗×100%

    (2)

    式中:Y為ABTS自由基清除率(%);A0為空白樣品的吸光度;A為不同質(zhì)量濃度的被測(cè)混合物的吸光度。

    50%抑制濃度IC50可通過(guò)自由基清除活性—樣品濃度的線性關(guān)系求出。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 塔拉多糖得率回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

    按照Box-Behnken試驗(yàn)方案進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn),結(jié)果見表2。將所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合[13],得到以多糖得率(Y)為目標(biāo)。

    表2 塔拉多糖Box-Behnken提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

    函數(shù)的二次回歸方程:多糖得率對(duì)超聲功率A、超聲溫度B、超聲時(shí)間C和水料比D的二次多項(xiàng)回歸方程:

    Y(%)=25.06+1.97A+0.72B-0.13C-1.02D+2.17AB-3.01AC+1.27AD+1.56BC-1.51BD+2.47CD-4.51A2-4.21B2-2.45C2-2.46D2

    (3)

    式中的超聲功率A、超聲溫度B、超聲時(shí)間C和料液比D在設(shè)計(jì)中均經(jīng)量綱線性編碼處理,因此方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各因素對(duì)指標(biāo)值的影響程度,系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。

    表3 方差分析

    注:*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)

    Note: *significant difference(P<0.05); **extremely significant difference(P<0.01)

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化的交互作用

    通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到各因素之間交互作用的三維立體圖,提取功率、溫度、時(shí)間、料液比的交互作用如圖1所示。

    從圖1a可知多糖得率隨超聲溫度和超聲功率的提高呈先上升后下降的趨勢(shì),二者交互作用明顯,溫度越高分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度越快,多糖的析出速度越快,但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)多糖分子解構(gòu),從而得率降低,超聲功率越大對(duì)細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破壞作用越強(qiáng),隨著溫度的升高,多糖的析出越快,當(dāng)多糖完全從細(xì)胞中溶出后超聲功率越大對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)的破壞力也隨之越大,從而降低了多糖得率。

    從圖1b可知多糖得率隨超聲功率和超聲時(shí)間的增大成先上升后下降的趨勢(shì),二者有交互作用,水料比一定時(shí),在高溫區(qū)和低溫區(qū)的多糖得率較低,主要是因?yàn)闇囟鹊纳呤沟梅肿咏飧胶蛿U(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快,從而提高了多糖的析出速率和得率,水料比的增大,使得多糖的濃度更低,更容易從細(xì)胞中溶出。

    圖1 塔拉多糖超聲提取的響應(yīng)曲面圖 a.溫度和功率的交互作用;b.時(shí)間和功率的交互作用;c.料液比和溫度的交互作用;d.時(shí)間和溫度的交互作用Fig.1 Tarapolysaccharide response surface mapping for ultrasonic extraction a. Temperature and power; b. Time power interaction; c. Material liquid than and temperature interaction; d. Time and temperature interactions

    從圖1c可知多糖得率隨料液比和超聲溫度的提高成先上升后下降的趨勢(shì),且二者有明顯的交互作用。水料比一定時(shí),在高溫區(qū)和低溫區(qū)的多糖得率較低,這主要是因?yàn)闇囟鹊纳呤沟梅肿咏飧胶蛿U(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快,從而提高了多糖的析出速率和得率,而溫度過(guò)高可能會(huì)影響破壞多糖結(jié)構(gòu),降低得率。水料比的增大,使得多糖的濃度更低,更容易從細(xì)胞中溶出。

    從圖1d可知,多糖得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的提高呈先上升后下降的趨勢(shì),且二者有明顯的交互作用。根據(jù)提取動(dòng)力學(xué)理論,時(shí)間的延長(zhǎng)有助于多糖的充分?jǐn)U散析出,同時(shí)溫度的升高使得分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快,多糖的析出速率和得率提高,因此適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間和提高溫度有助于提高多糖得率。而溫度過(guò)高可能會(huì)影響破壞多糖結(jié)構(gòu),降低得率。

    2.3 塔拉多糖最佳提取條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    在選取的各因素范圍內(nèi),根據(jù)回歸模型通過(guò)Design Expert軟件分析得出,塔拉多糖最佳提取條件為超聲功率363.94 W、超聲溫度56.27℃、超聲時(shí)間23.26 min、料液比1∶16.93,多糖的率的預(yù)測(cè)值為25.71%,考慮到實(shí)際操作會(huì)出現(xiàn)誤差影響,確定塔拉多糖的超聲提取條件為超聲功率363 W、超聲溫度56℃、超聲時(shí)間23 min、料液比1∶17,結(jié)果塔拉多糖的得率為25.56%,與預(yù)測(cè)值相差很小說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合較好,充分驗(yàn)證了所建模型的正確性,說(shuō)明響應(yīng)曲面法適用于對(duì)塔拉多糖的超聲波提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

    2.4 塔拉多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用

    由圖2可以看出,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,塔拉多糖對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力。當(dāng)提純后的塔拉多糖質(zhì)量濃度0.125 mg·mL-1時(shí),對(duì)ABTS自由基的清除率為17.76%,而提純前的僅為12.11%,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,對(duì)ABTS自由基的清除作用增加,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0.125~4 mg·mL-1范圍內(nèi)增加時(shí),呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)[14~15],當(dāng)提純后塔拉多糖質(zhì)量濃度為4 mg·mL-1時(shí),對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)到96.98%,而提純前的僅為52.09%。同時(shí),塔拉多糖對(duì)ABTS自由基清除能力IC50為3.25 mg·mL-1。由此可見,塔拉多糖可以做抗氧化劑,且多糖純度越高,對(duì)ABTS自由基的清除作用越顯著[16~17]。

    圖2 塔拉多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.2 Tara polysaccharide scavenging effect on ABTSfree radical

    3 結(jié)論

    利用軟件Design Expert進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用響應(yīng)曲面法建立塔拉多糖提取工藝條件的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,對(duì)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析。結(jié)果表明,模型擬合程度高,實(shí)驗(yàn)誤差小,最佳的提取工藝條件為超聲功率363 W,超聲溫度56℃,超聲時(shí)間23 min,料液比1∶17(g·mL-1),此工藝條件的多糖得率為25.56%,與預(yù)測(cè)值相差較小。經(jīng)純化后塔拉多糖提取率為17.82%,純度為69.72%。以VC為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)不同純度的塔拉多糖進(jìn)行抗氧化性的研究,發(fā)現(xiàn)其純度越高,對(duì)ABTS自由基的清除能力越強(qiáng)。因此,塔拉多糖作為一種天然的具有抗氧化活性的物質(zhì),可進(jìn)一步開發(fā)為天然無(wú)副作用的保健品、藥物,還可廣泛用于紡織、醫(yī)藥、石油,尤其是食品工業(yè)中。

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    Forestry Public Welfare Industry Research Special(201404616)

    introduction:ZHAO Han-Mei(1992—),female,graduate student,Study on plant resources.

    date:2017-02-05

    OptimizationofUltrasonicExtractionofPolysaccharidesfromTaraSeedandItsAntioxidantActivity

    ZHAO Han-Mei YUAN De-Cheng YANG Feng-Jian*

    (Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

    For the optimum ultrasonic extraction of Tara polysaccharide,a multiple quadratic regression was stablished using a 4-factor, 3-level Box-Behnken statistical design, and the response surface with the extraction rate of polysaccharides as the response were drawn. The antioxidant activities of Tara polysaccharide invitrowere tested. Theoptimumextractionconditions of Tara polysaccharide were: ultrasonic treatment at 56℃ for 23 min with ultrasonic power 363 W, and material to liquid ratio of 1∶17 g·mL-1. The maximum extraction rate of Tara crude polysaccharides was 25.56%, less than the theoretical deduced value of 25.71%.The purified Tara polysaccharide extraction rate was 17.82%.Using VC as a positive control, the antioxidant activity of different purity Tara polysaccharide was measured, and it was found that its purity was high, and the ABTS radical scavenging ability was stronger.

    Tara polysaccharide;extraction;response surface analysis methodology(RSM);antioxidant activity

    林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404616)

    趙寒梅(1992—),女,碩士研究生,主要從事植物資源學(xué)的研究。

    * 通信作者:E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

    2017-02-05

    * Corresponding author:E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

    Q949.751.9

    A

    10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.021

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