甘薯MADS-box轉錄因子IbMADS11-Like的克隆及脅迫響應分析

談傳婷 宋煒涵 朱明庫 徐 濤 董婷婷 李宗蕓

(江蘇師范大學生命科學學院，徐州 221116)

甘薯MADS-box轉錄因子IbMADS11-Like的克隆及脅迫響應分析

談傳婷 宋煒涵 朱明庫 徐 濤 董婷婷*李宗蕓

(江蘇師范大學生命科學學院，徐州 221116)

MADS-box蛋白在植物生長發(fā)育及抗逆等過程中均發(fā)揮重要功能。本實驗室根據(jù)甘薯近緣野生種I.trifida基因組序列，在甘薯栽培種徐薯22(Ipomoeabatatas(L.) Xu22)中克隆到一個STMADS11亞家族MADS-box基因，命名為IbMADS11-Like。實時定量RT-PCR分析表明，IbMADS11-Like基因在甘薯根中大量表達，并且隨著塊根的形成和膨大表達量逐漸降低，表明該基因可能參與了甘薯塊根的發(fā)育過程。脅迫處理分析表明，IbMADS11-Like基因的表達受干旱、鹽和高溫的誘導，而低溫則抑制其表達。此外，IbMADS11-Like基因對ABA、IAA、ZT、BR、ACC、JA及GA等激素的處理也有不同程度的響應，暗示IbMADS11-Like基因可能參與了甘薯生長發(fā)育及脅迫的調控過程。這些結果為進一步分析IbMADS11-Like基因在甘薯塊根發(fā)育和脅迫響應中的功能奠定了基礎。

MADS-box蛋白；IbMADS11-Like；轉錄因子；克?。环巧锩{迫；甘薯

MADS-box蛋白是一類廣泛存在于真核生物中的轉錄因子，在N端存在一段高度保守的DNA結合域，稱為MADS(MCM1,AG,DEF and SRF)結構域[1]。植物中的MADS-box蛋白大多為MIKC型MADS-box蛋白，這種蛋白除了MADS結構域外還含有I結構域、K結構域和C結構域[2]。

MIKC型MADS-box蛋白在植物中主要參與花器官的建成[3]、開花時間[4]和果實成熟[5]等生殖生長發(fā)育過程。研究表明MIKC型MADS-box蛋白在植物的營養(yǎng)生長過程中也發(fā)揮了重要作用[6]。SQUA(SQUAMOSA)亞家族MADS-box基因在植物的花器官和營養(yǎng)組織中都大量表達。例如，馬鈴薯POTM1(potatoMADS-box1)基因在花分生組織和營養(yǎng)器官中大量表達，沉默該基因導致馬鈴薯塊莖產(chǎn)量降低、側芽生長增強[7]。AGL17亞家族MADS-box基因在營養(yǎng)器官中特異表達。例如，擬南芥ANR1基因在根中大量表達，參與側根的生長發(fā)育，并且調控根對硝酸鹽的吸收過程[8]。STMADS11亞家族基因也在促進植物營養(yǎng)生長過程發(fā)揮重要作用。例如，馬鈴薯STMADS11和STMADS16基因都促進了植物的營養(yǎng)生長過程[9～10]。

近年來，有報道表明MADS-box蛋白也參與了植物脅迫和激素響應過程。2008年，Lee[11]和Khong[12]的研究表明，AGL12亞家族MADS-box基因OsMADS26與水稻生物脅迫和非生物脅迫響應密切相關，降低該基因的表達，水稻對干旱和病原菌的抗性增強。Arora等[13]的研究也表明，水稻OsMADS18、OsMADS22、OsMADS26和OsMADS27基因在低溫和干旱處理中上調表達至少2倍，而OsMADS2、OsMADS30和OsMADS55基因在干旱和鹽脅迫條件下調表達。Lee[14]和Duan[15]的結果顯示，STMADS11亞家族基因OsMADS22、OsMADS47和OsMADS55都是油菜素內酯(BR)信號途徑的負調控因子。

甘薯(Ipomoeabatatas(L.) Lam.)是世界上重要的糧食、蔬菜、飼料、工業(yè)原料和生物能源作物，在我國的糧食安全中發(fā)揮著重要作用。目前，甘薯因其特有的根形態(tài)特征及其抗旱耐鹽的生理特征，已成為塊根發(fā)育及抗逆研究的重要植物。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，已從甘薯中克隆了一些MADS-box基因。2002年，Kim等[16]在甘薯中克隆到兩個STMADS11亞家族MADS-box基因IbMADS3和IbMADS4，分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因都在營養(yǎng)器官中大量表達，并且在纖維根和色素根中表達最強。進一步分析發(fā)現(xiàn)，IbMADS3和IbMADS4基因在甘薯塊根形成層中大量表達，表明這兩個基因可能參與了甘薯塊根的形成和膨大過程。2005年，Kim等[17]又報道了3個可能與甘薯塊根發(fā)育相關的MADS-box基因IbMADS79、IbAGL17和IbAGL20，這3個基因分別屬于AP1、AGL17和TM3-like亞家族。表達模式分析表明，3個基因均在根中表達。2008年，Ku等[18]克隆到一個AGL17家族基因IbMADS1，該基因在塊根發(fā)育過程中大量表達。在馬鈴薯中異源超表達IbMADS1基因發(fā)現(xiàn)，轉基因馬鈴薯表現(xiàn)出側根膨大現(xiàn)象，表明IbMADS1可能是塊根膨大過程的一個關鍵調控因子。Noh等[19]在甘薯中克隆了一個與IbMADS1同源性高達99%的MADS-box基因SRD1。表達模式分析表明，SRD1只在根中表達，并且在纖維根中表達較弱，在初始膨大的塊根中表達增強。在甘薯中超表達SRD1基因，組織培養(yǎng)階段的轉基因植株表現(xiàn)為纖維根變短增粗的現(xiàn)象，后生木質部和形成層細胞顯著增加，表明該基因通過生長素調控了根的后生木質部和形成層的形成，進而調控了甘薯塊根的膨大。

目前，雖然已從甘薯中克隆到了一些MADS-box基因，但只對這些基因在塊根的發(fā)育過程進行了初步分析，MADS-box基因與甘薯抗逆性相關分析仍未見報道。本實驗室根據(jù)甘薯近緣野生種I.trifida基因組數(shù)據(jù)，在甘薯栽培種Ipomoeabatatas(L.) Xu22中克隆到一個新的STMADS11亞家族MADS-box基因，命名為IbMADS11-Like。利用實時定量RT-PCR對IbMADS11-Like基因在甘薯各組織的表達模式進行了研究，并利用非生物脅迫和激素處理研究了該基因與甘薯抗逆性之間的關系，為進一步分析IbMADS11-Like基因的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、主要試劑及主要儀器

實驗材料：供試甘薯徐薯22(Ipomoeabatatas(L.) Xu22)薯塊由中國徐州甘薯研究中心提供。薯塊栽種于江蘇師范大學溫室(光照16 h，28℃/黑暗8 h，18℃)。

主要試劑：常規(guī)限制性內切酶、r-Taq酶、PrimeSTAR?高保真酶、M-MLV反轉錄酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0、pMD18-T載體、限制性內切酶以及Trizol RNA提取試劑盒均購自大連TaKaRa公司。DNA Marker(DL2000及DL2000 plus)購自北京全式金生物技術有限公司。DNA純化試劑盒、氨芐青霉素(Amp)、生長素(IAA)、玉米素(ZT)、脫落酸(ABA)、油菜素內脂(BR)、乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)、赤霉素(GA)購自Omega和Sigma公司。大腸桿菌E.coli DH5α為本實驗保存。

主要儀器：MyCycler型PCR儀(美國Bio-Rad)；Nanodrop ND-2000型超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo)；凝膠電泳儀(美國Bio-Rad)；超凈工作臺(中國安泰公司)；GL25M型臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf)；GelDocXR型凝膠成像儀(美國Bio-Rad)；Stepone plus型定量RCR儀(美國ABI)。

1.2 實驗方法

1.2.1甘薯各組織總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成

選取3個月苗齡甘薯，取莖、葉、纖維根、鉛筆根(直徑1 cm)、發(fā)育中的塊根(直徑3 cm)和成熟塊根(直徑>10 cm)，液氮研磨成粉，利用Tizol RNA提取試劑盒說明書分別提取各組織總RNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。Nanodrop測定各組織RNA濃度，并取1μg RNA，參照反轉錄試劑盒說明書(M-MuLV,Takara)，以Oligo d(T)18(5′TTTTTTTTTTTTTTTTTT3′)為引物合成各組織cDNA。

1.2.2 甘薯IbMADS11-Like基因的篩選及克隆

利用已知甘薯MADS-box基因(IbMADS1、IbSRD1、IbMADS3、IbMADS4、IbMADS10等)的MADS保守區(qū)序列，對甘薯近緣野生種I.trifida基因組序列進行比對，篩選到一個新的MADS-box基因序列，命名為IbMADS11-Like。根據(jù)I.trifida基因組序列設計引物IbMADS-F及IbMADS-R(表1)，以栽培種甘薯徐22纖維根、鉛筆根和塊根的混合cDNA為模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶擴增IbMADS11-Like基因全長。PCR體系如下：5×PS Buffer 10 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL、cDNA 1.5 μL、IbMADS-F/R引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL、PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應條件如下：98℃，變性1 min→[98℃，變性10 s→56℃，退火10 s→72℃，延伸1.5 min]×35循環(huán)→72℃，延伸10 min→4℃，保存。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。檢測無誤后，加A尾連接pMD18-T載體，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。氨芐青霉素(50 mg·L-1)篩選陽性轉化子。將酶切鑒定正確的菌株送上海生工測序。

表1 引物序列

1.2.3 IbMADS11-Like基因的信息學分析

利用ExPASy(Expert Protein Analysis Software,http://web.expasy.org/)在線軟件對目的蛋白進行等電點、疏水性等基本性質分析。利用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對目的蛋白進行磷酸化位點預測。利用PSORT Prediction對目的基因進行亞細胞定位預測。利用DNAMAN對MADS-box蛋白進行序列多重比對，MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)進化樹。利用NCBI的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Conserved Domain Search Service(CD Search)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對目的基因進行序列同源分析和保守結構域分析。

1.2.4 IbMADS11-Like基因的表達特性分析

根據(jù)IbMADS11-Like的基因序列設計特異定量引物IbMADS11-Like-FQ及IbMADS11-Like-RQ(表1)，以β-tubulin基因為內參設計引物tubulin-F及tubulin-R(表1)，以3個月苗齡的甘薯徐22莖、葉、纖維根、鉛筆根(直徑1 cm)、發(fā)育中的塊根(直徑3 cm)和成熟塊根(直徑>10 cm)cDNA為模板，進行實時定量RT-PCR分析。體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL、IbMADS11-Like-FQ/RQ混合引物(10.0 μmol·L-1) 0.5 μL、cDNA 1.0 μL，加ddH2O至10.0 μL。PCR反應程序如下：95℃，30 s→[95℃，5 s→60℃，30 s→信號收集]×39循環(huán)→[65℃+0.5℃/Cycle，2 s→信號收集]×60循環(huán)。利用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 非生物脅迫處理

選取1個月苗齡甘薯，剪取包含2～3片葉片的枝條(約10 cm)于無菌離子水中，置于光照箱中培養(yǎng)(光照16 h，28℃/黑暗8 h，18℃)，無菌離子水每3天更換一次。7～8 d后選取株高及長勢一致的薯苗進行鹽、干旱、高溫和低溫處理，所有脅迫處理實驗均分別于0、1、3、6、12、24、48、72 h取根組織作為樣品。鹽脅迫處理：將甘薯幼苗轉移至含有100 mmol·L-1NaCl的水溶液，根部避光培養(yǎng)。干旱脅迫處理：將甘薯幼苗轉移至含有100 mmol·L-1PEG的水溶液，根部避光培養(yǎng)。高溫處理：將甘薯幼苗轉移至40℃，根部避光。低溫處理：將甘薯幼苗轉移4℃，根部避光培養(yǎng)。上述材料采取后立即液氮冷凍處理，并放于-80℃?zhèn)溆谩８鞑牧虾铣蒫DNA后，以IbMADS11-Like-FQ/RQ為引物，以tubulin為內參，進行實時定量RT-PCR分析。

1.2.6 激素處理

選取1個月苗齡甘薯，剪取包含2～3片成熟葉的枝條(約10 cm)于無菌離子水中，置于溫室中培養(yǎng)(光照16 h，28℃/黑暗8 h，18℃)，無菌離子水每3天更換一次。7～8 d后選取株高及長勢一致的薯苗進行激素處理。將甘薯幼苗分別轉移至100 mmol·L-1ABA溶液、100 mmol·L-1BR溶液、100 mmol·L-1ACC溶液、100 mmol·L-1IAA溶液、100 mmol·L-1GA溶液、100 mmol·L-1JA溶液中，根部避光培養(yǎng)，分別于0、1、3、6、12、24、48、72 h取根組織。上述材料采取后立即液氮冷凍處理，并放于-80℃?zhèn)溆?。各材料合成cDNA后，以IbMADS11-Like-FQ/RQ為引物，以tubulin為內參，進行實時定量RT-PCR分析。

2 結果與分析

2.1 IbMADS11-Like基因的克隆

利用甘薯中已知的MADS-box基因MADS區(qū)保守序列對I.trifida基因組數(shù)據(jù)庫進行篩選，獲得一個新的STMADS11亞家族MADS-box基因。根據(jù)I.trifida基因組數(shù)據(jù)庫序列設計引物IbMADS-F/R，以甘薯纖維根、鉛筆根、塊根混合cDNA為模板，克隆到一條CDS區(qū)長為648 bp的基因，命名為IbMADS11-Like(圖1A)。將該序列克隆到pMD18-T載體中，限制性內切酶EcoRⅠ和SphⅠ 37℃保溫3 h，切出一條長度約400 bp的條帶(圖1B)。將該質粒送至上海生工測序，測序結果與I.trifida基因組數(shù)據(jù)庫序列比對顯示，兩序列并不完全一致，相似度為91.7%(圖1C)。

圖1 IbMADS11-Like基因的克隆及序列比對 A. IbMADS-Like基因的克隆；B. pMD18-T::IbMADS11-Like質粒酶切驗證；C. Ipomoea batatas(L.) Xu22及I.trifida中IbMADS-Like基因的序列比對 M1. DL2000 Marker；1，2. IbMADS11-Like目的片段；M2. DL2000 Plus Marker；3. pMD18-T::IbMADS11-Like質粒EcoRⅠ及SphⅠ的酶切結果；trifida. I.trifida中的IbMADS-Like基因序列；Xu22. Ipomoea batatas(L.) Xu22中的IbMADS11-Like基因序列Fig.1 Electrophoretogram of the cloning of IbMADS11-Like and sequence aligment A. Amplification of target gene IbMADS-Like; B. Digestion of pMD18-T::IbMADS11-Like vector; C. Sequence aligment of IbMADS-Like in Ipomoea batatas(L.) Xu22 and I.trifida; M1. DL2000 Marker; 1,2. Target DNA of IbMADS11-Like; M2. DL2000 Plus Marker; 3. Vector of pMD18-T::IbMADS11-Like digested by EcoRⅠ & SphⅠ; trifida. IbMADS-Like sequence of I.trifida; Xu22. IbMADS11-Like sequence of Ipomoea batatas(L.) Xu22

2.2 IbMADS11-Like基因的生物信息學分析

2.2.1IbMADS11-Like基因及蛋白序列的理化性質分析

DNA START、ExPASy分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一個由216個氨基酸殘基組成的蛋白質，其中包含32個負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)和35個正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)。分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質分子量為24.3 kD、理論等電點為8.59。通過ExPASy分析發(fā)現(xiàn)，IbMADS11-Like蛋白的脂溶指數(shù)(aliphatic index)為81.63，總親水平均值(Grand average of hydropathicity(GRAVY))為-0.581，表明該蛋白質為親水脂溶性蛋白。ExPASy的Tmpred預測(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)顯示，IbMADS11-Like蛋白的34～58位氨基酸區(qū)域內具有跨膜結構。利用PSORT Prediction進行亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)IbMADS11-Like基因定位于細胞核，這與MADS-box基因的亞細胞定位保持一致。NetPhos 2.0在線磷酸化位點預測顯示，IbMADS11-Like蛋白有29個磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點21個、蘇氨酸(Thr)磷酸化位點5個、酪氨酸(Tyr)磷酸化位點3個，表明該蛋白在翻譯后存在翻譯后修飾。

2.2.2MADS-box蛋白序列同源比對及系統(tǒng)進化樹分析

根據(jù)已知MADS-box蛋白的結構域序列，以及NCBI Conserved Doman Research(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析發(fā)現(xiàn)，IbMADS11-Like蛋白序列含有MIKC型MADS-box蛋白保守的MADS結構域和K結構域(圖2)。利用DANMAN對IbMADS11-Like及甘薯中已知的MADS-box蛋白序列進行比對，結果顯示IbMADS11-Like與其他甘薯MADS-box蛋白在MADS區(qū)和K區(qū)相似度較高(圖2)。利用MEGA5.1及Cluatal X對IbMADS11-Like、甘薯已知MADS-box蛋白、馬鈴薯MADS-box蛋白及擬南芥MADS-box蛋白進行系統(tǒng)進化樹構建，結果表明IbMADS11-Like蛋白與馬鈴薯STMADS11蛋白同源性較高，屬于STMADS11亞家族(圖3)。我們推測IbMADS11-Like可能與STMADS11亞家族蛋白相同，在植物的營養(yǎng)器官發(fā)育中發(fā)揮重要功能。

圖2 IbMADS11-Like與甘薯中其他MADS-box蛋白的序列比對 方框.MADS區(qū)；虛線.I區(qū)；雙橫線.K區(qū)；單橫線.C區(qū)Fig.2 Homology comparison of IbMADS11-Like and other MADS-box proteins in sweet potato Box. MADS box; Dotted line. I box; Double line. K box; Single line. C box

圖3 IbMADS11-Like與其他MADS-box蛋白的系統(tǒng)進化樹分析 0.1. 每100個氨基酸中有10個不同F(xiàn)ig.3 Phylogenetic analysis of IbMADS11-Like and other MADS-box proteins 0.1. 10% changes were observed between two sequence

2.3IbMADS11-Like基因的組織特異性表達分析

為研究IbMADS11-Like基因在甘薯各組織的表達特性，本實驗提取了3個月苗齡薯苗莖(S)、葉(L)、纖維根(FR)、鉛筆根(DR1)、發(fā)育中的塊根(DR2)、成熟塊根(MR)組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示各組織RNA都具有良好的完整性(圖4A)。利用Nanodrop檢測了各RNA的濃度，取1 μg合成了各組織cDNA。實時定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，IbMADS11-Like基因在莖和葉中表達量較低，在纖維根和鉛筆根中大量表達，并且隨著塊根的發(fā)育表達量逐漸降低(圖4)。這個結果表明，IbMADS11-Like基因可能與甘薯的塊根發(fā)育密切相關。

圖4 甘薯各組織RNA及IbMADS11-Like基因的表達特性分析 A.甘薯各組織總RNA；b. IbMADS11-Like在甘薯各組織中的表達特性分析；L.葉；S.莖；FR.纖維根；DR1.發(fā)育中的塊根(直徑2 cm)；DR2.發(fā)育中的塊根(直徑3 cm)；MR.成熟塊根Fig.4 RNAs from different tissues of sweet potato and the expression pattern of IbMADS11-Like A. RNAs from different tissues of sweet potato; b. The expression pattern of IbMADS11-Like; L. Leaf; S. Stem; FR. Fiber root; DR1. Development root(The diameter is 1 cm); DR2. Development root(The diameter is 3 cm); MR. Mature storage root

圖5 脅迫處理對IbMADS11-Like基因表達的影響A. NaCl；B.干旱；C.低溫；D.高溫Fig.5 Impacts of stresses on the expression of IbMADS11-Like A.NaCl; B.Drought; C.High tempreture; D.Low tempreture

圖6 激素處理對IbMADS11-Like基因表達的影響Fig.6 Impacts of hormonal treatments on the expression of IbMADS11-Like

2.4非生物脅迫對IbMADS11-Like基因表達的影響

為分析IbMADS11-Like基因的功能，本實驗室對薯苗進行了高鹽、模擬干旱、高溫和低溫處理，并利用實時定量RT-PCR對IbMADS11-Like基因在各脅迫處理材料中的表達情況進行了分析。結果表明，高鹽、干旱、高溫、低溫等非生物脅迫均對IbMADS11-Like基因造成了不同程度的影響。鹽脅迫和高溫脅迫使IbMADS11-Like基因表達量逐漸上升，在處理72 h后IbMADS11-Like基因的表達量分別上升了5和10倍(圖5)。在干旱脅迫條件下，IbMADS11-Like基因表達量逐漸上升，在12 h達到峰值，隨后表達量逐漸下降，最高表達量比對照高約25倍(圖5)。低溫處理條件下，IbMADS11-Like基因的表達被逐漸抑制，在72 h后表達量達到最低(圖5)。以上4種脅迫處理結果暗示，IbMADS11-Like基因對非生物脅迫敏感，可能與甘薯的抗逆相關。

2.5激素處理對IbMADS11-Like基因表達的影響

為進一步分析IbMADS11-Like基因的功能，本實驗室對薯苗進行了外源激素(ABA、GA、JA、IAA、ACC、BR)處理。實時定量RT-PCR結果表明，在不同的外源激素處理下IbMADS11-Like基因表現(xiàn)出不同的表達量變化。外源JA處理條件下，IbMADS11-Like基因表達量被逐漸誘導，在48 h時到達最高，約被誘導14倍，隨后表達量逐漸降低(圖6)。與JA處理的結果相似，IAA和ABA處理后IbMADS11-Like基因表達量逐漸上升，到達峰值后迅速下降，但與JA處理不同的是IbMADS11-Like基因的表達量在12 h達到峰值(圖6)。ACC處理1 h時IbMADS11-Like的表達量升高，隨后迅速下降到原來水平，并基本保持不變(圖6)。IbMADS11-Like在GA處理1 h后被大量誘導，而后迅速下降到原來水平的50%左右，并基本保持不變(圖6)。而在BR處理時，IbMADS11-Like基因的表達量在12 h后上升約40倍(圖6)。這些結果表明，IbMADS11-Like基因對不同的外源激素表現(xiàn)出不同的敏感性。

3 討論

MADS-box蛋白是一類龐大的轉錄因子家族，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要功能。目前，在擬南芥、水稻、番茄等植物中，已對MADS-box蛋白進行了大量的系統(tǒng)分析和功能研究[2,20～21]。然而目前，在甘薯中只克隆到8個MADS-box基因，并且只對SRD1和IbMADS1進行了功能研究[18～19]。MADS-box蛋白在甘薯中的研究仍相對缺乏。因此，本實驗室根據(jù)最近發(fā)表的甘薯近緣野生種I.trifida基因組序列，在栽培種甘薯Ipomoeabatatas(L.) Xu22中克隆到了一個新的MADS-box基因(圖1)。系統(tǒng)分析表明，該基因屬于STMADS11亞家族，與馬鈴薯STMADS11基因同源性較高(圖3)，命名為IbMADS11-Like。研究表明，STMADS11亞家族成員大多與植物的營養(yǎng)生長發(fā)育密切相關。例如，馬鈴薯中的STMADS11和STMADS16都被報道參與調控了植物的營養(yǎng)生長過程[9～10]。甘薯中的IbMADS3和IbMADS4也被報道只在根、莖、葉等營養(yǎng)器官中表達[16]。因此，我們推測IbMADS11-Like可能與STMADS11亞家族的其他成員相同，在營養(yǎng)器官生長發(fā)育過程發(fā)揮重要功能。此外，IbMADS11-Like基因在甘薯中的組織表達特性分析顯示，該基因在莖、葉和根中均有表達，尤其在纖維根中表達量最高(圖4)，這與STMADS11亞家族的基因表達特性保持一致，進一步暗示IbMADS11-Like基因可能參與調控甘薯的營養(yǎng)生長過程。

定量RT-PCR結果顯示，IbMADS11-Like基因的表達量隨著塊根的發(fā)育迅速下降，在成熟塊根中達到最低，只有纖維根中的0.2%(圖4)，這與甘薯STMADS11亞家族成員IbMADS3和IbMADS4的表達模式[16]非常相似，表明IbMADS11-Like基因可能參與了甘薯塊根的發(fā)育過程。另外，研究表明，甘薯塊根的發(fā)育與植物生長物質有著密切的關系。王慶美等[22]的研究顯示，甘薯塊根產(chǎn)量與ABA的含量呈顯著正相關。Eguchi等[23]表明，外源施加人工合成的細胞分裂素可以有效促進甘薯塊根的形成。Noh等[19]的研究結果顯示，在甘薯塊根形成初期，IAA含量上升，外源施加IAA的類似物萘乙酸時，甘薯塊根數(shù)量明顯增加。此外，油菜素內酯和茉莉酸也被證明可能與甘薯的塊根發(fā)育相關[24～25]。因此，為進一步分析IbMADS11-Like基因的功能，本實驗室對薯苗進行了外源激素處理。圖6顯示，IbMADS11-Like基因在ABA、IAA、JA、BR等植物生長物質處理下均有不同程度的響應，這一結果進一步暗示IbMADS11-Like基因可能參與了甘薯塊根的形成和發(fā)育過程。

近年來，有報道表明MADS-box蛋白也參與了植物的非生物脅迫和激素響應過程，例如水稻OsMADS26參與了干旱和病原菌的調控[12]；OsMADS18、OsMADS22、OsMADS26和OsMADS27基因在低溫和干旱處理條件上調表達；OsMADS2、OsMADS30和OsMADS55基因在干旱和鹽脅迫條件下調表達[13]。本實驗的表達模式分析結果顯示，IbMADS11-Like基因在甘薯纖維根中大量表達，在其他組織表達相對較弱(圖4)，表明該基因可能與干旱、鹽等應答相關。為進一步分析IbMADS11-Like基因在甘薯中的功能，本實驗室對薯苗進行了高鹽、模擬干旱、高溫、低溫等非生物脅迫處理以及激素處理。實時定量RT-PCR結果表明，IbMADS11-Like基因在高鹽、模擬干旱、高溫脅迫條件下均被不同程度的誘導，尤其在干旱條件下，IbMADS11-Like基因的表達量升高了約25倍(圖5)。而在低溫條件下，IbMADS11-Like基因的表達量被明顯抑制(圖5)。這些結果表明，IbMADS11-Like基因可能參與了甘薯的非生物脅迫響應。此外，研究表明，干旱、鹽等非生物脅迫應答常與植物激素的變化相關。例如，ABA通過調節(jié)氣孔的開合、滲透壓及抗逆性物質的含量，在植物的抗旱、抗寒過程發(fā)揮了重要功能[26]。細胞分裂素可通過清除自由基、提高抗氧化性，提高植物對低溫、水澇和干旱等逆境的抗性[27]。低溫、傷害、干旱等脅迫條件都可以誘導乙烯的產(chǎn)生[28]。生長素和赤霉素也被證明可以促進多胺的產(chǎn)生來緩解植物脅迫[29]。我們的結果顯示，IbMADS11-Like基因對ABA、JA、IAA、ACC、GA及BR都有不同程度的響應，這些結果進一步表明，IbMADS11-Like基因可能參與了甘薯的脅迫響應。

綜合以上結果，IbMADS11-Like可能是一個甘薯塊根發(fā)育和非生物脅迫相關的調控蛋白，但這仍需要進一步研究證實。因此，本實驗室構建了IbMADS11-Like基因的RNAi及35S超表達載體，擬轉化甘薯進一步驗證IbMADS11-Like基因的功能，相關實驗正在進行中。

1.García-maroto F,Carmona M J,Garrido J A,et al.New roles for MADS-box genes in higher plants[J].Biologia Plantarum,2003,46(3):321-330.

2.Parenicová L,De Folter S,Kieffer M,et al.Molecular and phylogenetic analyses of the complete MADS-box transcription factor family inArabidopsis:new openings to the MADS world[J].The Plant Cell,2003,15(7):1538-1551.

3.Mandel M A,Gustafson-brown C,Savidge B,et al.Molecular characterization of theArabidopsisfloral homeotic geneAPETALA1[J].Nature,1992,360(6401):273-277.

4.Lee J,Lee I.Regulation and function of SOC1,a flowering pathway integrator[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(9):2247-2254.

5.Vrebalov J,Ruezinsky D,Padmanabhan V,et al.A MADS-box gene necessary for fruit ripening at the tomatoripening-inhibitor(rin) locus[J].Science,2002,296(5566):343-346.

6.Montiel G,Gantet P,Jay-allemand C,et al.Transcription factor networks.Pathways to the knowledge of root development[J].Plant Physiology,2004,136(3):3478-3485.

7.Rosin F M,Hart J K,Van Onckelen H,et al.Suppression of a vegetative MADS box gene of potato activates axillary meristem development[J].Plant Physiology,2003,131(4):1613-1622.

8.Alvarez-buylla E R,Liljegren S J,Pelaz S,et al.MADS-box gene evolution beyond flowers:expression in pollen,endosperm,guard cells,roots and trichomes[J].The Plant Journal,2000,24(4):457-466.

9.García-maroto F,Ortega N,Lozano R,et al.Characterization of the potato MADS-box geneSTMADS16 and expression analysis in tobacco transgenic plants[J].Plant Molecular Biology,2000,42(3):499-513.

10.Carmona M J,Ortega N,Garcia-maroto F.Isolation and molecular characterization of a new vegetative MADS-box gene fromSolanumtuberosumL.[J].Planta,1998,207(2):181-188.

11.Lee S,Woo Y M,Ryu S I,et al.Further characterization of a rice AGL12 group MADS-box gene,OsMADS26[J].Plant Physiology,2008,147(1):156-168.

12.Khong G N,Pati P K,Richaud F,et al.OsMADS26 negatively regulates resistance to pathogens and drought tolerance in rice[J].Plant Physiology,2015,169(4):2935-2949.

13.Arora R,Agarwal P,Ray S,et al.MADS-box gene family in rice:genome-wide identification,organization and expression profiling during reproductive development and stress[J].BMC Genomics,2007,8:242.

14.Lee S,Choi S C,An G.Rice SVP-group MADS-box proteins,OsMADS22 and OsMADS55,are negative regulators of brassinosteroid responses[J].The Plant Journal,2008,54(1):93-105.

15.Duan K,Li L,Hu P,et al.A brassinolide-suppressed rice MADS-box transcription factor,OsMDP1,has a negative regulatory role in BR signaling[J].The Plant Journal,2006,47(4):519-531.

16.Kim S H,Mizuno K,Fujimura T.Isolation of MADS-box genes from sweet potato(Ipomoeabatatas(L.) Lam.) expressed specifically in vegetative tissues[J].Plant & Cell Physiology,2002,43(3):314-322.

17.Kim S H,Hamada T,Otani M,et al.Isolation and characterization of MADS box genes possibly related to root development in sweetpotato(IpomoeabatatasL.Lam.)[J].Journal of Plant Biology,2005,48(4):387-393.

18.Ku A T,Huang Y S,Wang Y S,et al.IbMADS1(IpomoeabatatasMADS-box 1 gene) is involved in tuberous root initiation in sweet potato(Ipomoeabatatas)[J].Annals of Botany,2008,102(1):57-67.

19.Noh S A,Lee H S,Huh E J,et al.SRD1 is involved in the auxin-mediated initial thickening growth of storage root by enhancing proliferation of metaxylem and cambium cells in sweetpotato(Ipomoeabatatas)[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(5):1337-1349.

20.Wu F,Shi X W,Lin X L,et al.The ABCs of flower development:mutational analysis ofAP1/FUL-like genes in rice provides evidence for a homeotic(A)-function in grasses[J].The Plant Journal,2016,89(2):310-324.

21.Ito Y.Regulation of tomato fruit ripening by MADS-box transcription factors[J].Japan Agricultural Research Quarterly:JARQ,2016,50(1):33-38.

22.王慶美,張立明,王振林.甘薯內源激素變化與塊根形成膨大的關系[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2005,38(12):2414-2420.

Wang Q M,Zhang M L,Wang Z L.Formation and thickening of tuberous roots in relation to the endogenous hormone concentrations in sweetpotato[J].Scientia Agricultura Sinica,2005,38(12):2414-2420.

23.Eguchi T,Yoshida S.Effects of application of sucrose and cytokinin to roots on the formation of tuberous roots in sweetpotato(Ipomoeabatatas(L.) Lam.)[J].Plant Root,2008,2:7-13.

24.Ravi V,Chakrabarti S K,Makeshkumar T,et al.Molecular regulation of storage root formation and development in sweet potato[M].//Janick J.Horticultural Reviews.Hoboken,NJ:John Wiley & Sons,2014,42:157-208.

25.Bae J M,Kwak M S,Noh S A,et al.Overexpression of sweetpotato expansin cDNA(IbEXP1) increases seed yield inArabidopsis[J].Transgenic Research,2014,23(4):657-667.

26.Yoshida T,Mogami J,Yamaguchi-shinozaki K.ABA-dependent and ABA-independent signaling in response to osmotic stress in plants[J].Current Opinion in Plant Biology,2014,21:133-139.

27.Glaser R,Kiecolt-glaser J K,Marucha P T,et al.Stress-related changes in proinflammatory cytokine production in wounds[J].Archives of General Psychiatry,1999,56(5):450-456.

28.Morgan P W,Drew M C.Ethylene and plant responses to stress[J].Physiologia Plantarum,1997,100(3):620-630.

29.劉桂豐,楊傳平.鹽逆境條件下3個樹種的內源激素變化[J].東北林業(yè)大學學報,1998,26(1):1-3.

Liu G F,Yang C P.Endogenous hormone change of three tree species under salt stress[J].Journal of Northeast Forestry University,1998,26(1):1-3.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31501352)；Natural Science Foundation of Jiangsu Provence(BK20150229)；National Training Programs of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduate(201510320022,201510320022Z)；Jiangsu Normal University doctoral degree teachers research support project(14XLR012)

introduction：TAN Chuan-Ting(1996—),female,undergraduate,Major in plant molecular biology.

date:2016-12-20

CloningandExpressionAnalysisofStressTreatmentsofaMADS-boxTranscriptionFactorinSweetPotato

TAN Chuan-Ting SONG Wei-Han ZHU Ming-Ku XU Tao DONG Ting-Ting*LI Zong-Yun

(School of Life Science, Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116)

MADS-box proteins play important functions in the development and stress response of plants. A STMADS11 subfamily gene was cloned fromIpomoeabatatas(L.) Xu22 according toI.trifidagenome sequences, namedIbMADS11-Like. By real-time RT-PCRIbMADS11-Likewas expressed abundantly in roots, and a rapid declining trend was observed as storage root formation and development. TheIbMADS11-Likemight be involved in the storage root development of sweet potato. Stress treatment experiments showed thatIbMADS11-Likewas induced by drought, NaCl and high temperature, while was reduced by low temperature. ABA, IAA, ZT, BR, ACC, JA and GA treatments also impacted the expression ofIbMADS11-Like, indicating thatIbMADS11-Likemight play functions in the development and stress response in sweet potato. These results play a foundation for further study on the physiological function ofIbMADS11-Likein the development and stress response of sweet potato.

MADS-box protein;IbMADS11-Like;transcription factor;cloning;abiotic stress;sweet potato

國家自然科學基金(31501352)；江蘇省自然科學基金(BK20150229)；大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目(201510320022,201510320022Z)；江蘇師范大學博士學位教師科研支持項目(14XLR012)

談傳婷(1996—)，女，本科生，主要從事植物分子生物學方面的研究工作。

* 通信作者：E-mail：dtt@jsnu.edu.cn

2016-12-20

* Corresponding author：E-mail：dtt@jsnu.edu.cn

Q78；S531

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.015