中藥二仙湯對骨髓干細(xì)胞增值和遷移能力的影響

李 楠 艾 浩

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科(121000)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科

·基礎(chǔ)研究·

中藥二仙湯對骨髓干細(xì)胞增值和遷移能力的影響

李 楠1艾 浩2*

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科(121000)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科

目的：觀察二仙湯對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力和遷移能力的影響，為二仙湯協(xié)同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療卵巢早衰提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：分別將20只SD雌性大鼠制備含二仙湯的藥物血清(含藥組)和無藥物血清(對照組)，取10只大鼠體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過對照法對細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT法測定、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力進(jìn)行檢測并分析。結(jié)果:與對照組相比，含藥組細(xì)胞增殖能力和遷移能力均明顯增強(qiáng)。結(jié)論：二仙湯協(xié)同骨髓干細(xì)胞自體移植治療卵巢早衰疾病具有可行性。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；二仙湯；增殖能力；遷移能力

干細(xì)胞移植作為一種新的治療方法成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，且已在急性白血病、角膜移植等疾病治療中取得成功。目前干細(xì)胞移植治療卵巢早衰處于動物實(shí)驗(yàn)階段，其也可能是一種治療卵巢早衰最有希望的臨床治療方法[1-4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能。有驗(yàn)研究證實(shí)BMSCs可向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化，能夠修復(fù)受損卵巢和改善卵巢功能[5]。二仙湯可明顯改善卵巢早衰的臨床癥狀，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟及排卵[6-7]。本研究對二仙湯提高自體移植的干細(xì)胞增值能力和遷移能力進(jìn)行觀察，為后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)自體移植干細(xì)胞定向遷移至卵巢、改善衰竭卵巢的功能、以及臨床治療卵巢早衰提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料及試劑

生長8周的SD雌性大鼠50只(購自錦州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、CD90單克隆抗體及同型對照抗體、CD34單克隆抗體及同型對照抗體(中文)、碘化丙啶染液(PI染液)均購自南京建成生物工程研究所。 二仙湯組方：仙茅10g、淫羊藿15g、巴戟天15g、知母10g、當(dāng)歸15g和黃柏10g。

1.2血清制備

含藥組：取20只大鼠，給藥劑量根據(jù)臨床用藥量及動物等效劑量系數(shù)，以4倍劑量灌胃給藥，每次3ml(含生藥量2.13g/ml)，2次/d，連續(xù)4d，在末次給藥后1h采血，分離血清，56℃水浴滅活30min,無菌過濾分裝，制備成20%含藥血清培養(yǎng)基(10ml二仙湯血清、40ml DMEM培養(yǎng)基)。對照組：取20只大鼠，以等劑量、等時間的生理鹽水灌胃，同樣方法分離血清，制備成20%無藥物血清培養(yǎng)基(10ml血清、40ml DMEM培養(yǎng)基)。另外取10只大鼠體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)、純化

將兩組大鼠處死后浸泡于75%酒精，無菌條件下分離股骨，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制備完成細(xì)胞懸液以3×105cell/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。首次半量換液于48 h，分別改用含藥和非含藥血清培養(yǎng)基，并標(biāo)記，每3天全量換液。細(xì)胞80%鋪于培養(yǎng)瓶時可進(jìn)行傳代培養(yǎng)(傳代比例1:3)。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)變化。

1.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記

第3代細(xì)胞生長狀態(tài)良好、細(xì)胞密度1×105cell/ml時，磷酸緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，在各管細(xì)胞中，加入CD90、CD34單克隆抗體和其同型對照抗體。室溫、避光孵育45 min，洗滌3次去未結(jié)合抗體，取重懸細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測分析。

1.5骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增值活性測定

使用第3代BMSCs，接種于96孔培養(yǎng)板觀察細(xì)胞增值活性。每組設(shè)9個復(fù)孔，密度1×103/孔、150μl/孔，待細(xì)胞貼壁后，換含藥血清和對照血清培養(yǎng)基。孵育48h， 取MTT 20μl放入各孔；培養(yǎng)4h后，棄上清，取DMSO溶液放入各孔，進(jìn)行MTT檢測，記錄各孔光吸收值(OD)并對數(shù)值進(jìn)行比較。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

調(diào)整細(xì)胞密度(5×105cell/ml)用于細(xì)胞周期檢測，收集細(xì)胞置于預(yù)冷的乙醇中過夜。次日抽取200μl RNA酶于細(xì)胞內(nèi)，水浴30min，再給予400μl PI染液30min，4℃避光，檢測細(xì)胞周期判斷BMSCs增殖能力。

1.7共培養(yǎng)體系

應(yīng)用6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，將8um孔徑的Transwell小室置入6孔板內(nèi)組成共培養(yǎng)。取第3代BMSCs(濃度5×105/ml)置于半透膜上層，下室分別加入含藥組和對照組血清，每組設(shè)5個復(fù)孔。孵育24h，吸出6孔板的培養(yǎng)基，90%酒精固定30min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，PBS清洗后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(隨機(jī)取3個不同視野)，觀察下室細(xì)胞并計(jì)數(shù)分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或(%)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)；P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)觀察

原代細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞于取材24h后貼壁。細(xì)胞明顯增多，形態(tài)似梭形，可見細(xì)胞集落生長。消化傳代后24h內(nèi)完全貼壁生長。鏡下觀察培養(yǎng)的兩組骨髓干細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，見圖1。

圖1 兩組第三代干細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.2 BMSCs的鑒定及增殖活性比較

干細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測CD90呈陽性、CD34呈陰性，提示體外培養(yǎng)的干細(xì)胞確定為BMSCs，見圖2。含藥組BMSCs的OD(0.61±0.11)高于對照組(0.75±0.12)(t=2.720,P=0.024)。

圖2 細(xì)胞表面抗原CD90和CD34表達(dá)

2.3兩組細(xì)胞周期比較

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，含藥組S期和G2/M期百分比增加值高于與對照組(P<0.05)，見表1和圖3。

2.4 BMCSs遷移

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，含藥組的BMCSs遷移到下室細(xì)胞高于對照組(P<0.05)，見圖4。

表1 兩組細(xì)胞周期比較

圖3 兩組細(xì)胞生長周期比較

圖4 兩組 BMCSs遷移

3 討論

干細(xì)胞能分化身體各個部位所需要的細(xì)胞，以往實(shí)驗(yàn)證明羊水細(xì)胞入卵巢早衰動物模型，1個月后發(fā)現(xiàn)其阻止卵泡閉鎖，為卵巢早衰不孕患者提供了希望[1]。近來研究證明與單一干細(xì)胞移植相比，藥物協(xié)同干細(xì)胞移植治療卵巢早衰的療效更為顯著。二仙湯是療效確鑿的著名方劑，此方功效溫腎陽，補(bǔ)腎精，是治療婦科病癥中運(yùn)用廣泛的方劑之一[6-7]。以往實(shí)驗(yàn)研究顯示二仙湯可以通過上調(diào)卵泡顆粒細(xì)胞雌激素受體的表達(dá)，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟和排卵[7]。本研究增值能力測定及共培養(yǎng)均顯示了二仙湯能夠提高干細(xì)胞的增值和遷移能力,為后續(xù)自體移植干細(xì)胞遷移至卵巢組織、提高干細(xì)胞的增值能力、改善卵巢功能等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為該治療方法運(yùn)用于臨床提供基礎(chǔ)依據(jù)。

目前干細(xì)胞移植治療卵巢早衰研究仍處于動物實(shí)驗(yàn)階段，從研究進(jìn)展來看中藥聯(lián)合干細(xì)胞治療將成為中西醫(yī)結(jié)合治療的新觀點(diǎn)[8-9]。綜上所述，二仙湯可用于卵巢早衰的治療，但仍需要進(jìn)一步研究。

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EffectsofEr-xiandecoctiononproliferationandmigrationofbonemarrowstemcells

LI Nan, Ai Hao

1.TheDepartmentofGynaecology,TheThirdAffiliatedHospitalofJinZhouMedicalUniversity,JinZhou,Liaoning, 121000; 2.TheDepartmentofGynaecology,TheFrstAffiliatedHospitalofJinZhouMedicalUniversity

Objective: To observe the effects of the Er-xian decoction on the proliferation and migration of bone marrow stem cells (BMSCS), and to provides of experiment evidence to treat premature ovarian failure (POF) by BMSCS combined with Er-xian decoction. Methods: In the vitro experiment, 20 SD female rats were in experimental group, which were given Er-xian decoction, and another 20 SD female rats were in control group, which were given water only. All rats were used to prepare serum. Then BMSCs were isolate from 10 rat bone marrow. The cell morphology, MTT, cell cycle and cell migration were detected and compared between the two groups. Results: Compared to control group, Er-xian decoction raised cell proliferation and migration. Conclusion: This vitro experiment shows that er-xian decoction combined with BMSCs to treat POF is feasible.

Bone marrow stem cells; Erxian decoction; Proliferation; Migration

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.07.003

2017-03-14

2017-04-07

[責(zé)任編輯：董 琳]