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    1696例孕婦無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查結(jié)果分析

    2017-11-08 07:04:17劉俊嬌鄭天生崔鳳姬許佳琦鄭云靜
    關(guān)鍵詞:整倍體高風(fēng)險(xiǎn)三體

    劉俊嬌 鄭天生 崔鳳姬 于 鵬 許佳琦 鄭云靜

    內(nèi)蒙古自治區(qū)計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(赤峰,024000)

    1696例孕婦無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查結(jié)果分析

    劉俊嬌 鄭天生 崔鳳姬 于 鵬 許佳琦 鄭云靜

    內(nèi)蒙古自治區(qū)計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所(赤峰,024000)

    染色體異常是缺陷兒出生的主要原因[1], 尚無(wú)有效的治療方法, 通過胎兒染色體異常的篩查及診斷, 及時(shí)采取措施成為杜絕此類患兒出生的目前唯一途徑[2]。目前針對(duì)染色體疾病的產(chǎn)前檢測(cè)主要以血清學(xué)篩查技術(shù)、有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)(羊水穿刺、臍血穿刺、絨毛活檢等)為主。但血清學(xué)篩查準(zhǔn)確度低, 存在較高的假陽(yáng)性率(5%)和較高的漏診率(20%~40%)。 有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)(羊水穿刺、臍血穿刺、絨毛活檢等)染色體核型分析產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確率高,為臨床的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。但有胎兒畸形、流產(chǎn)、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn),不便于大規(guī)模的產(chǎn)前檢測(cè)。因此如何進(jìn)行安全的、快速、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的產(chǎn)前篩查和診斷成為產(chǎn)科臨床實(shí)際問題。 本文通過本所接受無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查結(jié)果進(jìn)行回顧性分析, 探討無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查技術(shù)對(duì)檢測(cè)胎兒染色體非整倍體疾病的準(zhǔn)確性。

    1 資料與方法

    1.1臨床資料

    2015年11月1日-2016年11月30日在本所接受無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查者1696例婦女作為研究對(duì)象, 均為單胎自然妊娠孕婦, 孕12~24周。 按孕婦年齡及血清學(xué)篩查結(jié)果分為3組:年齡高危組, 822例, 年齡≥35歲。血清學(xué)篩查高危組,392例, 年齡<35歲, 血清學(xué)篩查提示21-三體高風(fēng)險(xiǎn)314例, 21-三體臨界高風(fēng)險(xiǎn)68例, 18-三體高風(fēng)險(xiǎn)8例, 18-三體臨界高風(fēng)險(xiǎn)2例。 其他原因組, 482例,將其繼續(xù)分為3亞組,A組:年齡<35歲, 未做血清篩查或血清學(xué)篩查低風(fēng)險(xiǎn), 要求檢測(cè)無(wú)創(chuàng)DNA者 共354例; B組,年齡<35歲, 超聲結(jié)果異常, 共60例; C組,既往有不良孕產(chǎn)史,共68例。

    1.2方法

    門診醫(yī)生告知孕婦及家屬篩查方法的利弊及風(fēng)險(xiǎn), 所有孕婦簽署知情同意書后取血液樣本。 利用半導(dǎo)體測(cè)序法進(jìn)行胎兒染色體非整倍體21-三體、18-三體和13-三體檢測(cè)。本研究經(jīng)所倫理委員會(huì)審查。

    1.2.1樣本采集﹑血漿的分離無(wú)菌抽取孕婦外周靜脈血8ml,利用EDTA作為抗凝劑進(jìn)行抗凝血處理,采血后4h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。 1600g 室溫離心 10 min,將上清液移至新的離心管中, 再經(jīng)1600g 室溫離心 10min 后,將上清液移至新的離心管中,獲得血漿,每例血漿分為4份,每份1ml。直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。

    1.2.2 DNA提取﹑文庫(kù)構(gòu)建﹑上機(jī)測(cè)序用DNA提取試劑盒(達(dá)安基因),根據(jù)核酸提取試劑盒DAAN GENE(磁珠法)說明書要求, 通過加大反應(yīng)體系(3倍反應(yīng)體系),提取 600μl血漿游離DNA, 得30μl的DNA溶液。 DNA可置于-20℃保存, 保存時(shí)間不超過1年, 凍融次數(shù)不超過8次。 用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(達(dá)安基因)構(gòu)建DNA文庫(kù)。將建好的文庫(kù)樣品通過熒光定量PCR儀進(jìn)行文庫(kù)定量。 上機(jī)測(cè)序通過模板制備和模板富集, 利用第2代測(cè)序儀DA8600進(jìn)行上樣和測(cè)序。

    1.2.3篩查結(jié)果主要通過分析獲得每條染色體上篩查到堿基占所有篩查到的堿基的百分比,并計(jì)算該值與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中正常樣本堿基的百分之間的偏差即Z值, 確定胎兒的21、18和13號(hào)染色體是否異常。 若檢測(cè)樣本中的21、18和13號(hào)染色體中的一個(gè)染色體Z值>3, 則提示該樣本存在染色體異常, 患有相應(yīng)染色體疾病, 需要進(jìn)行進(jìn)一步的臨床診斷確認(rèn), 確診方式主要是羊水穿刺。Z值<3則低風(fēng)險(xiǎn),低風(fēng)險(xiǎn)孕婦被告知按常規(guī)產(chǎn)檢方案并電話隨訪胎兒出生情況。

    2 結(jié)果

    2.1無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查

    1696例無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查,高風(fēng)險(xiǎn)共31例,其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)22例,18-三體高風(fēng)險(xiǎn)6例,13-三體高風(fēng)險(xiǎn)3例; 不同年齡高危組, 血清學(xué)高危組, 其他組的產(chǎn)前篩查異常情況見表1。

    表1 1696例孕婦無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查異常情況

    2.2孕婦無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果比較

    產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)31例中26例孕婦進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析。 22例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)者中20例進(jìn)行了羊水穿刺(19例結(jié)果為陽(yáng)性、1例結(jié)果為陰性), 2例直接引產(chǎn),經(jīng)隨訪得知胎兒均有多處畸形,家屬拒絕送病理。 6例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)者中4例進(jìn)行了羊水穿刺(3例證實(shí)為陽(yáng)性、1例為陰性繼續(xù)妊娠),2例直接引產(chǎn),經(jīng)隨訪得知胎兒均有多處畸形,家屬拒絕送病理。 3例13-三體高風(fēng)險(xiǎn)者中2例進(jìn)行了羊水穿刺(1例結(jié)果為陽(yáng)性, 1例結(jié)果為陰性), 1例胎死宮內(nèi),家屬拒絕送病理,因直接引產(chǎn)和胎死宮內(nèi)的胎兒家屬拒絕做病理,所以無(wú)法確定是否有染色體非整倍體疾病,故計(jì)算陽(yáng)性預(yù)測(cè)值時(shí)未納入。26例無(wú)創(chuàng)DNA篩查提示高風(fēng)險(xiǎn)者的羊水穿刺情況見表2。經(jīng)分析, 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查對(duì)常見的染色體非整倍體21-三體、18-三體、13-三體的檢出率是100%, 準(zhǔn)確率是88.5%, 假陽(yáng)性率是0.18%, 假陰性率是0。

    表2 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果比較

    *2例直接引產(chǎn)#1例胎死宮內(nèi)△26例行羊水穿刺

    2.3無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢查測(cè)結(jié)果陰性孕婦隨訪

    電話隨訪3組無(wú)創(chuàng)DNA篩查低風(fēng)險(xiǎn)孕婦的妊娠結(jié)局,截止至2016年12月1日已出生的新生兒經(jīng)檢查均未發(fā)現(xiàn)染色體非整倍疾病(21-三體、18-三體、13三體)。

    3 討論

    我國(guó)是出生缺陷兒的高發(fā)國(guó)家,染色體異常是最常見的原因[4]。主要通過產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷進(jìn)行控制。目前有創(chuàng)的羊水細(xì)胞染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但該方法具有一定的風(fēng)險(xiǎn),因此降低了產(chǎn)前診斷的依從性[5]。故只能針對(duì)產(chǎn)前篩查高危人群進(jìn)行。傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查及超聲檢查來評(píng)估胎兒染色體異常的方法的準(zhǔn)確率及敏感度不夠,假陽(yáng)性率較高。故需要一種安全、可靠的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法進(jìn)行產(chǎn)前干預(yù)。長(zhǎng)期以來很多研究者一直在尋找一種無(wú)創(chuàng)且高效的方法進(jìn)行產(chǎn)前篩查及診斷來控制缺陷兒的出生。1997年Lo等首次發(fā)現(xiàn)母體外周血中存在胎兒游離DNA片段[6]。 隨著近幾年新一代測(cè)序技術(shù)即大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)的廣泛推廣,且經(jīng)過了大量臨床實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查技術(shù)成為產(chǎn)前篩查的新模式,并在世界范圍內(nèi)進(jìn)行臨床推廣[7-8]。

    據(jù)報(bào)道2010年因年齡因素做產(chǎn)前篩查及診斷的孕婦比例已高達(dá)46.20%[9],隨著我國(guó)生育政策的變化,赤峰地區(qū)高齡孕婦的比例逐漸上升。本研究結(jié)果顯示:無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)對(duì)常見的染色體非整倍體21-三體、18-三體、13-三體的檢出率為100%,準(zhǔn)確率是88.5%, 假陽(yáng)性率是0.18%,假陰性率是0,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查。所以赤峰地區(qū)參與無(wú)創(chuàng)DNA篩查人數(shù)逐漸上升,血清學(xué)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦、臨界高風(fēng)險(xiǎn)孕婦、高齡孕婦、不符合血清學(xué)篩查的孕婦等是選擇無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查的主要人群。從本結(jié)果可見,高齡孕婦所占比例近50%,且無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查染色體非整倍體疾病陽(yáng)性比例高,所以屬年齡高危人群更要重視產(chǎn)前DNA篩查。

    本資料中1696例無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查中發(fā)現(xiàn)31例高風(fēng)險(xiǎn)者, 其中4例直接引產(chǎn), 1例胎死宮內(nèi), 26例接受羊水穿刺。 經(jīng)分析結(jié)果表明,無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查對(duì)21-三體和18-三體的檢出率均為100%、準(zhǔn)確率達(dá)95%和75%,13-三體準(zhǔn)確率偏低(50%)可能與本批次13-三體的檢出例數(shù)較少有關(guān)。如何進(jìn)一步提高13-三體篩查的準(zhǔn)確率是我們下一步研究的方向。 有文獻(xiàn)報(bào)道, 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查的檢出率(100%)高于血清學(xué)篩查檢出率(60%), 并且準(zhǔn)確率高,可作為有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)(羊水穿刺、臍血穿刺、絨毛活檢等)的有效輔助檢查[10]。 本資料結(jié)果顯示無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查的假陽(yáng)性率較低, 仍然需要進(jìn)行羊水細(xì)胞染色體核型分析來輔助明確診斷。

    綜上所述, 無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查對(duì)21-三體、18-三體、13-三體具有較高的敏感性并與羊水穿刺結(jié)果符合率高, 具有快速、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn), 所以廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前染色體非整倍體疾病的篩查。 但存在假陽(yáng)性和一定的局限性, 因此無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前篩查只能作為一項(xiàng)“近似診斷的篩查”,不能完全代替羊水細(xì)胞染色體核型分析。

    [1] 邊旭明.胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè).實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2013,29(5):330-333.

    [2] 虞斌,張玢,史華,等.唐氏綜合癥胎兒、新生兒及其孕母血清銅藍(lán)蛋白的表達(dá)特點(diǎn)[J].中華圍產(chǎn)雜志,2011,14(12):720.

    [3] Wang JY,Zhen DK,Zilberstein ME,et al.Non-invasive exclusion offetal aneuploidy in at-risk couple with a balanced translocation[J].Mol Hum Reprod,2000,6(2):103-106.

    [4] Franssen MT,Korevaar JC,Tjoa WM,et a1.Inherited unbalanced structural chromosome abnormalities at prenatal chromosome analysis are rarely ascertained through recurrent miscarriage[J].Prenat Diagn,2008,28(5):408-411.

    [5] 戰(zhàn)芳,吳丹丹.無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)在診斷胎兒染色體非整倍體疾病中的應(yīng)用[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2014,22(11):46-50.

    [6] Lo YM,Corbetta N,ChamberIain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350(9079):485-487.

    [7] Chiu RW,Chan KC,Gao Y,et a1.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105:20458-20463.

    [8] 王玉蘭,陶華娟等.346例孕婦無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2014,22(6):62-63.

    [9] 竇淋淋,郭遠(yuǎn)瑜等.無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用效果分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(3):320-372.

    [10] 侯巧芳,吳東,楚艷,等,孕婦外周血游離胎兒DNA檢測(cè)在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2012,47:813-814.

    10.3969/j.issn.1004-8189.2017.07.014

    2016-12-07

    2017-03-15

    [責(zé)任編輯:王麗娜]

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