454高通量技術比較兩種不同臭豆腐鹵水中微生物多樣性

賀 靜， 謝 靚， 曾玉倫， 陳淼芬， 蔣立文*

(1.湖南農業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128)

454高通量技術比較兩種不同臭豆腐鹵水中微生物多樣性

賀 靜1,2， 謝 靚1,2， 曾玉倫1,2， 陳淼芬3， 蔣立文1,2*

(1.湖南農業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯合工程研究中心，湖南 長沙 410128)

利用454高通量技術對兩種不同臭豆腐鹵水中微生物不同分類水平的多樣性進行了評估和統計分析。經過與SILVA數據庫對比,發(fā)現了7個門、10個綱、17個目、26個科、24個菌屬。經分析發(fā)現兩個樣品的微生物不同分類學差異顯著，主要集中在屬水平上，分布都非常不均一。在樣品A中厭氧球菌屬和卟啉單胞菌屬所占的比例最高，分別為40.22%、37.54%，成為優(yōu)勢菌屬。兩個樣品之間相同的微生物屬只有6個，比例差別極大。在樣品B中氨基桿菌屬的比例很大，為86.94%，占絕對優(yōu)勢。說明鹵水原料來源不同對微生物的差異顯著，同時發(fā)現臭豆腐鹵水的發(fā)酵過程只與少數主要菌種有關。

臭豆腐鹵水; 微生物; 高通量技術; 分析

臭豆腐是一種極具特色的臭味食品[1-2]。其特殊風味的形成，主要是豆腐在鹵水制作過程中豆豉、冬筍、香菇等在自身內源酶和微生物分泌酶系作用下形成大量包括吲哚、苯酚類風味成分使得豆腐具有特殊的氣味。由于其發(fā)酵周期長，不同品牌鹵水差異較大，因此研究鹵水制作過程中微生物多樣性和群落構成具有重要意義，例如徐睿烜[3]、孫貴朋等[4]、何理等[5]利用傳統方法從臭豆腐鹵水中分離得到了優(yōu)勢微生物。但基于傳統分離培養(yǎng)得到的微生物只能代表目前培養(yǎng)條件可能獲得的微生物，無法預測所有微生物的信息。目前研究表明可培養(yǎng)微生物在整個微生物群落中不超過1%，所以結果具有一定的局限性[6]。相比之下，采用PCR-DGGE等分子生物學手段為研究微生物多樣性和群落結果帶來了革命性的突破[7-8]。454高通量測序技術是一種可以在一次測序試驗中完成多個樣本的檢測，能獲得海量序列且靈敏度高，不僅能檢測出優(yōu)勢微生物，對于低豐度微生物也能檢出，能全面、準確地揭示環(huán)境中微生物的多樣性[9-10]。高通量測序技術已被廣泛用于發(fā)酵食品中，如發(fā)酵蔬菜[11-12]、發(fā)酵乳[13-17]、酒精飲料[18]、發(fā)酵豆腐[19-20]等。454高通量測序技術研究避開了微生物分離培養(yǎng)的過程，擴展了微生物資源的利用空間，為微生物的研究提供了有效工具[21-22]。本研究通過454高通量測序技術對兩種不同臭豆腐鹵水中微生物信息進行比較，以探討微生物與臭豆腐鹵水風味成分關系，為全面掌握臭豆腐鹵水中細菌的組成和改進臭豆腐鹵水的制作工藝提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品來源 兩份臭豆腐鹵水樣品A(CDH_1)、B(CDQ_2)來自湖南兩個不同的臭豆腐生產企業(yè)。

1.1.2 試劑及儀器 電泳儀(DYY-12，北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(GDS-8000，美國UVP 公司)； PCR儀(ABI GeneAmp?9700型)；454 Titanium FLX+測序儀，瑞士Roche；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統，Promega公司；TransStart Fastpfu DNA Polymerase，TransGen AP221-02；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，AXYGEN公司。

1.2方法

1.2.1 PCR擴增 采用破碎法提取兩份鹵水樣品中基因組DNA[11]，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA并進行DNA擴增，454測序由上海美吉公司完成。DNA擴增采用細菌 V1-V3 區(qū)通用引物。具體PCR擴增引物，正向引物為27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′；反向引物為533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTG-GCAC-3′(表1)。PCR擴增程序：①95 ℃預變性2 min；②95 ℃變性30 s；③55 ℃退火30 s；④72 ℃延伸30 s；⑤重復②～④ 25次；⑤72 ℃延伸5 min。PCR 反應產物用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后用于測序，焦磷酸測序按照 454 Roche GS-FLX 的標準流程進行。

表1 PCR 反應體系(20 μL)

1.2.2 數據分析 對454序列處理及后續(xù)數據進行分析采用一定的控制標準。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平(門、綱、目、科、屬)統計每個樣品的群落組成，采用SILVA的核糖體數據庫進行對比。同時對OTU數據進行進一步的分析，利用Rarefaction曲線、Rank-Abundance曲線進行了多樣性評估；利用Venn、PCA圖進行統計分析。

2 結果與分析

2.1微生物在門的水平進行分類及比較

由圖1和表2可知，從A(CDH_1)、B(CDQ_2)兩個樣品中共分離得到7個微生物菌門，其中都含有的有5個。在樣品A中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門為優(yōu)勢菌門，所占比例分別為49.25%、38.08%、11.07%，都超過10%；在樣品B中互養(yǎng)菌門為優(yōu)勢菌門，所占比例為87.21%。

2.2微生物在綱的水平進行分類比較

由圖2和表3可知，樣品A中屬于厚壁菌門的梭菌綱、屬于擬桿菌門的擬桿菌綱、屬于放線菌門放線菌綱也是高居前3位，所占比例分別為42.90%、38.07%、11.07%。樣品B中屬于互養(yǎng)菌門的互養(yǎng)菌綱所占比例達到87.21%，成為優(yōu)勢菌綱。其他微生物菌綱，如屬于厚壁菌門芽胞桿菌菌綱、屬于變形菌門的γ-變形菌綱和α-變形菌綱在兩個樣品中所占的比例都相對較低。同時發(fā)現屬于擬桿菌門的黃桿菌綱只在樣品A鹵水中少量出現了，樣品B鹵水中沒有出現。

圖1 不同鹵水樣品門分類Fig.1 Phyla classification of different brine

序號類別名稱樣品A/%樣品B/%1厚壁菌門(Firmicutes)49．253．632擬桿菌門(Bacteroidetes)38．084．003放線菌門(Actinbacteria)11．070．314互養(yǎng)菌門(Synergistetes)0．4987．215變形菌門(Proteobacteria)0．203．546其他(Others)-0．237無類別的(Unclassified)0．911．07

圖2 不同鹵水樣品綱分類Fig.2 Class classification of different brine

序號類別名稱樣品A/%樣品B/%1梭菌綱(Clostridia)42．901．472擬桿菌綱(Bacteroidia)38．074．003放線菌綱(Actinobacteria)11．070．274芽胞桿菌綱(Bacilli)6．241．315互養(yǎng)菌綱(Synergistia)0．4987．216γ?變形菌綱(Gammaproteobacteria)0．090．377α?變形菌綱(Alphaproteobacteria)0．052．248黃桿菌綱(Flavobacteria)0．01-9其他(Others)0．101．9710無類別的(Unclassified)0．991．17

2.3微生物在目的水平進行分類比較

由圖3和表4可知，兩個樣品中共24個微生物菌綱，相同的只占9種，在樣品A中分列前3位的是屬于梭菌綱的梭菌目、屬于擬桿菌綱的擬桿菌目、屬于放線菌綱的放線菌目，所占比例分別為42.89%、38.07%、10.09%。在樣品B中屬于互養(yǎng)菌綱的互養(yǎng)菌目的比例為87.21%，所占比例最高。其他微生物菌目，如黃桿菌目、棒狀桿菌目、鹽厭氧菌目、海洋螺菌目都只在樣品A鹵水中出現,但是所占比例極少；芽胞桿菌目、鞘脂單胞菌目、微球菌目只在樣品B鹵水中出現，所占比例也是極少的。兩個樣品微生物菌群變化不明顯。

圖3 不同鹵水樣品目分類Fig.3 Order classification of different brine

序號類別名稱樣品A/%樣品B/%1梭菌目(Clostridiales)42．891．472擬桿菌目(Bacteroidales)38．074．003放線菌目(Actinomycetales)10．09-4乳桿菌目(Lactobacillales)6．240．985互養(yǎng)菌目(Synergistales)0．4987．216黃色單胞菌目(Xanthomonadales)0．062．247根瘤菌目(Rhizobiales)0．030．248柄桿菌目(Caulobacterales)0．010．019黃桿菌目(Flavobacteriales)0．01-10棒狀桿菌目(Corynebacteriales)0．01-11鹽厭氧菌目(Halanaerobiales)0．01-12海洋螺菌目(Oceanospirillales)0．01-13芽胞桿菌目(Bacillales)-0．3314鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)-0．0415微球菌目(Micrococcales)-0．2716其他(Others)0．122．0517無類別的(Unclassified)1．151．17

2.4微生物在科的水平進行分類比較

由圖4和表5可以看出，兩個樣品中共26個微生物菌科。

圖4 不同鹵水樣品科分類Fig.4 Family classificationof different brine

樣品A中有很大一部分是科未定的，其比例占到42.36%；其次是屬于擬桿菌目的紫單胞菌科、屬于放線菌目的放線菌科，所占比例分別為37.63%、10.09%。而在樣品B中屬于互養(yǎng)目的互養(yǎng)菌科所占比例為87.21%，優(yōu)勢菌群幾乎沒有變化。兩個樣品中出現了11個不同的菌科，根瘤菌科、類芽胞桿菌科、球菌科、高溫放線菌科、微桿菌科、鞘脂單胞菌科、橙單胞菌科在樣品A中都沒有出現，在B鹵水中沒有發(fā)現黃桿菌科、棒狀桿菌科、鹽單胞菌科、鹽厭氧菌科?？傊?，在科水平上，兩個鹵水樣品的主要菌群變化不大，但是兩個鹵水的差異明顯。

表5 不同鹵水微生物科分類之間的差異

2.5微生物在屬的水平進行分類比較

由圖5和表6可知，厭氧球菌屬和卟啉單胞菌屬，在樣品A鹵水中為優(yōu)勢菌屬，所占比例分別為40.22%、37.54%，這兩種菌屬在樣品B鹵水中完全沒有出現；氨基桿菌屬在樣品B鹵水中的含量達到了86.94%，占絕對優(yōu)勢，而在樣品A鹵水的比例為0.49%。兩個樣品在24個菌屬中，僅有6個相同的菌屬，且所占比例差異較大，所以兩個樣品差異顯著。

圖5 不同鹵水樣品屬分類Fig.5 Genus classification of different brine

序號類別名稱樣品A/%樣品B/%1厭氧球菌屬(Anaerococcus)40．22-2卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)37．54-3放線桿菌屬(Actinobaculum)6．99-4肉桿菌屬(Atopostipes)5．05-5消化鏈球菌屬(Peptoniphilus)2．060．446四體球菌屬(Tetragenococcus)1．00-7氨基桿菌屬(Aminobacterium)0．4986．948擬桿菌屬(Bacteroides)0．362．559依格納季氏菌屬(Ignatzschineria)0．062．2410乳球菌屬(Lactococcus)0．010．0411乳桿菌屬(Lactobacillus)0．010．7212短波單胞菌屬(Brevundimonas)0．01-13鹽單胞菌屬(Halomonas)0．01-14棒狀桿菌屬(Corynebacterium)0．01-15假單胞菌屬(Kroppenstedtia)-0．0216微桿菌屬(Microbacterium)-0．1217鏈球菌屬(Streptococcus)-0．0118蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)-0．0319根瘤菌屬(Rhizobium)-0．0120芽胞桿菌屬(Brevibacillus)-0．0121未分級的(Norank)0．010．0222無法培養(yǎng)(Uncultured)0．030．5123其他(Others)0．874．4324未分類的(Unclassified)5．291．92

經過上面不同類水平的分析并結合圖6，還發(fā)現兩個樣品的微生物分布都高度集中在屬的水平上，且主要微生物菌群的變化都不明顯。

圖6 兩個樣品中細菌組成圖Fig.6 Compositions of bacteria in two samples

2.6Rarefaction曲線

Rarefaction曲線是從樣本中抽取一定量的個體，統計這些個體代表的物種數目，并以個體數與物種數來構建曲線。圖7橫坐標表示的是OTU數目，縱坐標表示的是樣本序列數，樣品A和B的曲線趨于平坦，說明測序數據足以覆蓋所有的微生物，表明了樣品中微生物的多樣性。對兩個樣品的豐度進行比較，可知樣品B(CDQ_2)中微生物的多樣性程度明顯比樣品A(CDH_1)要豐富。

圖7 Number of Reads Sampled label:0.97曲線Fig.7 Number of Reads Sampled label:0.97 curve

2.7Rank-Abundance曲線

Rank-Abundance曲線是分析多樣性的一種方式，可用來解釋多樣性的兩個方面，即物種豐度和物種均勻度。圖8中橫坐標表示OTU等級，縱坐標對應的是OTU中序列數的相對百分含量。樣品B(CDQ_2)的曲線比樣品A(CDH_1)的曲線稍緩，說明樣品B(CDQ_2)中的微生物分布更均一。

圖8 相對豐度圖Fig.8 Rank-Abundance curve

2.8OTU分布Venn圖

經過454高通量測序，在97%相似度水平上劃分 OTU，在樣品A(CDH_1)和B(CDQ_2)分別發(fā)現243個和360個高質量的OTU。圖9直觀地統計了兩個樣品中所共有和獨有的OTU數目及重疊情況。從圖9中可分析出重疊部分OTU占總OTU的4%左右，說明兩個樣品間微生物的差異性顯著。

圖9 維恩圖Fig.9 Venn diagram

2.9PCA分析

圖10中以樣本A(CDH_1)和樣本B(CDQ_2)中所有菌群做樣品，進行PCA分析，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是造成兩個樣品的兩個最大差異特征，貢獻率分別為100% 和0%。 兩個樣品出現明顯的分離狀態(tài)且距離比較遠，經分析可以推斷兩個樣品的菌落結構差異比較大。這種現象說明，原料來源不同，微生物的情況差異顯著。

圖10 主成分分析圖Fig.10 Principal Component Analysis

3 討 論

本研究通過454高通量技術，對兩個不同鹵水中的微生物多樣性和菌落結構進行了研究。Rarefaction曲線得出樣品B中微生物多樣性程度比樣品A高；Rank-Abundance曲線中得出樣品B曲線比樣品A平緩。從微生物的門、綱、目、科、屬的水平進行分類比較，測出了7個菌門、10個菌綱、17個菌目、26個菌科、24個菌屬。同時通過OTU分布Venn圖和PCA圖分析也發(fā)現兩個樣品中微生物的相似度不高，差異顯著。樣品A和樣品B中的微生物分布都非常不均一，都高度集中到屬的水平上。例如，樣品B中86.94%的細菌都是互養(yǎng)門、互養(yǎng)綱、互養(yǎng)目、互養(yǎng)科的氨基桿菌屬。經過以上研究發(fā)現臭豆腐鹵水的發(fā)酵過程只與少數主要菌種有關，為后續(xù)臭豆腐的工業(yè)化發(fā)展提供一定的依據。由于微生物發(fā)酵自然進行，樣品沒有辦法重復，有一定的偶然性，同類別的發(fā)酵食品品質指標有差異，如風味物質、感官等實際上還是原料、微生物、工藝等差異性造成的，所以下一步有必要對臭豆腐鹵水的原料在發(fā)酵過程中微生物群變化規(guī)律、生理生化反應、氣味物質形成及變化進行研究，以期待為傳統產業(yè)升級提供參考。

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ComparisonofTwoDifferentStinkyTofuBrinesMicrobialDiversitywith454High-ThroughputTechniques

HE Jing1, 2, XIE Jing1, 2, ZENG Yu-lun1, 2, CHEN Miao-fen3, JIANG Li-wen1, 2

(1.Coll.ofFoodSci. &Tech.,HunanAgric.Uni.,Changsha410128; 2.HunanProv.KeyLab.ofFoodSci. &Biotech.,Changsha410128; 3.Nat′l&Prov.UnionEngin.Res.Ctr.fortheVet.HerbalMed.Res. &Initiative,Coll.ofFoodSci. &Tech.,Changsha410128)

454 high-throughput techniques were used to evaluate and statistically analyze the microbial diversity assessment in two different stinky tofu brines. It was found 7 phyla, 10 classes, 17 orders, 26 families and 24 genera after comparing with SILVA database. Larger differences of microbial species and concentrated at the genus level, and the distribution was very heterogeneous were found in these two samples. In the sample AAnaerococcusandPorphyromonasowe the highest proportion, 40.22%, 37.54% respectively. Only six of the same genus in the two samples, and the proportion of great difference was very heterogeneous were found. In the sample B,Aminobacteriumhave accounted for the largest proportion for 86.94%, become the absolute dominant bacteria. The experiment showed that the original material of the stinky tofu brine had a great influence on microbial differences. And found in stinky tofu brine during the fermentation only with a few major strains related.

stinky tofu brine; microbial; high-throughput technique; analysis

國家自然科學基金項目(31571819)

賀靜 女，碩士研究生。研究方向為食品加工與安全。E-mail:1242447550@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士。研究方向為食品生物技術。E-mail:hnndjlw@163.com

2016-09-05；

2016-11-02

Q938；TS214.2

A

1005-7021(2017)04-0046-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.008