青錢柳組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展概述

方利娟+黃宇+丁文彬+黃+穎+覃淋琳

摘 要：青錢柳具有極高的藥用價(jià)值和保健作用，是國家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一。該文從對(duì)青錢柳外植體的選擇、處理以及不同階段培養(yǎng)基的選擇等方面對(duì)近幾年青錢柳植物的組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

關(guān)鍵詞：青錢柳；組織培養(yǎng)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S792 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）19-0026-2

Research Advances and Prospects of Tissue Culture Propagation Techniques for Cyclocarya paliurus

Fang Lijuan et al.

（Baise University，Baise 533000，China）

Abstract：Cyclocarya paliurus is a Chinese native plant with very high pharmaceutical value and healthcar function.On the basis of discussing and processing about the explants，culture media proper to the tissue culture of Cyclocarya paliurus in recent years were summarized.

Kay words： Cyclocarya paliurus；Tissue culture；Research progress

青錢柳（Cyclocarya paliurus）又稱為山麻柳、山化樹等，系雙子葉植物綱原始花被亞綱胡桃目胡桃科青錢柳屬植物[1]。果實(shí)為堅(jiān)果，扁球形，中部周圍有革質(zhì)狀翅如銅錢，所以得名搖錢樹，為我國特有的單種屬珍稀樹種，是國家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一，其樹葉、樹皮、樹根均可入藥。

我國從20世紀(jì)70年代末開始漸漸地有了對(duì)青錢柳的研究，近年來，青錢柳的藥用、觀賞價(jià)值被廣泛的研究、開發(fā)與利用。但是青錢柳天然資源稀缺，其僅僅分布在華東、華南海拔500～2500m的一些溪谷、森林或保護(hù)區(qū)內(nèi)[2]。青錢柳內(nèi)含有多種對(duì)人體有效的物質(zhì)，若是只從植株提取有效成分，不僅得到的提取物少，不利于植物的生長，甚至?xí)斐晌锓N的滅絕，而細(xì)胞培養(yǎng)可以大批量地生產(chǎn)有效的次級(jí)代謝產(chǎn)物，供人們利用。另外，因其種皮內(nèi)有較強(qiáng)的抑制物，種子繁殖下，播種后需要一年或者更長時(shí)間才能萌發(fā)[3-4]，而組織培養(yǎng)可以保持品種的優(yōu)良特性、生長快、短期內(nèi)獲得大量后代，是解決青錢柳供不應(yīng)求的最佳方法。

1 外植體的選擇季節(jié)

吳群英[5]等在春夏秋3個(gè)季節(jié)的不同時(shí)間采集青錢柳的新苗、帶節(jié)莖段和嫩葉作為實(shí)驗(yàn)材料，探究了在不同季節(jié)采集的外植體產(chǎn)生愈傷組織、出芽和生根特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：春季取的外植體更容易誘導(dǎo)出愈傷組織和新芽，出芽率和形成愈傷組織能力分別達(dá)到29.17%、20.83%。王紀(jì)[6]等從春夏秋冬4個(gè)季節(jié)中采取青錢柳的莖段，經(jīng)過相同的消毒滅菌處理后發(fā)現(xiàn)，4月份的尖端誘導(dǎo)率高達(dá)31.82%，污染率最低為11.36%。因此，青錢柳的組培最適合在春季采摘。

2 外植體的處理方式

2.1 種子 采集的種子風(fēng)干后，利用物理密度差原理，篩選較為飽滿的種子。首先用70%的乙醇溶液浸泡1min。然后用0.2%的HgCl2浸泡20min，無菌水沖洗5遍。準(zhǔn)備接種前，用70%的酒精浸泡1min，0.2%的HgCl2溶液浸泡20min。最后用無菌水沖洗5次。這種處理方法的萌發(fā)率在71.1%以上，污染率在1.75%以下[7]。

2.2 嫩葉 用洗潔精溶液浸洗30min，將葉面的灰塵和部分菌體用軟毛刷刷干凈，但是不能破壞嫩葉。再用子自來水連續(xù)沖1h，瀝干水后將葉片剪成似1cm×1cm的正方形左右大小，在盡可能無微生物的環(huán)境中進(jìn)行操作。用75%的酒精浸泡2～3s，然后置于0.1%的HgCl2浸泡5min，最后用無菌水洗4次，每次1min左右，倒出水分后將其夾入無菌接種盤中，用手術(shù)刀將與液體接觸的邊緣切去小部分。接種后用雙層錫箔紙封口[8]。用以上方法，有30%左右能誘導(dǎo)出愈傷組織，且污染率為零。

2.3 莖段 用洗潔精溶液浸洗30min，將莖段的灰塵和部分菌體用軟毛刷刷干凈，但是不能破壞腋芽。再流水沖洗1h，瀝干水后將葉片剪成1.5～2cm，莖段需含1～2個(gè)不定芽，在超凈工作臺(tái)上操作。用75%的酒精浸泡2～3s，然后置于0.1%的HgCl2浸泡14min，最后用無菌水沖洗4次每次在1min左右，倒出水分后將其夾入無菌接種盤中，用手術(shù)刀將與液體接觸的兩端邊緣切去小部分。誘導(dǎo)率可達(dá)83.33%，污染率接近于0[8]。

3 培養(yǎng)基的選擇

用不同量的化學(xué)物質(zhì)配制的培養(yǎng)基對(duì)來源不一致的植體有不一樣的效果。來源不一致的外植體在相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)中所發(fā)生的反應(yīng)也會(huì)不同。所以誘導(dǎo)外植體時(shí)要根據(jù)我們的目的，來對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行選擇。

3.1 誘導(dǎo)成苗 王紀(jì)[6]等以青錢柳浙江、貴州、云南3個(gè)種源的離體胚作為外植體，經(jīng)過消毒處理后，將其置于WPM、MS、DKW這3種基本培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，然后置于特定的環(huán)境中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)后經(jīng)過數(shù)據(jù)的記錄與統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配方為WPM附加3.0%蔗糖和0.6%瓊脂。更為適合離體胚發(fā)育成苗，經(jīng)過數(shù)據(jù)的記錄與整理發(fā)現(xiàn)成苗的概率有80%。

3.2 誘導(dǎo)成芽 吳群英[4]等以B5為基本培養(yǎng)基，研究不同激素組合對(duì)嫩芽、莖段、和嫩葉進(jìn)行誘導(dǎo)出芽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有莖段誘導(dǎo)出芽，最佳組合為B5+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.01mol/L NAA+0.1mol/L IBA誘導(dǎo)率最高為29.17%。胡冬南[9]等以一年生莖段為研究材料，莖段經(jīng)過處理后，將其分別接種于以MS、1/2MS、改良MS（氯化鈣和硫酸鎂的量為MS的3/4，其余的量與MS培養(yǎng)基一致）、DKW、endprint

1/2DKW、和改良DKW這幾種配方配制成等量的培養(yǎng)基，同時(shí)這6種培養(yǎng)基均加了0.5mg/L的反式玉米素和0.1mg/L NAA。經(jīng)過試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)第3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的莖段萌芽率最高，且可達(dá)90.9%。

3.3 誘導(dǎo)成愈傷組織 王紀(jì)[7]等培養(yǎng)了無菌苗后用其莖段、嫩葉作為外植體，經(jīng)過前處理后將其接種于MS、WPM、和改良的DKW這3種培養(yǎng)基中，置于指定環(huán)境總誘導(dǎo)成愈傷組織。對(duì)激素6-BA和IBA不同濃度進(jìn)行研究，研究結(jié)果培養(yǎng)基組合MS+5.0mol/L 6-BA+2.0mol/LIBA對(duì)莖段的誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%，誘導(dǎo)出來的愈傷組織量最多而且沒有褐化的現(xiàn)象。吳群英[4]等將嫩芽、莖段、嫩葉經(jīng)過預(yù)處理后接種于以B5為基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合B5+5.0mol/L BA+0.1mol/L NAA+0.1mol/L IBA對(duì)嫩葉的誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)率為93.33%。不同的外植體，應(yīng)選擇合適的配方進(jìn)行培養(yǎng)，這樣更容易誘導(dǎo)出愈傷組織。

3.4 增殖培養(yǎng)基 王紀(jì)[10]等對(duì)青錢柳的莖段、幼嫩的頂芽或側(cè)芽進(jìn)行培養(yǎng)出來的愈傷組織進(jìn)行增殖處理。將愈傷組織分別接種在MS、WPM和前人改良的DKW為基本培養(yǎng)基中，其中分別加入不同量的6-BA和IBA。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)葉片愈傷組織增殖效果最好的培養(yǎng)基配方為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA，增長率可達(dá)1400%。謝寅峰[11]等對(duì)從江蘇鎮(zhèn)江采集的三年生青錢柳嫩葉作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織，再對(duì)愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組分為：MS+20.0g/L蔗糖+0.2mg/L KT+0.2mg/L

2，4-D最適合葉片愈傷組織的增殖，增長率可達(dá)到1024.51%。

參考文獻(xiàn)

[1]胡冬南，蔣艷，吳少福，等.青錢柳組織培養(yǎng)的初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（1）：39-41.

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[5]吳群英，徐慶，李麗亞，等.青錢柳不同外植體組織培養(yǎng)及褐變防止的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008（08）：1872-1874.

[6]王紀(jì)，楊靜，楊萬霞，等.取樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（34）：154-156.

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[8]程茂高，喬卿梅，魏志華.青錢柳愈傷組織培養(yǎng)條件研究的優(yōu)化[J].鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2009（01）：12-14.

[9]胡冬南，上官新晨，劉亮英，等.青錢柳莖段離體培養(yǎng)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（6）：1300-1303.

[10]Wang J.A Preliminary Study on Callus Induction and Proliferation of Cylocarya paliurus[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2012.

[11]謝寅峰，張志敏，張穎穎，等.青錢柳愈傷組織增殖[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（6）：16-18.

（責(zé)編：張宏民）endprint