人巨細(xì)胞病毒miR-UL22A的重組載體構(gòu)建以及表達(dá)分析

王鴻雁， 王 博， 齊 瑩， 馬艷萍， 黃郁晶， 柳中洋， 阮 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 病毒研究室，遼寧 沈陽 110004)

人巨細(xì)胞病毒miR-UL22A的重組載體構(gòu)建以及表達(dá)分析

王鴻雁， 王 博， 齊 瑩， 馬艷萍， 黃郁晶， 柳中洋， 阮 強(qiáng)*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 病毒研究室，遼寧 沈陽 110004)

優(yōu)化構(gòu)建人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)miR-UL22A的真核表達(dá)載體；明確HCMV臨床株及實(shí)驗(yàn)室株感染過程中miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)情況。擴(kuò)增HCMV UL22A編碼區(qū)不同長(zhǎng)度(975、494、209及140 bp)的序列，構(gòu)建表達(dá)miR-UL22A的重組pSilencer(pS)載體，轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞后提取總RNA；收集HCMV臨床株Han株以及實(shí)驗(yàn)室株Towne株感染人胚肺成纖維細(xì)胞后6、12、24、48和72 h以及不同感染時(shí)相(即刻早期、早期、晚期)的總RNA標(biāo)本；應(yīng)用TaqMan頸環(huán)-實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)上述標(biāo)本miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)量。成功構(gòu)建了包含上述不同長(zhǎng)度miR-UL22A編碼序列的重組載體； 側(cè)翼序列長(zhǎng)度各為40 bp左右的pre-miRNA(即插入140 bp的編碼序列)表達(dá)成熟miRNA的效果最佳；在病毒的一個(gè)復(fù)制周期內(nèi)，HCMV臨床株和實(shí)驗(yàn)室株miR-UL22A的表達(dá)趨勢(shì)無明顯差異，均在感染后6 h即檢測(cè)到表達(dá)，72 h達(dá)到峰值，且在即刻早期即有miRNA的明確表達(dá)；無論是在重組載體表達(dá)狀態(tài)下還是自然感染狀態(tài)下，miR-UL22A-5p始終為miR-UL22A前體優(yōu)勢(shì)表達(dá)的miRNA。結(jié)果表明，有140 bp片段miR-UL22A編碼序列的重組載體能夠高效地異源表達(dá)miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p； miR-UL22A-5p始終為miR-UL22A前體優(yōu)勢(shì)表達(dá)的miRNA。為進(jìn)一步研究miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用提供了參考。

人巨細(xì)胞病毒；miR-UL22A-5p；miR-UL22A-3p

microRNA (miRNA) 是一類含20～24個(gè)核糖核苷酸的小分子RNA家族，廣泛存在于病毒、植物以及高等哺乳動(dòng)物中。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過與其靶mRNA分子的3′末端非編碼區(qū)域(3′untranslated region, 3′UTR) 結(jié)合，在病毒感染、生物個(gè)體發(fā)育以及腫瘤發(fā)生等生命活動(dòng)過程中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[1]。人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV) 在人群中感染廣泛，健康人群感染HCMV后多呈無癥狀或亞臨床感染，但胎兒等免疫功能低下人群感染HCMV會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p害。目前，活產(chǎn)新生兒先天性HCMV感染率約為0.7%，常累及多個(gè)器官及系統(tǒng)；無癥狀HCMV先天感染兒有5%～15%在生后2 a內(nèi)發(fā)生膽汁淤積性肝炎、膽道閉鎖、神經(jīng)性耳聾或不同程度神經(jīng)精神運(yùn)動(dòng)障礙[2]。迄今為止，HCMV的致病機(jī)制尚不清楚；其復(fù)雜的生活周期需要大量的基因產(chǎn)物以及調(diào)控機(jī)制參與，而HCMV編碼的miRNA通過調(diào)控病毒和/或宿主的基因表達(dá)，在HCMV和宿主復(fù)雜的相互作用中發(fā)揮重要作用[3-4]。目前的研究表明，HCMV至少編碼24種miRNA。盡管miR-UL22A-5p和miR-UL22A-3p是最早被鑒定出的HCMV編碼的兩種miRNA，但它們的表達(dá)特性以及生物學(xué)功能尚不十分明確。在miRNA生物學(xué)功能的研究過程中，經(jīng)常需要外源性補(bǔ)充或提供miRNA；除采用合成miRNA前體的方法外，可以用載體表達(dá)所研究的miRNA。本研究以miR-UL22A為研究對(duì)象，構(gòu)建了含有miR-UL22A前體不同長(zhǎng)度編碼序列的重組載體，檢測(cè)由同一miR-UL22A前體同時(shí)表達(dá)miR-UL22A-5p和miR-UL22A-3p的表達(dá)量，明確構(gòu)建miRNA重組表達(dá)載體所需最合適的前體miRNA (pre-miRNA)側(cè)翼序列長(zhǎng)度。同時(shí)，為了明確miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p表達(dá)的時(shí)相特點(diǎn)，檢測(cè)了HCMV臨床株Han株以及實(shí)驗(yàn)室株Towne株在感染后6、12、24、48和72 h以及不同感染時(shí)相(即刻早期IE、早期E、晚期L)這一miRNA的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1材料

人胚腎293細(xì)胞(HEK 293)及人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。pSilencerTM4.1-CMV neo載體及TURBO DNA-free kit購自Ambion公司。質(zhì)粒提取試劑盒Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification System購自promega公司。脂質(zhì)體2000以及Trizol reagent購自Invitrogen公司。FQ-PCR產(chǎn)品購自ABI公司，包括：CustomTaqMan?Small RNA Assays，TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit，TaqMan?Universal PCR Master Mix Kit。 HCMV miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p標(biāo)準(zhǔn)品購自銳博生物公司。構(gòu)建載體的引物合成及測(cè)序分析由Invitrogen公司完成。

1.2方法

1.2.1 pSilencer-miR-UL22A重組載體的構(gòu)建 由于miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p是由同一個(gè)前體的2個(gè)側(cè)臂加工成熟而形成，因此擴(kuò)增HCMV miR-UL22A前體編碼序列，將其克隆到真核表達(dá)載體pSilencer中，可以同時(shí)表達(dá)miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p。根據(jù)HCMV AD169株(EMBL:X17403.1)的相應(yīng)序列，設(shè)計(jì)了可擴(kuò)增包含miR-UL22A前體編碼序列的4對(duì)PCR引物(見表1)，產(chǎn)物長(zhǎng)度依次為975、494、209及140 bp。從HCMV臨床株Han株感染的人胚肺成纖維細(xì)胞中提取DNA，并以此為模板分別以上述4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL，PCR條件：95 ℃預(yù)變性4 min；經(jīng)95 ℃變性45 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。用BamHⅠ及Hind Ⅲ雙酶切純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pSilencer。酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化后，采用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的片段與載體的連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌DH5ɑ中，轉(zhuǎn)化后的DH5ɑ接種于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃溫箱過夜。提取單克隆菌落的DNA，應(yīng)用pSilencer載體上的測(cè)序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出產(chǎn)物大小與預(yù)期相一致的陽性克隆；篩選的克隆經(jīng)含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，收集菌液并抽提質(zhì)粒，進(jìn)一步采用DNA測(cè)序方法驗(yàn)證克隆結(jié)果。獲得的4種含有不同長(zhǎng)度miR-UL22A前體編碼序列的重組質(zhì)粒分別命名為pS-miR-UL22A-975、pS-miR-UL22A-494、pS-miR-UL22A-209及pS-miR-UL22A-140。

表1 PCR 引物序列

注：劃線部分是限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，保護(hù)性堿基在5′末端

1.2.2 轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞并提取總RNA 按照Lipo2000說明書操作，轉(zhuǎn)染24孔板培養(yǎng)的HEK 293細(xì)胞。每孔細(xì)胞均加入800 ng重組質(zhì)?；騪Silencer質(zhì)粒及2 μL Lipo2000。 轉(zhuǎn)染后48 h，提取總RNA，并使用Ambion公司的TURBO DNA-free kit去除可能殘留的DNA。分別用1%瓊脂凝膠電泳及Nanodrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量和純度。

1.2.3 提取不同感染時(shí)間點(diǎn)及感染時(shí)相的總RNA 以感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，MOI)為2.0的臨床株Han株以及實(shí)驗(yàn)室株Towne株分別感染6 cm平皿上已經(jīng)長(zhǎng)成單層的人胚肺成纖維細(xì)胞。在感染細(xì)胞中加入終濃度為100 μg/mL的放線菌酮(cycloheximide，CHX)，在感染后24 h收集細(xì)胞中提取的RNA為即刻早期(immediately early，IE)RNA樣本；加入終濃度為100 μg/mL的磷乙酸(phosphonoacetic acid，PAA)，并在感染后48 h收集細(xì)胞提取的RNA為早期(early，E)樣本；感染后96 h(約90%～100%出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng))收集并提取的RNA樣本為晚期(late，L)RNA樣本。另外，分別于HCMV感染后6、12、24、48及72 h用Trizol收獲感染細(xì)胞。按照Invitrogen公司的Trizol reagent操作說明書，提取總RNA，去除可能殘留的DNA，檢測(cè)RNA的純度和濃度。

1.2.4 檢測(cè)miR-UL22A的表達(dá) 根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫提供成熟miR-UL22A-5p (MIMAT0001574)及miR-UL22A-3p (MIMAT0-001575)的序列進(jìn)行相應(yīng)FQ-PCR引物和探針(P/N: 4433914、4398987) 的設(shè)計(jì)與合成(ABI公司)。將miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成40.0 nmol/L、4.0 nmol/L、 400.0 pmol/L、40.0 pmol/L、 4.0 pmol/L、 400.0 fmol/L 和40.0 fmol/L的濃度。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系：1 μL總RNA樣品(100 ng)或miR-UL22A-5p/miR-UL22A-3p不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，3.0 μL頸環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄引物，1×RT緩沖液，1.0 mmol/L dNTPs，50 U逆轉(zhuǎn)錄酶及3.8 U RNase抑制劑，補(bǔ)去離子水至15 μL；逆轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系包括：1×TaqMan Universal PCR Master Mix，1×TaqMan Small RNA assay，上述反轉(zhuǎn)錄后的cDNA各1.33 μL，補(bǔ)去離子水至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s(讀取熒光)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每份樣品重復(fù)3次PCR檢測(cè)；采用ABI公司的SDS軟件分析PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1pSilencer-miR-UL22A重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過針對(duì)pS載體序列設(shè)計(jì)的特異性引物pSilencer-U和pSilencer-D, PCR篩選4種pS-miR-UL22A重組克隆(空pS載體擴(kuò)增長(zhǎng)度為242 bp)；得到的產(chǎn)物大小與預(yù)期(依次為382、451、736和1 217 bp)相一致的克隆(圖1)。測(cè)序分析結(jié)果證實(shí)獲得的重組克隆中插入的外源序列與預(yù)期的miR-UL22A編碼序列完全一致。

圖1 pS-miR-UL22A克隆的PCR篩選結(jié)果

箭頭所指為目的條帶。M：DL2000；1：空pSilencer載體；2：pS-miR-UL22A-140;3：pS-miR-UL22A-209；4：pS-miR-UL22A-494；5: pS-miR-UL22A-975

The target bands were indicated by white arrows.M：Marker DL2000； Lane 1 is the PCR result of pSilencer vector. Lanes 2, 3, 4 and 5 are the PCR results of pS-miR-UL22A-140, pS-miR-UL22A-209, pS-miR-UL22A-494 and pS-miR-UL22A-975

2.2重組質(zhì)粒miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)量4種重組質(zhì)粒pS-miR-UL22A-140、pS-miR-UL22A-209、pS-miR-UL22A-494和pS-miR-UL22A-975在轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中表達(dá)miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的情況見圖2。在所有重組質(zhì)粒中，miR-UL22A-5p的表達(dá)量均高于miR-UL22A-3p；而且以pS-miR-UL22A-140重組質(zhì)

粒的miR-UL22A表達(dá)量最高；即含有長(zhǎng)度為140 bp左右miR-UL22A編碼序列的重組質(zhì)粒能夠獲得miR-UL22A的最佳表達(dá)效果。

圖2 不同miR-UL22A重組質(zhì)粒miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)量Fig.2 The expression levels of miR-UL22A-5p and miR-UL22A-3p from the miR-UL22A recombinant clones

2.3不同感染時(shí)期miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)

HCMV臨床株Han株及實(shí)驗(yàn)室株Towne株在感染后6、12、24、48、72 hpi時(shí)間點(diǎn)miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)見圖3A，在感染后IE期、E期以及L期的表達(dá)見圖3B。結(jié)果顯示，在HCMV感染后病毒的一個(gè)復(fù)制周期內(nèi)，HCMV臨床株Han株及實(shí)驗(yàn)室株Towne株miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)趨勢(shì)無明顯差異，均在感染后6 h即檢測(cè)到表達(dá)，72h達(dá)到峰值；且在即刻早期即有上述miRNA的明確表達(dá)。同時(shí)，無論在任何特定時(shí)間點(diǎn)，HCMV實(shí)驗(yàn)室株Towne株的miR-UL22A表達(dá)量均比臨床株Han株高；而其miR-UL22A-5p的表達(dá)量也均高于miR-UL22A-3p的表達(dá)量。

圖3 HCMV臨床株Han株及實(shí)驗(yàn)室株Towne株感染后不同時(shí)期miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)量Fig.3 The expression levels of miR-UL22A-5p and miR-UL22A-3p at different time points post infection of HCMV clinical strain Han and laboratory strain Towne

3 討 論

HCMV miRNA的編碼基因分散于整個(gè)病毒的基因組中。目前研究較多的HCMV miRNA包括miR-US25-1、miR-US25-2、miR-UL148D-1、miR-US4-1和miR-UL112-1等；其功能主要涉及免疫逃避、抑制病毒復(fù)制、調(diào)控感染細(xì)胞凋亡、為病毒潛伏創(chuàng)造有利條件等方面[5-7]。2005年，Dunn等[8]預(yù)測(cè)miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的靶基因包括神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)蛋白AHANK，干擾素18受體前體，組蛋白3等，推測(cè)其可能在細(xì)胞分化、免疫、基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用；但是到目前為止尚沒有關(guān)于miR-UL22A生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。目前，一般是通過“過表達(dá)”或“抑制表達(dá)”這兩種手段進(jìn)行miRNA的生物學(xué)功能研究。本研究構(gòu)建了HCMV miR-UL22A的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)的miRNA加工成熟機(jī)制，獲得“過表達(dá)”的miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p。這種方法所表達(dá)的miRNA更接近感染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的miRNA，比合成miRNA前體更經(jīng)濟(jì)、方便，且時(shí)效性長(zhǎng)。

本研究需要同時(shí)檢測(cè)同一前體表達(dá)的兩個(gè)miRNA。為了提高檢測(cè)的特異性和靈敏性，應(yīng)用了ABI公司的TaqMan?MicroRNA Assays頸環(huán)RT-PCR方法檢測(cè)miRNA的表達(dá)情況。這一方法可精確區(qū)分同一家族中序列高度同源的miRNA，能檢測(cè)只有一個(gè)堿基差別不同miRNA的表達(dá)水平，是目前檢測(cè)miRNA表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。結(jié)果顯示，miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p在含有140 bp片段miR-UL22A編碼序列的重組載體中，表達(dá)量最高；結(jié)合我們其他miRNA的研究結(jié)果，提示構(gòu)建miRNA表達(dá)載體，插入pre-miRNA兩側(cè)的側(cè)翼序列長(zhǎng)度各控制在40 bp左右，通常能夠獲得miRNA的最佳表達(dá)效果[11-13]。

2005年，Grey等[14]通過Northern blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCMV感染狀態(tài)下(MOI為5.0)，miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p隨感染時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸增加，即在72 hpi表達(dá)量最高。盡管有其他研究顯示，同樣以MOI為5.0接種成纖維細(xì)胞時(shí)，miR-UL22A的最高表達(dá)量出現(xiàn)在感染后48 h[15]，我們的研究結(jié)果與Grey的結(jié)果一致。當(dāng)以MOI為2.0接種細(xì)胞時(shí)，miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)量在72 hpi達(dá)到峰值。人巨細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)錄本表達(dá)具有時(shí)相性，應(yīng)用蛋白合成抑制劑放線菌酮和DNA復(fù)制抑制劑磷乙酸處理感染細(xì)胞后，獲得了HCMV臨床株Han株以及實(shí)驗(yàn)室株Towne株感染的即刻早期和早期miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p在即刻早期即有明確的表達(dá)，在早期和晚期表達(dá)量顯著增加。上述結(jié)果提示miR-UL22A可能在病毒感染早期即可發(fā)揮生物學(xué)功能，且相關(guān)功能貫穿病毒復(fù)制的整個(gè)周期。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)由同一miRNA前體編碼表達(dá)的miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p無論在重組載體或自然感染的情況下，均可以在特定時(shí)間同時(shí)表達(dá)；而且miR-UL22A-5p的表達(dá)量始終高于miR-UL22A-3p的表達(dá)量。這一結(jié)果預(yù)示在病毒感染過程中，miR-UL22A-5p可能發(fā)揮更為重要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究明確了異源性表達(dá)miRNA所需最佳編碼序列長(zhǎng)度；HCMV實(shí)驗(yàn)室株及臨床株自然感染過程的不同時(shí)間點(diǎn)和不同感染時(shí)相miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究HCMV miR-UL22A參與對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能以及在HCMV感過程中發(fā)揮的作用提供參考。

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ConstructionofRecombinantVectorsandExpressionsofHumanCytomegalovirusmiR-UL22A

WANG Hong-yan, WANG Bo, QI Ying, MA Yan-ping, HUANG Yu-jing, LIU Zhong-yang, RUAN Qiang

(VirusLab.,ShengjingHosp.Affil.ChinaMed.Uni.,Shengyang110004)

Eukaryotic expression vectors of human cytomegalovirus (HCMV) miR-UL22A were optimized and constructed, to clarify the expression situation of the infection process of HCMV clinical strain and the lab strain. Sequences of different lengths of HCMV miR-UL22A encoding fragments (975 bp, 494 bp, 209 bp, and 140 bp) were amplified and constructed a recombinant the expression vector pSilencers (pS), and extracted total RNA after transfected into human embryo kidney 293 cell, and collected total RNA samples at 6, 12, 24, 48, and 72 hours after transfection of embryo lung fibroblast with HCMV clinical strain, Han strain and lab Towne strain, as well as different infection time phase (immediate-early stage, early stage, and late stage). The expressions of miR-UL22A-5p and miR-UL22A-3p were determined and tested by Taqman stem-loop RT-PCR. The results showed that the recombinant vectors containing different lengths of miRNA encoding sequences were constructed successfully. The flank sequences each about 40 bp of pre-miRNA (i.e. the inserted 140 bp coding sequence) achieved the best expression effect of the mature miRNA. No obvious difference of miR-UL22A expression trend was observed during one viral replication cycle of HCMV clinical strain and lab strain. All the expressions were determined and tested 6 hours after the infection, and reached the peak value at 72 hour, moreover, the definite expression of miRNA was immediately observed at immediate-early stage; and whatever expressed by recombinant vector or infected during natural condition, miR-UL22A-5p has always been prosomatically dominant expression of miR-UL22A. Therefore, recombinant vector containing 140 bp of miR-UL22A encoding sequence of miR-UL22A could high-efficiently heterogenetic express miR-UL22A-5p and miR-UL22A-3p; And miR-UL22A-5p has always been prosomatically dominant expression of miRNA; This study provides a foundation for further study on the regulations after transcription of miRNA.

human cytomegalovirus; miR-UL22A-5p; miR-UL22A-3p

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013021008)

王鴻雁 女，碩士研究生。主要從事人巨細(xì)胞病毒致病的分子機(jī)制研究。E-mail：935686941@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。從事人巨細(xì)胞病毒致病的分子機(jī)制研究。E-mail：ruanq@sj-hospital.org

2016-09-01；

2016-09-26

Q939.93；R37

A

1005-7021(2017)04-0034-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.006

·寫作常識(shí)·

署名

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