哈蟆油蛋白酶解物氨基酸組成和安全性研究

魏星華，張鶴，龐博，潘黛安，齊濱，白雪媛，趙雨，趙大慶，*

（1.吉林省科普服務(wù)中心，吉林長(zhǎng)春130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春130117）

哈蟆油蛋白酶解物氨基酸組成和安全性研究

魏星華1，張鶴2，3，*，龐博3，潘黛安3，齊濱3，白雪媛3，趙雨3，趙大慶3，*

（1.吉林省科普服務(wù)中心，吉林長(zhǎng)春130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長(zhǎng)春130117）

研究哈蟆油蛋白酶解物的氨基酸組成，通過(guò)急毒試驗(yàn)和30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用柱前衍生化法測(cè)定哈蟆油蛋白酶解物中的氨基酸的相對(duì)含量；急性毒性試驗(yàn)以動(dòng)物最大耐受劑量灌胃給藥，觀(guān)察急性毒性反應(yīng)和死亡情況；30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)按臨床給藥劑量的100倍、75倍、50倍灌胃給藥，觀(guān)察大鼠的一般行為情況、體質(zhì)量、血液學(xué)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、各臟器重量及臟器比，檢查大鼠各臟器病理組織。哈蟆油蛋白酶解物氨基酸組成的結(jié)果為必需氨基酸的相對(duì)含量高達(dá)45.87%，半必需氨基酸14.78%。急毒試驗(yàn)結(jié)果為哈蟆油蛋白酶解物以臨床劑量的127倍灌胃給藥，未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)。30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，與對(duì)照組相比，哈蟆油蛋白酶解物各劑量組大鼠一般情況、體質(zhì)量、血液學(xué)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、臟器重量及臟體比、病理組織學(xué)檢查均無(wú)顯著性差異。綜上判定哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝及臟器無(wú)急性不良影響，并可為機(jī)體提供大量必需氨基酸。

哈蟆油蛋白酶解物；氨基酸；急毒試驗(yàn)；30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)；安全性評(píng)價(jià)

哈蟆油（Oviductus Ranae）系蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙雌蛙的輸卵管，具有補(bǔ)腎益精，健脾益胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津等功效[1-2]。哈蟆油含有多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸類(lèi)、磷脂化合物、糖類(lèi)、維生素 A、B、C、D，激素及多種微量元素[3]，其中主要成分為蛋白質(zhì)，占哈蟆油總重的50%以上[4]。人體攝食蛋白質(zhì)或多肽可在機(jī)體內(nèi)水解生成氨基酸，而必需氨基酸和半必需氨基酸是機(jī)體日常所需的重要成分。由于哈蟆油中蛋白質(zhì)相對(duì)分子量較大、水溶性較差，因此不易被人體吸收利用，且腥味較重，不易被大多數(shù)人所接受。因此近年來(lái)很多學(xué)者采用蛋白酶酶解的方法降低哈蟆油蛋白的分子量[5-7]，改善其口味，開(kāi)發(fā)保健食品。目前，對(duì)于哈蟆油蛋白酶解物的毒性、不良反應(yīng)報(bào)道較少。因此，筆者參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》中急性毒性試驗(yàn)、30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)的方法對(duì)哈蟆油蛋白酶解物進(jìn)行毒理研究，作出安全性評(píng)價(jià)；同時(shí)對(duì)哈蟆油中的氨基酸組成進(jìn)行分析，為保健品的開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠（20.0±2.0）g，SPF級(jí) Wistar大鼠（70±10）g雌、雄兼用，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（SCXK-吉-2012-0001）。

1.2 試劑與儀器

哈蟆油：吉林省白山市北亞藥業(yè)；17種氨基酸對(duì)照品（天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、絲氨酸Ser、甘氨酸 Gly、組氨酸His、蘇氨酸Thr、精氨酸 Arg、丙氨酸Ala、脯氨酸 Pro、酪氨酸 Tyr、纈氨酸 Val、甲硫氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸 Leu、苯丙氨酸Phe、賴(lài)氨酸Lys、色氨酸Try）：中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；胃蛋白酶（10 000 U/mg）：Sigma Aldrich公司；胰蛋白酶（250 U/mg）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；生化試劑盒：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；乙腈：Sigma Aldrich公司；異硫氰酸苯酯、正己烷：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其它為分析純。

安捷倫1100高效液相色譜儀：美國(guó)Aglient公司；SYSMEX-XT1800i型全自動(dòng)血液分析儀：日本希森美康醫(yī)用電子有限公司；TBA-120FR型全自動(dòng)生化分析儀：日本東芝公司；AB135-S電子天平（d=0.000 1 g）、pHS-25數(shù)顯酸度計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；Sartorius-BL610電子天平（d=0.01 g）：德國(guó)IKA有限公司；Wondasil-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：島津GL公司。

1.3 受試藥物

哈蟆油蛋白酶解物制備，哈蟆油干粉按料液比1∶100（g/mL）加入pH4.50的檸檬酸，浸泡36 h后勻漿，水煎煮2 h，冷卻，調(diào)pH至3.0±0.2，按酶與底物比1∶2 000（g/g）加入胃蛋白酶，37℃酶解2 h，酶解后樣品煮沸15 min，滅酶活，調(diào)pH至10.0±0.2，按酶與底物比1 ∶100（g/g）加入堿性蛋白酶，55 ℃酶解 6 h，酶解后樣品煮沸 15 min，滅酶活，調(diào) pH7.0±0.2，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，濾液凍干，此凍干粉為哈蟆油蛋白酶解物[8]，哈蟆油蛋白酶解物的提取率為63%。

1.4 溶液配制

1.4.1 衍生試劑的配制

異硫氰酸苯酯乙腈溶液：異硫氰酸苯酯60 μL與乙腈 4 940 μL。

三乙胺乙腈溶液：三乙胺675 μL與乙腈4 325 μL混勻。

1.4.2 對(duì)照品溶液配制

精密稱(chēng)取 17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Arg、Ala、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、Try）對(duì)照品各10 mg，置50 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度。

1.4.3 供試品溶液配制[9]

精密稱(chēng)取哈蟆油蛋白粉80 mg，置水解管中，加6 mol/L鹽酸溶液15 mL，110℃烘箱中水解24 h，將水解物倒入蒸發(fā)皿中，用水充分洗滌，蒸干，殘?jiān)盟芙?，過(guò)濾，濾液定容至100 mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 哈蟆油蛋白酶解物的氨基酸組成分析

精密稱(chēng)取對(duì)照品（供試品）溶液0.5 mL，加異硫氰酸苯酯乙腈0.25 mL，加三乙胺乙腈溶液0.25 mL；室溫放置1 h，加正己烷0.5 mL，充分混勻，放置10 min，取下層溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液注入高效液相色譜儀。記錄色譜峰的保留時(shí)間（RT）和峰面積百分比（%），根據(jù)對(duì)照品確定樣品中各氨基酸色譜峰的保留時(shí)間。

色譜條件，流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水；流動(dòng)相C：0.1 mol/L醋酸鈉緩沖溶液（取醋酸鈉39.78 g，加水至4 850 mL，用36%醋酸調(diào)至pH6.5）。柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 急性毒性試驗(yàn)

藥物給藥劑量采用最大耐受劑量法，藥物的最大濃度為0.5 g/mL，給藥量為20 g/（kg·BW）。取SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄各20只，禁食（不禁水）16 h后隨機(jī)分4組，每組10只，一日內(nèi)灌胃給藥兩次，每隔6小時(shí)一次，空白對(duì)照組給予蒸餾水，連續(xù)觀(guān)察14 d，記錄小鼠有無(wú)改變軀體運(yùn)動(dòng)姿勢(shì)、叫聲、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、流涎、流淚、流鼻涕、潮式呼吸、氣脹、腹瀉或便秘等異常情況和時(shí)間。如果動(dòng)物有死亡，記錄死亡數(shù)、死亡時(shí)間，對(duì)全部動(dòng)物做大體解剖。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.3 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

取SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各40只隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組和高、中、低3個(gè)劑量組，給藥劑量為臨床劑量的100倍、75倍、50倍（哈蟆油蛋白酶解物給藥量分別為15.75 g/（kg·BW），11.81 g/（kg·BW），7.87 g/（kg·BW），對(duì)照組給予等量的蒸餾水。各劑量組和對(duì)照組均按2.5 mL/（100 g·BW）灌胃，連續(xù)給藥30 d。期間記錄大鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量，觀(guān)察一般行為；禁食16 h后，于試驗(yàn)第31天稱(chēng)重，用1%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液腹腔注射麻醉后，下腔靜脈采血，檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)，包括白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞 （red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶 （aspartate transaminase，AST）、尿素（Urea）、肌酐（creatinine，Cr）、血糖（blood glucose，Glu）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）、膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三脂（triglyceride，TG）。各組大鼠解剖，取臟器，稱(chēng)量臟器重量和計(jì)算相對(duì)重量（臟/體比值）、進(jìn)行組織病理檢查（肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸或卵巢）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果表示為（±s），a=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 哈蟆油蛋白酶解物的氨基酸組成分析結(jié)果

采用柱前衍生化測(cè)定哈蟆油蛋白酶解物中的氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 哈蟆油蛋白酶解物的氨基酸組成分析Table 2 Analysis result of amino acid composition of ORPH

含量較高的前3種氨基酸Thr和Lys是必需氨基酸（總必需氨基酸的相對(duì)含量為45.87%），Arg是半必需氨基酸（總半必需氨基酸的相對(duì)含量為14.78%）。其中色氨酸在6 mol/L鹽酸水解中結(jié)構(gòu)被破壞未檢出。結(jié)果表明攝食哈蟆油蛋白酶解物可為人體補(bǔ)充大量的必需氨基酸和半必需氨基酸。

3.2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)期間各劑量組小鼠外觀(guān)、行為、進(jìn)食及大小便正常，解剖未發(fā)現(xiàn)病理組織，動(dòng)物死亡數(shù)為0只（結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（n=10，±s）Table 3 The results of acute toxicity test（n=10，±s）

表3 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（n=10，±s）Table 3 The results of acute toxicity test（n=10，±s）

組別 性別 始重/g 終重/g 動(dòng)物死亡數(shù)/只 死亡率/%對(duì)照組 雄性 20.2±0.5 31.1±1.8 0 0雌性 20.2±0.6 31.6±2.0 0 0哈蟆油蛋白酶解物雄性 20.7±0.3 32.2±1.9 0 0雌性 20.3±0.7 30.3±2.1 0 0

各組小鼠體質(zhì)量均有增加，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果表明小鼠急性經(jīng)口LD50大于20 g/（kg·BW），因此判定哈蟆油蛋白酶解物屬于無(wú)毒級(jí)。

3.3 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠一般情況及體質(zhì)量的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠一般情況及體質(zhì)量的影響，見(jiàn)表4。

表4 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（n=10，±s）Table 4 Effects of ORPH on body weight of rats（n=10，±s）

表4 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響（n=10，±s）Table 4 Effects of ORPH on body weight of rats（n=10，±s）

第4周體質(zhì)量/g對(duì)照組 雄性 74.2±2.2 142.1±7.1 185.3±8.2 237.0±14.8 268.5±13.7高劑量組 雄性 75.0±2.1 140.3±6.1 188.7±9.8 249.1±12.9 276.7±15.5中劑量組 雄性 74.8±2.5 139.2±7.5 187.1±8.9 244.8±12.5 270.4±14.2低劑量組 雄性 73.9±2.8 145.8±6.7 189.2±8.6 236.1±13.6 271.0±15.0對(duì)照組 雌性 72.5±1.9 125.5±4.9 158.8±8.3 199.5±10.2 223.9±11.4高劑量組 雌性 72.9±1.3 130.2±5.6 163.1±9.2 209.8±8.8 232.5±12.7中劑量組 雌性 73.0±1.8 133.9±3.3 159.2±7.9 208.4±11.5 230.1±12.6低劑量組 雌性 72.8±1.8 129.8±6.8 161.8±9.8 201.2±9.4 231.6±13.0組別 性別 初始質(zhì)量/g第1周體質(zhì)量/g第2周體質(zhì)量/g第3周體質(zhì)量/g

給藥期間各劑量組大鼠均無(wú)死亡，動(dòng)物毛發(fā)光澤，黏膜紅潤(rùn)，活動(dòng)自如，進(jìn)食、大小便未見(jiàn)異常，發(fā)育良好，體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，與對(duì)照組比較，組間體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系。

3.3.2 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響見(jiàn)表5。

表5 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響（n=10，±s）Table 5 Effects of ORPH on routine blood indexes of rats（n=10，±s）

表5 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響（n=10，±s）Table 5 Effects of ORPH on routine blood indexes of rats（n=10，±s）

組別性別WBC/（109/L）RBC/（1012/L）HGB/（g/L）對(duì)照組 雄性 5.66±1.37 7.56±1.65 141.54±6.51高劑量組 雄性 5.68±1.41 7.37±1.63 142.79±5.60中劑量組 雄性 5.74±1.31 7.73±1.90 140.47±4.84低劑量組 雄性 5.88±1.20 7.64±1.49 142.36±5.81對(duì)照組 雌性 6.17±1.85 7.23±1.18 139.98±6.59高劑量組 雌性 6.21±1.38 6.91±1.23 140.17±6.07中劑量組 雌性 6.14±1.90 6.90±1.30 134.86±6.98低劑量組 雌性 6.19±1.75 7.23±1.09 136.54±7.14

表5結(jié)果顯示，各劑量組大鼠血液中白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）和血紅蛋白（HGB）與對(duì)照組比較，均未見(jiàn)明顯差異（p＞0.05）。由此得出，哈蟆油蛋白酶解物未造成大鼠血液中各指標(biāo)的異常改變，且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系。

3.3.3 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響見(jiàn)表6。

表6 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（n=10，±s）Table 6 Effects of ORPH on serum biochemical markers of rats（n=10，±s）

表6 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（n=10，±s）Table 6 Effects of ORPH on serum biochemical markers of rats（n=10，±s）

TG/（mmol/.L）對(duì)照組 雄性 28.8±3.2 88.9±9.8 5.37±0.63 54.2±4.1 5.78±0.72 56.6±3.7 32.7±1.3 1.83±0.11 0.61±0.08高劑量組 雄性 27.9±3.7 89.1±8.9 5.19±0.51 54.3±5.4 6.02±0.75 56.8±3.4 31.6±1.0 1.85±0.19 0.63±0.11中劑量組 雄性 25.7±3.1 86.3±7.6 5.32±0.49 55.1±3.8 5.96±0.60 57.3±3.9 32.1±1.4 1.88±0.22 0.60±0.10低劑量組 雄性 28.9±2.6 89.4±10.5 5.43±0.58 54.8±4.3 6.17±0.66 57.1±4.1 32.5±1.2 1.80±0.25 0.65±0.09對(duì)照組 雌性 27.8±3.9 86.8±10.6 5.32±0.71 53.9±4.5 5.67±0.73 55.3±2.7 32.5±1.5 1.79±0.14 0.54±0.08高劑量組 雌性 27.3±3.7 90.5±8.5 5.37±0.62 54.1±3.4 5.43±0.85 54.1±2.9 31.9±1.2 1.82±0.17 0.49±0.10中劑量組 雌性 25.2±4.8 87.2±9.5 5.50±0.59 53.1±2.9 5.95±0.87 55.9±2.3 32.0±1.5 1.71±0.15 0.51±0.10低劑量組 雌性 26.4±3.4 90.0±9.9 5.25±0.78 53.7±4.0 5.85±0.76 53.8±4.1 33.3±2.2 1.76±0.10 0.55±0.09組別性別ALT/（U/L）AST/（U/L）BUN/（mmol/L）Cr/（μmol/L）（mmol./L）TP/（g/L）Alb/（g/L）TC/（mmol/L）Glu/

表6結(jié)果顯示，各劑量組大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（p＞0.05）。由此得出，哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)無(wú)影響，且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系。

3.3.4 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠臟器重量及臟體比的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠臟器重量及臟體比的影響見(jiàn)表7。

表7 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠臟器重量及臟體比的影響（n=10，±s）Table 7 Effects of ORPH on organ weight and organ/body weight ratio of rats（n=10，±s）

表7 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠臟器重量及臟體比的影響（n=10，±s）Table 7 Effects of ORPH on organ weight and organ/body weight ratio of rats（n=10，±s）

組別 性別 肝重量/g 肝體比/% 脾重量/g 脾體比/% 腎重量/g 腎體比/% 睪丸（卵巢）重量/g 睪丸（卵巢）體比/%對(duì)照組 雄性 9.20±0.37 3.56±0.13 0.69±0.06 0.27±0.05 2.19±0.12 0.85±0.07 2.85±0.33 1.10±0.14高劑量組 雄性 8.91±0.79 3.58±0.14 0.66±0.05 0.26±0.04 2.11±0.16 0.85±0.03 2.69±0.21 1.08±0.11中劑量組 雄性 9.14±0.51 3.63±0.10 0.65±0.05 0.26±0.03 2.17±0.12 0.86±0.06 2.72±0.23 1.08±0.15低劑量組 雄性 9.04±0.42 3.58±0.18 0.68±0.08 0.27±0.05 2.07±0.11 0.82±0.08 2.78±0.30 1.10±0.12

續(xù)表7 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠臟器重量及臟體比的影響（n=10，±s）Continue table 7 Effects of ORPH on organ weight and organ/body weight ratio of rats（n=10，±s）

續(xù)表7 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠臟器重量及臟體比的影響（n=10，±s）Continue table 7 Effects of ORPH on organ weight and organ/body weight ratio of rats（n=10，±s）

組別 性別 肝重量/g 肝體比/% 脾重量/g 脾體比/% 腎重量/g 腎體比/% 睪丸（卵巢）重量/g 睪丸（卵巢）體比/%對(duì)照組 雌性 7.71±0.40 3.57±0.29 0.54±0.05 0.25±0.03 1.71±0.10 0.79±0.05 0.045±0.008 0.021±0.005高劑量組 雌性 7.58±0.47 3.72±0.31 0.49±0.04 0.24±0.02 1.67±0.06 0.82±0.06 0.043±0.009 0.021±0.004中劑量組 雌性 7.69±0.44 3.50±0.21 0.48±0.07 0.22±0.04 1.66±0.07 0.76±0.08 0.044±0.005 0.020±0.003低劑量組 雌性 7.66±0.43 3.65±0.27 0.53±0.05 0.25±0.02 1.69±0.09 0.81±0.07 0.046±0.007 0.022±0.005

表7結(jié)果顯示，各劑量組大鼠肝重量、脾重量、腎重量、睪丸（卵巢）重量與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（p＞0.05）；各劑量組肝/體比、脾/體比、腎/體比、睪丸（卵巢）/體比與對(duì)照組差異無(wú)顯著性（p＞0.05）。以上結(jié)果表明哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠各臟器均未見(jiàn)異常影響。

3.3.5 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠肝、腎、脾、胃等組織病理學(xué)的影響

解剖觀(guān)察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器，各劑量組與對(duì)照組大鼠的肝、腎、脾、胃、十二指腸、性腺（睪丸或卵巢）經(jīng)病理學(xué)檢查均未見(jiàn)與受試物相關(guān)的病理改變。高劑量組大鼠肝、腎試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表8、表9，（中低劑量組結(jié)果略，脾臟、胃、十二指腸、睪丸、卵巢病理學(xué)檢查結(jié)果略）。

表8 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠肝臟的影響Table 8 Effects of ORPH on liver tissue of rats

表8結(jié)果顯示，肝臟鏡下觀(guān)察：對(duì)照組雌性2例，雄性1例，高劑量組雌性2例，雄性2例可見(jiàn)肝小葉炎細(xì)胞浸潤(rùn)；對(duì)照組雌性2例，雄性1例，高劑量組雌性1例，雄性2例可見(jiàn)匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；其余被膜完整，未見(jiàn)增厚。肝細(xì)胞未見(jiàn)脂肪變性、出血和壞死改變。匯管區(qū)三管無(wú)明顯異常病理改變。以上結(jié)果表明高劑量組肝臟組織與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性（p＞0.05）。

表9 哈蟆油蛋白酶解物對(duì)大鼠腎臟組織的影響Table 9 Effects of ORPH on kidney of rats

表9結(jié)果顯示，腎臟鏡下觀(guān)察：腎小球未見(jiàn)明顯增大或萎縮、纖維化、變性等，毛細(xì)血管袢未見(jiàn)壞死，腎小球毛細(xì)血管未見(jiàn)擴(kuò)張充血、管壁未見(jiàn)增厚。小管上皮完好，間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。以上結(jié)果表明高劑量組大鼠腎臟與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

4 討論

《中國(guó)藥典》中哈蟆油具有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤(rùn)肺的功效，用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血等癥。規(guī)定內(nèi)服用量為5 g～15 g，用水浸泡、燉服或作丸劑服。哈蟆油中主要成分為蛋白質(zhì)，含量占50%以上，在機(jī)體內(nèi)，蛋白質(zhì)多數(shù)被水解成氨基酸作為合成蛋白質(zhì)的重要原料，同時(shí)作為活性物質(zhì)參與機(jī)體的代謝，以維持機(jī)體正常的生理功能。而必需氨基酸是機(jī)體本身不能合成或合成速度不能滿(mǎn)足人體需要，必須從食物中攝取的氨基酸。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生化的方法檢測(cè)哈蟆油蛋白酶解物中氨基酸含量，結(jié)果其含有必需氨基酸7種，包括賴(lài)氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，相對(duì)含量占到45.87%，其中蘇氨酸為16.48%，賴(lài)氨酸11.38%；半必需氨基酸共2種，為組氨酸和精氨酸，含量分別為0.52%和14.26%。蘇氨酸可防止肝臟中脂肪的累積，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等作用。賴(lài)氨酸可增加食欲，促進(jìn)胃蛋白酶的分泌，增強(qiáng)免疫能力，改善發(fā)育遲緩，防止蛀牙，提高鈣的吸收，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)，對(duì)兒童發(fā)育，增加體重和身高具有明顯作用[10-11]。精氨酸具有重要的生理、代謝和營(yíng)養(yǎng)作用，幾乎機(jī)體中所有組織均利用精氨酸合成胞漿蛋白和核蛋白，精氨酸在促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)合成、增強(qiáng)機(jī)體的免疫力等作用[12-13]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明哈蟆油蛋白酶解物具有抗疲勞[14]、抗氧化[15]、耐缺氧[16]、增強(qiáng)免疫力[17]等功效。因此攝食哈蟆油蛋白酶解物，補(bǔ)充體內(nèi)的必需氨基酸具有重要意義。

在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中給予小鼠最大劑量灌胃，死亡0例，故無(wú)法測(cè)出該制劑的LD50。因此本試驗(yàn)采用最大耐受劑量法進(jìn)行試驗(yàn)，灌胃給予受試藥物20 g/（kg·BW），1 d內(nèi)給藥2次，連續(xù)給藥14 d。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到，最大給藥劑量20 g/（kg·BW）為人日服劑量的127倍，在此劑量下哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠無(wú)急性毒性反應(yīng)，提示臨床用藥安全。

在30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)中，哈蟆油蛋白酶解物給藥量分別為15.75、11.81、7.87 g/（kg·BW），分別為人日服劑量的100倍、75倍和50倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各劑量組大鼠外觀(guān)體征、行為無(wú)異常變化，大鼠體質(zhì)量、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器重量、臟/體比、臟器組織病理檢查均未見(jiàn)異常。以上結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，哈蟆油蛋白酶解物對(duì)受試動(dòng)物是安全、無(wú)毒副作用。

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Study on Amino Acid Composition and Safety Evaluation of Protein Hydrolysate of Oviductus Ranae

WEI Xing-hua1，ZHANG He2，3，*，PANG Bo3，PAN Dai-an3，QI Bin3，BAI Xue-yuan3，ZHAO Yu3，ZHAO Da-qing3，*
（1.Jilin Science Service Center，Changchun 130021，Jilin，China；2.Experiment Center，The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130021，Jilin，China；3.Development Center of Traditional Chinese Medicine and Bioengineering，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

To study amino acid composition of protein hydrolysate of Oviductus Ranae （ORPH），to make a safety evaluation according to the acute toxicity and 30-days feeding test.RP-HPLC coupling with precolumn derivatization for determination of amino acid of ORPH.Acute oxicity test of ORPH was carried out by giving mice maximum tolerance dose，to observed the toxic reactions and mortality rate.In the 30-days feeding tset of ORPH，the high，middle，and low dose group was 100 times，75 times，and 50 times of the clinical dosage in human，respectively，then to observed the general behaviors，body weight，blood routine indiexes，serum biochemical indexes，organ weight，organ coefficient and tissue pathological change of mice.The results of amino acid composition showed that content of total essential amino acids accounted for 45.87%，content of total semi-essential amino acid accounted for 14.78%.The results of acute toxicity test showed the ORPH did not have toxicity，when the maximum dosage was 127 times of the clinical dosage in humans.Compared with control group，the 30-days feeding test showed that all detected indexes were no significant difference in each does group.In conclusion，ORPH has no acute toxic effect and is a safe function food on mice's growth，development，metabolism and viscera organs，meanwhile ORPH provides plenty of essential amino acids for organism.

protein hydrolysate of Oviductus Ranae （ORPH）；amino acid；acute toxicity test；30-daysfeeding test；safety evaluation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.003

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81503243）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140204065YY、20150311031YY）

魏星華（1983—），男（漢），工程師，碩士，主要從事食品安全研究。

*通信作者：張鶴（1985—），女（漢），助理研究員，博士，主要從事中藥有效成分研究；趙大慶（1963—），男（漢），研究員，博士，主要從事中藥有效成分研究。

2017-03-28