混合菌種兩步發(fā)酵法對豆粕肽轉(zhuǎn)化及品質(zhì)的影響

楊文宇，?；郏愓宴?，丁之恩

（安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥230000）

混合菌種兩步發(fā)酵法對豆粕肽轉(zhuǎn)化及品質(zhì)的影響

楊文宇，?；?，陳昭琪，丁之恩*

（安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥230000）

以枯草芽孢桿菌和黑曲霉好氧發(fā)酵作為前發(fā)酵，再以釀酒酵母及保加利亞乳酸桿菌厭氧發(fā)酵作為后發(fā)酵對豆粕進行兩步發(fā)酵。結果表明：第一步發(fā)酵中肽的轉(zhuǎn)化率為52.01%，第二發(fā)酵中肽的轉(zhuǎn)化率為65.08%，且兩步發(fā)酵優(yōu)于一步發(fā)酵。

混合菌種；固態(tài)發(fā)酵；豆粕；肽的轉(zhuǎn)化率

豆粕，又稱“大豆粕”是大豆提取豆油后所得的一種副產(chǎn)品，它的營養(yǎng)成分主要有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，以及多種礦物質(zhì)、纖維素和必需氨基酸[1]，是一種營養(yǎng)豐富、營養(yǎng)成分種類齊全、營養(yǎng)物質(zhì)含量均衡的植物性蛋白飼料源。但是豆粕所含蛋白質(zhì)中的水溶性蛋白質(zhì)占據(jù)很大比重，由于這些水溶性蛋白質(zhì)分子量較大、結構復雜，如果直接將豆粕用于飼養(yǎng)動物，豆粕中的蛋白質(zhì)被消化吸收利用率不高，就會造成豆粕資源浪費，從而提高了飼養(yǎng)成本，限制了豆粕的廣泛應用。因此，降解豆粕蛋白才能進一步提高豆粕的營養(yǎng)性能和使用價值，擴大豆粕的使用范圍。

作為降解蛋白質(zhì)效果來看，對豆柏進行微生物發(fā)酵處理是最理想的方法。微生物發(fā)酵的原理是利用微生物在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生呼吸酶、發(fā)酵酶和水解酶[2]，可以分解豆粕蛋白產(chǎn)生小肽。因此，國內(nèi)外學者對發(fā)酵豆柏開展了大量研究。楊柳等[3]采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕，可獲得可溶性蛋白質(zhì)的含量為165.8 μmol/g，大豆球蛋白的含量為11.4 μmol/g。張良等[4]采用米曲霉、枯草芽孢桿菌、根霉和酵母菌，進行混合菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽的含量達17.97%。吳寶昌等[5]對枯草芽飽桿菌與黑曲霉混合發(fā)酵制備豆粕飼料的條件進行研究，在最優(yōu)條件下測得發(fā)酵豆粕的肽轉(zhuǎn)化率值為40.8%。Laura等[6]用12株對乳酸菌發(fā)酵豆粕研究發(fā)現(xiàn)，大部分乳酸菌可降解大豆蛋白并提高了游離氨基酸、主要必需氨基酸和風味氨基酸前體含量。

本試驗以大豆肽的轉(zhuǎn)化率為試驗標準[7]，利用枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌，進行混合菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽，利用種間互惠、偏利共生等關系，進行協(xié)同發(fā)酵[8]。該方法成本低，是代替酶解蛋白和酸解蛋白較好的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：益海嘉里（安徽）糧油工業(yè)有限公司購買（水分為7.66%、粗蛋白為40.60%、脂肪為3.51%、灰分為5.89%及碳水化合物為42.34%）。

菌種：枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母和保加利亞乳酸桿菌均由來自安徽農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室保藏。

LB培養(yǎng)液：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0～7.2，經(jīng)121℃蒸汽滅菌30 min備用。察氏培養(yǎng)液：杭州百思生物技術有限公司提供。MRS培養(yǎng)液：杭州百思生物技術有限公司提供。

1.2 主要設備

凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司；GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備；DL-5-B飛鴿牌離心機：上海安亭科學儀器廠；SWCJ-1D超凈工作臺：江蘇通凈設備公司；PHSJ-4A PH計：合肥原點生物科技有限公司；ML204/02電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；SHA-C水浴恒溫震蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-180型紫外分光光度機：上海美譜達儀器公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；KNT-IV-10超純水機：北京塞多利斯科儀器廠；DFT-100多功能中藥粉粹機：溫嶺市大德中藥機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線的測定方法

取裝有培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶，貼上標簽（注明菌名、培養(yǎng)處理）。按無菌操作法用接種環(huán)挑取單菌落加入于培養(yǎng)液中。將接種后的培養(yǎng)基置于振蕩培養(yǎng)箱中，在適應的溫度條件下培養(yǎng)，分別光電比濁測定4種菌種的生長曲線，確定其對數(shù)生長期[9-10]。

1.3.2 豆粕第一步發(fā)酵單因素試驗及正交試驗的方法

本試驗主要確定混合菌種（枯草芽孢桿菌和黑曲霉）第一步發(fā)酵法最優(yōu)方法，考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基含水量和菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.2.1 第一步單因素試驗設計

1）發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為8%，菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵溫度為34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55%設為初始條件，發(fā)酵時間分別設定為 48、60、72、84、96 h，考察發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

2）發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為8%，菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55%設為初始條件，發(fā)酵溫度分別設定為 30、32、34、36、38 ℃，考察發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽的轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為8%，菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵溫度為34℃，設為初始條件，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量分別設定為45%、50%、55%、60%、65%，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

4）總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵溫度為34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55%設為初始條件，總接種量分別設定為4%、6%、8%、10%、12%，考察總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

5）菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為8%，發(fā)酵時間為72 h，發(fā)酵溫度為34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為55%設為初始條件，菌種體積比例（枯草芽孢桿菌∶黑曲霉）分別設定為1∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1，考察菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

1.3.2.2 第一步發(fā)酵正交試驗設計

根據(jù)第一步發(fā)酵單因素試驗得到的結果和Box-Behnken中心組合試驗設計原理，通過Design Expert軟件對本試驗展開設計以及數(shù)據(jù)分析處理，并檢驗其有效性。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.3 豆粕第二步發(fā)酵單因素試驗及正交試驗的方法

本試驗主要確定混合菌種（保加利亞乳酸桿菌和啤酒酵母）第二步發(fā)酵法最優(yōu)方法，考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基含水量和菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3.1 第二步發(fā)酵單因素試驗設計

1）發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為6%，菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵溫度為34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40%設為初始條件，發(fā)酵時間分別設定為 24、36、48、60、72 h，考察發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

2）發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為6%，菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40%設為初始條件，發(fā)酵溫度分別設定為 30、32、34、36、38 ℃，考察發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為6%，菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為34℃設為初始條件，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量分別設定為30%、35%、40%、45%、50%，考察發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

4）總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

菌種體積比例為1∶1，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40%設為初始條件，總接種量分別設定為2%、4%、6%、8%、10%，考察總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

5）菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響

總接種量為6%，發(fā)酵時間為48 h，發(fā)酵溫度為34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量為40%，設為初始條件，菌種體積比例（保加利亞乳酸桿菌∶釀酒酵母）分別設定為 1∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1，考察菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響。

1.3.3.2 第二步發(fā)酵正交試驗設計

根據(jù)第二步發(fā)酵單因素試驗得到的結果和Box-Behnken中心組合試驗設計原理，通過Design Expert軟件對本試驗展開設計以及數(shù)據(jù)分析處理，并檢驗其有效性。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.4 蛋白質(zhì)及肽的轉(zhuǎn)化率測定方法

1.4.1 蛋白質(zhì)測定方法

采用凱氏定氮測定[11]。

1.4.2 肽的轉(zhuǎn)化率測定方法[12]

大豆肽轉(zhuǎn)化率/%=酸溶蛋白含量/原豆粕蛋白含量×100

酸溶蛋白含量：采用三氯乙酸法測定[13]。

2 結果與分析

2.1 種子擴培時間的確定

種子擴大培養(yǎng)是發(fā)酵工程一個重要的組成部分，本試驗將冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入液體培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)一段時間后獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌種。4種菌種的生長曲線見圖1。

圖1 4種菌種的生長曲線Fig.1 Growth curve of four strains

通過圖1可以得出4種菌種種子擴培時間，4條曲線分別為枯草芽孢桿菌20 h，黑曲霉32 h，釀酒酵母菌18 h，保加利亞乳酸桿菌18 h。

2.2 第一步發(fā)酵單因素試驗及正交試驗結果

2.2.1 第一步發(fā)酵單因素試驗結果

圖2為第一步發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖2 第一步發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The effect of fermentation time on the conversion rate of soybean peptide

由圖2能夠看出，當發(fā)酵時間從48 h延長至72 h，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物大量繁殖，分解豆粕中的蛋白質(zhì)的速度加快，使大豆肽含量增加，是由于混菌之間為協(xié)同關系共同產(chǎn)生蛋白酶水解大豆蛋白，這是前72 h大豆肽轉(zhuǎn)化率快速上升的主要原因。當發(fā)酵時間超過72 h時，大豆肽轉(zhuǎn)化率基本保持不變。

圖3為第一步發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖3 第一步發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The effect of fermentation temperature on the conversion rate of soybean peptide

由圖3能夠看出，當溫度從30℃升高到36℃時，大豆肽的轉(zhuǎn)化率也在平緩增加。這是由于溫度上升，導致枯草芽孢桿菌和黑曲霉的生長繁衍加快，而且隨溫度升高枯草芽孢桿菌和黑曲霉產(chǎn)生的蛋白酶能夠加快分解大豆蛋白速度。當溫度超過36℃時，大豆肽的產(chǎn)量有下降的趨勢，是因為偏高的溫度抑制枯草芽孢桿菌和黑曲霉正常的生長代謝，同時損壞枯草芽孢桿菌和黑曲霉產(chǎn)生的分解大豆蛋白的蛋白酶功能，最后使得大豆肽的轉(zhuǎn)化率值略微下降。

圖4為第一步發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖4 第一步發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 The effect of water content of fermentation medium on the conversion rate of soybean peptide

由圖4能夠看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量從45%上升到60%過程中，大豆肽轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出逐步上升現(xiàn)象。這是因為水分是維持枯草芽孢桿菌和黑曲霉正常的生理活動的必要生命營養(yǎng)物質(zhì)，同時也是能提高枯草芽孢桿菌和黑曲霉產(chǎn)生分解豆粕蛋白的蛋白酶活力。當發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量超過60%，大豆肽轉(zhuǎn)化率急劇下降。這是因為過多的水分可能影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉細胞膜的通透性，從而影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉生產(chǎn)蛋白酶功能，所以導致大豆肽轉(zhuǎn)化率下降。

圖5為第一步發(fā)酵總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖5 第一步發(fā)酵總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The effect of inoculation amount on the conversion rate of soybean peptide

由圖5能夠看出，總接種量從4%到8%時，大豆肽轉(zhuǎn)化率是按照一定的比例增長。這是因為加大枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種量，使得枯草芽孢桿菌和黑曲霉生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量增多。當總接種量超過8%時，大豆肽轉(zhuǎn)化率下降。這是因為接種枯草芽孢桿菌和黑曲霉量過大，致使枯草芽孢桿菌和黑曲霉生長速度過快，從而消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，從而導致大豆肽含量下降。

圖6為第一步發(fā)酵菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖6 第一步發(fā)酵菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 The effect of volume ratio of fermentation bacteria on the conversion of soybean peptides

由圖6能夠看出，隨著枯草芽孢桿菌占總接種量的比例逐漸增大，大豆肽轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)升高趨勢。這種現(xiàn)象可能的原因是枯草芽孢桿菌比黑曲霉生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量多，或者枯草芽孢桿菌比黑曲霉生產(chǎn)蛋白酶分解大豆蛋白的能力更強。因此，發(fā)酵菌種體積比例為2∶1時大豆肽轉(zhuǎn)化率最高。

2.2.2 第一步發(fā)酵正交試驗結果分析

通過正交試驗，以大豆肽的轉(zhuǎn)化率為參考指標，來研究這四因素三水平對大豆肽的轉(zhuǎn)化率的影響程度，見表 3、表 4。

通過表3、表4能夠得出，最適水平組合為A1B2C3D3，即發(fā)酵溫度為34℃，培養(yǎng)基的含水量為60%，總接種量為10%，菌種體積比例為3∶1。分別對大豆肽轉(zhuǎn)化率影響的4個因素順序為：B（發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量）＞C（總接種量）＞D（菌種比例）＞A（發(fā)酵溫度）。由方差分析表顯示：發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量、總接種量和菌種比例3個因素都具有顯著性。

表3 正交試驗結果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

2.2.3 驗證試驗

對最優(yōu)組合A1B2C3D3驗證試驗，作3個平行，結果取平均值，驗證試驗結果為52.01%，同試驗理論結果接近。

2.3 第二步發(fā)酵單因素試驗及正交試驗結果

2.3.1 第二步發(fā)酵單因素試驗結果

圖7為第二步發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖7能夠看出，當發(fā)酵時間從24 h延長至48 h，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物大量繁殖，分解豆粕中的蛋白質(zhì)的速度加快，使大豆肽含量增加，是由于混菌之間為協(xié)同關系共同產(chǎn)生蛋白酶水解大豆蛋白，這是前48 h大豆肽轉(zhuǎn)化率快速上升的主要原因。當發(fā)酵時間超過48 h時，大豆肽略有下降?？赡茉蚴前l(fā)酵后期釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌發(fā)生自溶現(xiàn)象，另一原因是隨著發(fā)酵時間的延伸，豆粕中的營養(yǎng)物質(zhì)不足以使釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌開始變?yōu)楦偁庩P系而相互抑制。

圖7 第二步發(fā)酵時間對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of second step fermentation time on the conversion rate of soybean peptide

圖8為第二步發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖8 第二步發(fā)酵溫度對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of second step fermentation temperature on the conversion rate of soybean peptide

由圖8能夠看出，當溫度從30℃升高到36℃時，大豆肽轉(zhuǎn)化率也在逐漸增加。這是由于溫度上升，導致釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌的生長繁衍加快，而且隨溫度升高釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌的蛋白酶能加快分解大豆蛋白速度。當溫度超過36℃時，大豆肽含量急速下降，是因為過高的溫度抑制釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生長代謝，同時損壞釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌產(chǎn)生的分解大豆蛋白的蛋白酶功能，最后使得大豆肽轉(zhuǎn)化率值變小。

圖9為第二步發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響，由圖9能夠看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量從30%上升到45%過程中，大豆肽轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)出逐步上升現(xiàn)象。這是因為水分是維持釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌正常的生理活動的必要生命營養(yǎng)物質(zhì)，同時也是能提高釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌產(chǎn)生分解豆粕蛋白的蛋白酶活力。當發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量超過45%，大豆肽轉(zhuǎn)化率急劇下降。這是因為過多的水分可能影響釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌細胞膜的通透性，會進一步影響釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生產(chǎn)蛋白酶功能，所以大豆肽轉(zhuǎn)化率下降。

圖9 第二步發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9 Effect of water content of second step fermentation mediumon the conversion rate of soybean peptide

圖10為第二步發(fā)酵總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

圖10 第二步發(fā)酵總接種量對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.10 Effect of second step inoculation amount on the conversion rate of soybean peptide

由圖10能夠看出，總接種量從2%到8%時，大豆肽的轉(zhuǎn)化率是按照一定的比例增長。這是因為加大釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌接種量，使得釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量增多。當總接種量超8%時，大豆肽轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢。這是因為接種釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌量過大，致使釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生長速度過快，從而消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，從而導致大豆肽轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢。

圖11為第二步發(fā)酵菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響。

由圖11能夠看出，隨著保加利亞乳酸桿菌占總接種量的比例逐漸增大,大豆肽轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)升高趨勢,當菌種體積比為2∶1時肽轉(zhuǎn)化率最高,此時大豆肽轉(zhuǎn)化率最大值為63.43%。這種現(xiàn)象可能的原因是保加利亞乳酸桿菌比釀酒酵母生產(chǎn)分解大豆蛋白的蛋白酶的量多，或者保加利亞乳酸桿菌比釀酒酵母生產(chǎn)蛋白酶分解大豆蛋白的能力更強。

圖11 第二步發(fā)酵菌種體積比例對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.11 Effect of volume ratio of second step fermentation strains on conversion of soybean peptides

2.3.2 第二步發(fā)酵正交試驗結果

通過正交試驗，以大豆肽的轉(zhuǎn)化率為參考指標，來研究這四因素對大豆肽的轉(zhuǎn)化率的影響程度，見表5、表 6。

表5 正交試驗結果及分析表Table 5 Results and analysis of orthogonal test

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance table

通過表5、表6能夠得出，最適水平組合為A2B2C1D2，即菌種體積比例為2∶1、發(fā)酵溫度為36℃，培養(yǎng)基的含水量為40%，接種量為8%。分別對大豆肽的轉(zhuǎn)化率影響的4個因素順序為：A（菌種比例）＞B（溫度）＞C（發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量）＞D（總接種量）且菌種比例、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基的含水量3個因素都具有顯著性。

2.3.3 驗證試驗

對最優(yōu)組合A2B2C1D2驗證試驗，作3個平行，結果取平均值，驗證試驗結果為65.08%，同試驗理論結果接近。

3 討論

本試驗研究得出了兩步固態(tài)發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件：以壓榨的豆粕為原料，并進行60目粉碎，首先試驗選用的菌種為枯草芽孢桿菌和黑曲霉對豆粕進行有氧發(fā)酵，確定最優(yōu)條件：發(fā)酵溫度是34℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量是60%，總接種量是10%，發(fā)酵時間是72 h，菌種體積比例是3∶1?？莶菅挎邨U菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生水解能力較強的蛋白酶，分解大分子物質(zhì)為小分子物質(zhì)，尤其在生長代謝中產(chǎn)生的外肽酶，能夠?qū)Χ蛊芍械目嚯倪M行分解。黑曲霉發(fā)酵豆粕的過程中能夠產(chǎn)生豐富的酶系，如酸性蛋白酶、果膠酶等，能夠更好的作用于豆粕，并且降解豆粕中的多糖，蛋白質(zhì)和細胞壁，進而提高發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)含量。然后對第一步發(fā)酵后的豆粕進行再發(fā)酵，選用的菌種保加利亞乳酸桿菌和釀酒酵母進行厭氧發(fā)酵，確定最優(yōu)條件：溫度是36℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的含水量是40%，總接種量是8%，發(fā)酵時間是48 h，確定最優(yōu)條件菌種體積比例是2∶1。保加利亞乳酸菌和釀酒酵母菌在發(fā)酵豆粕的過程中，產(chǎn)生大量的有機酸，使豆粕的pH值下將，有利于抑制有害微生物的生長，同時又能進一步分解大豆蛋白，提高大豆肽的濃度。經(jīng)過兩步發(fā)酵豆粕的大豆肽含量為26.42%與大豆肽轉(zhuǎn)化率為65.08%。此結果比劉天蒙[14]等單菌發(fā)酵，李善仁[15]等一步混菌發(fā)酵的效果更好。由此得出混菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵豆粕效果好[16-21]，兩步固態(tài)發(fā)酵比一步固態(tài)發(fā)酵豆粕效果好[22-25]。此結論可為發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽提供新的試驗依據(jù)。

[1] 吳建平.日本生理活性肽的市場動態(tài)[J].食品工業(yè),1998(3):8-9

[2] 劉海燕.丘玉朗,魏炳棟,等.微生物發(fā)酵研究進展[J].動物營養(yǎng)學報,2012,24(1):35-40

[3] 楊柳,陳宇飛,王磊,等.多菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝研究[J].飼料加工,2016,4(12):44-47

[4] 張良,劉洋,劉嘉,等.混合菌種固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽的工藝研究[J].飼料工藝新技術,2013,7(26):26-28

[5] 吳寶昌,宋俊梅.枯草芽孢桿菌與黑曲霉混合發(fā)酵制備豆粕飼料[J].山東輕工業(yè)學院學報,2010,24(1):54-57

[6] Laura Aguirre,Marisa S Garro,Graciela Savoy de Giori.Enzymatic hydrolysis of soybean protein using lactic acid bacteria[J].Food Chemistry,2008,111(4):976-982

[7] 管國強,崔鵬景,宋慶春,等.枯草芽孢桿菌ZC1發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的條件研究[J].食品工業(yè),2015,36(12):194-198

[8] 土金斌,馬海樂,段玉清,等.豆粕固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高蛋白飼料的菌種篩選試驗[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(19):8112-8114

[9] 周德慶.微生物學教程[M].北京:高等教育出版社,2002:152-166

[10]武漢大學復旦大學生物系微生物學教研室編.微生物學[M].北京:人民教育出版社,1990:448-449

[11]黃偉坤.食品檢驗與分析(第1版)[M].北京:輕工業(yè)出版社,1989:8-9

[12]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.5-2010食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[13]王芳,逢瑞玥.對大豆肽粉中酸溶蛋白含量測定方法的改進[J].黑龍江糧食,2005(5):35-37

[14]劉天蒙,宋俊梅,秦思思.溫度變化對固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽工藝影響的研究[J].中國釀造,2010(10):111-112

[15]李善仁,林新堅,蔡海松,等.混菌發(fā)酵豆粕制備大豆肽的研究[J].中國糧油學報,2009,24(12):52-55

[16]石慧,羅璇,劉艷.兩步發(fā)酵法降解大豆抗原蛋白的研究[J].飼料工業(yè),2011,32(3):22-25

[17]劉天蒙,宋俊梅,秦思思.溫度變化對固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽工藝影響的研究[J].中國釀造,2010(10):111-112

[18]李善仁,林新堅,蔡海松,等.混菌發(fā)酵豆粕制備大豆肽的研究[J].中國糧油學報,2009,24(12):52-55

[19]Stale R,Stefan S,Erland B,et al.Lactic acid fermentation eliminates indigestible carbohydrates and antinutritional factors in soybean meal for Atlantic salmon(Salmo Salar)[J].Aquaculture,2005,246:331-345

[20]Frias J,Song YS,Martinez-Villaluenga C,Gonzalez de Mejia E,et al.Immunoreactivity and amino acid content of fermented soybean products[J].J Agric FoodChem,2008,56(1):99-105

[21]Shin R,Suzuki M,Mizutani T,et al.Improvement of experimentally induced hepatic and renal disorders in rats using lactic acid bacteria-fermented soybean extract(biofermentics TM)[J].Evid based Complement Alternat Med,2007,27:257-363

[22]Junko Y,Chen H M,Takako N,et al.Changes of Functional Components and Antioxidative Activity in the Process ofFermentation of Soybeans[J].Chemistry,Texture,andFlavorofSoy,2010(10):155-169

[23]Clelanda D,Jastrzembskia K,Stamenovab E,et al.Growth characteristics of microorganisms on commercially available animal-free alternatives to tryptic soy medium[J].Journal of Microbiological Methods,2007,69(2):345-352

[24]Chang J,Yin Q Q,Wang P P,et al.Effect of fermented protein feedstuffs on pig production performance,nutrient digestibility and fecal microbes[J].TurkishJournalofVeterinaryandAnimalSciences,2012,36(2):143-151

[25]Zhang H Y,Yi J Q,Piao X S,et al.The metabolizalbe energy value standardized ileal digestibility of amino acids in soybean meal soy protein concentrate and fermented soybean meal and the application of these products in early-weaned piglets[J].Asian Australasian Tournal of Animal Sciences,2013,26(5):691-699

Effect of Mixed Strains Fermentation on the Two Step Conversion and Quality of Soybean Meal Peptide

YANG Wen-yu，CHANG Hui，CHEN Zhao-qi，DING Zhi-en*
（College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agriculture University，Hefei 230000，Anhui，China）

Two-step fermentation were implemented as follows：Bacillus subtilis and Aspergillus niger aerobic fermentation were used as primary fermentation，then Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus bulgaricus anaerobic fermentation were used as secondary fermentation.The results showed that the percent conversion of peptide in the first step was 52.01%，the second step was 65.08%，additionally，the two-step fermentation was superior to one step fermentation.

mixed strains；solid state fermentation；soybean meal；conversion of peptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.038

國家科技支撐計劃項目（2012BAD14B13）；院科創(chuàng)新團隊項目（14C1207）

楊文宇（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品安全檢測。

*通信作者：丁之恩，教授，博士生導師，長期從事農(nóng)產(chǎn)品加工，天然產(chǎn)物提取分離的教學和科學研究工作。

2017-02-23