李紅陽(yáng) 孫 亮 姜 醒 苑光軍 劉 艷
·基礎(chǔ)研究·
蝙蝠葛堿在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)5氟尿嘧啶敏感性的研究
李紅陽(yáng)1孫 亮2姜 醒3苑光軍3劉 艷1
目的探討人乳腺癌MCF-7細(xì)胞受蝙蝠葛堿(Dauricine,Dau)作用后,對(duì)5氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影響。方法分別以終濃度為2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿、50 μg/mL的5-FU、2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿和50 μg/mL的5-FU作用于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞的遷移,DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞的凋亡,Western blot法檢測(cè)cyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合使用閾下濃度的蝙蝠葛堿增強(qiáng)了5-FU對(duì)細(xì)胞增殖的抑制;Transwell實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合應(yīng)用閾下濃度的蝙蝠葛堿進(jìn)一步加劇了5-FU對(duì)細(xì)胞遷移的抑制;DAPI染色說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用閾下劑量的蝙蝠葛堿加強(qiáng)了5-FU對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo),Western blot實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合應(yīng)用閾下濃度的蝙蝠葛堿進(jìn)一步抑制了cyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)論蝙蝠葛堿可有效增強(qiáng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。
蝙蝠葛堿;5氟尿嘧啶;乳腺癌;MCF-7細(xì)胞
乳腺癌是中國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占女性新發(fā)癌癥總數(shù)的25%[1-2]。因此,乳腺癌的防治具有重要的價(jià)值與意義?;瘜W(xué)療法是治療乳腺癌的一種重要手段,5氟尿嘧啶(5-FU)是一種常見(jiàn)的治療乳腺癌化療藥物,但是通過(guò)臨床觀察表明,乳腺癌對(duì)5-FU的耐藥性越來(lái)越突出[3]。輔助藥物的開(kāi)發(fā)和利用為解決化療藥物的耐藥性提供了途徑。
蝙蝠葛堿是從北豆根的根莖中提取的生物堿[4]。蝙蝠葛堿有抗心律失常、抗腦缺血、抗腫瘤以及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性等作用[5-6],有研究結(jié)果顯示蝙蝠葛堿對(duì)人肺癌細(xì)胞QG-56、人膀胱癌細(xì)胞T24等有良好的抑制增殖作用,而且量效關(guān)系良好[7-8],其抗腫瘤的功能與抑制NF-κB通路有關(guān)[9],但是關(guān)于蝙蝠葛堿對(duì)于5-FU在乳腺癌中的增敏作用鮮有報(bào)道。本研究擬將閾下濃度的蝙蝠葛堿與5-FU聯(lián)用,探究能否增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)5-FU的化學(xué)敏感性,為解決5-FU臨床耐藥性找出可能的方法,以此提高化療的敏感性,減少相關(guān)化療藥物的毒副反應(yīng),為進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
MCF-7細(xì)胞由中科院上海生物細(xì)胞所引進(jìn),蝙蝠葛堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,用二甲基亞砜(DMSO)配成5mg/mL貯存液,-20℃冰箱保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋?zhuān)籇MEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;5氟尿嘧啶(5-FU)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。
體外細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清以及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。
第一步篩選實(shí)驗(yàn)每組依次加入蝙蝠葛堿至終濃度為0.6 μg/mL、1.2 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL,空白對(duì)照組不加藥。第二步細(xì)胞分為四組,空白對(duì)照組不加藥(Blank組),其余三組分別加入終濃度為2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿(Dau組)、50 μg/mL的5-FU(5-FU組)、2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿和50 μg/mL的5-FU(Dau+5-FU組)。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,配制成2×104/mL單細(xì)胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μL于培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜后加藥。第一步篩選實(shí)驗(yàn)分為六組,每組5個(gè)復(fù)孔,調(diào)零孔只加入PBS;空白對(duì)照組不加藥物,實(shí)驗(yàn)組分別加入藥物培養(yǎng),第二步實(shí)驗(yàn)一共分為四組,每組5個(gè)復(fù)孔,調(diào)零孔只加入PBS;空白對(duì)照組不加藥物;實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度藥物。于培養(yǎng)箱中孵育24 h后每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)液于每孔加入100 μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,配制成1×105/mL單細(xì)胞懸液,取200 μL加入24孔板上室中,24孔板下室培養(yǎng)加入500 μL含各種藥物的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,甲醛固定,結(jié)晶紫染色后拍照觀察。計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域取平均值。
調(diào)節(jié)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,配制成2×105/mL單細(xì)胞懸液,六孔板中每孔2 mL,待細(xì)胞貼壁時(shí)依次加入含有藥物的培養(yǎng)基,對(duì)照組不加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,多聚甲醛固定20 min,Tritonx-100打孔5 min,在避光條件下加入DAPI染色5 min,用400倍熒光顯微鏡進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)觀察。計(jì)數(shù)有效細(xì)胞,五個(gè)區(qū)域取平均值。凋亡率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組有效細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組有效細(xì)胞數(shù))×100%。
處于對(duì)數(shù)取生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,配制成1×105/mL單細(xì)胞懸液,實(shí)驗(yàn)組分別加入2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿(Dau-1組)、50 μg/mL的5-FU(5-FU組)、5 μg/mL的蝙蝠葛堿(Dau-2組)、2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿和50 μg/mL的5-FU(Dau-1+5-FU組),對(duì)照組不加任何藥物。按照提取蛋白-測(cè)定蛋白濃度-蛋白上樣-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-蛋白檢測(cè)。得到圖像并分析。
數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,其中MTT篩選實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析,其余組采用雙因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
MTT篩選實(shí)驗(yàn)顯示,2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異,作為蝙蝠葛堿的閾下濃度(圖1A)。Dau組對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率為(5.12±1.23)%,與空白對(duì)照組比較對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制(P>0.05);5-FU組對(duì)癌細(xì)胞的抑制率為(30.25±2.23)%,與空白對(duì)照組比較,對(duì)細(xì)胞的增殖有一定的抑制效應(yīng)(P<0.05);Dau+5-FU組對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制率升高為(60.25±2.25)%,與空白對(duì)照組、Dau組、5-FU組相比較,對(duì)癌細(xì)胞的增殖都有一定的抑制作用,說(shuō)明閾下濃度的蝙蝠葛堿可以增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制(圖1B)。
圖1 MTT檢測(cè)蝙蝠葛堿、5氟尿嘧啶作用于MCF-7細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖抑制率Figure 1 The inhibitory rates of proliferation were calculatod in MCF-7 cells treated with dauricine or 5-FU for 24 hNote:A.The inhibitory rate of dauricine in MCF-7 cells;B.The inhibitory rate of dauricine or 5-FU in MCF-7 cells.*P<0.05,compared to the control or 5-FU groups.
Dau組與空白對(duì)照組比較,對(duì)細(xì)胞遷移幾乎沒(méi)有影響;5-FU組與空白對(duì)照組比較,5-FU組對(duì)細(xì)胞的遷移有一定的抑制作用(P<0.05);Dau+5-FU組與5-FU組相對(duì)比,兩者合用比單用5-FU對(duì)細(xì)胞的遷移抑制作用大大增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明閾下濃度的蝙蝠葛堿可以增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞遷移的抑制(圖2)。
圖2 Transwell小室檢測(cè)蝙蝠葛堿、5氟尿嘧啶對(duì)MCF-7細(xì)胞24 h后遷移的影響Figure 2 The cell migration of dauricine or 5-FU in MCF-7 cellsNote:A.Crystal violet staining;B.The statistical results of migration.*P<0.05,compared to the control or 5-FU groups.
應(yīng)用DAPI染色觀察各組藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。當(dāng)培養(yǎng)24 h后,Dau組與空白對(duì)照組比較時(shí),對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯影響;當(dāng)5-FU組與空白對(duì)照組比較時(shí),5-FU組對(duì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡有一定的效果(P<0.05);將蝙蝠葛堿與5-FU聯(lián)用組與單用5-FU組比較時(shí),對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的能力大大增強(qiáng)(P<0.05),說(shuō)明閾下濃度的蝙蝠葛堿可增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用(圖3)。
圖3 應(yīng)用DAPI染色檢測(cè)蝙蝠葛堿、5氟尿嘧啶對(duì)MCF-7細(xì)胞24 h后凋亡的影響Figure 3 Effects of dauricine or 5-FU on apoptosis of MCF-7 cells after 24 hours treatment by DAPI stainingNote:A.MCF-7 cell DAPI staining;B.The DAPI staining MCF-7 cell apoptosis rate statistics,*P<0.05.
Dau-1組對(duì)cyclinD1和Bcl-2的表達(dá)與對(duì)照組相對(duì)比沒(méi)有明顯變化,Dau-2組對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生了較為明顯的影響。共用閾下濃度的蝙蝠葛堿(Dau-1)和5-FU組使cyclinD1和Bcl-2基因表達(dá)明顯下降,而單用5-FU組對(duì)其相關(guān)基因表達(dá)影響較小,共用組比單用5-FU組和Dau-2組對(duì)基因表達(dá)的抑制明顯。說(shuō)明2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿增強(qiáng)了5-FU對(duì)乳腺癌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),使增殖相關(guān)的cyclinD1基因和抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步下降,即通過(guò)抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用(圖4)。
圖4 應(yīng)用Western blot分析蝙蝠葛堿、5氟尿嘧啶對(duì)MCF-7細(xì)胞作用24 h后cyclinD1和Bcl-2相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 4 The expression of Bcl-2 and cyclin D1 in MCF-7 cells.MCF-7 cells treated with dauricine or 5-FU for 24 h.The expression of cyclin D1 and Bcl-2 protein was determined by Western blot.
乳腺癌是女性發(fā)病率較常見(jiàn)的腫瘤,其中雌激素受體(ER)陽(yáng)性乳腺癌占臨床所有乳腺癌的60%~65%[10]。本研究選取的MCF-7細(xì)胞是研究乳腺癌的一種經(jīng)典的細(xì)胞系,其雌激素受體為陽(yáng)性。而且5-FU作用于MCF-7細(xì)胞是常規(guī)的乳腺癌藥物治療模型,常用作乳腺癌抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)相關(guān)研究的一線臨床藥物對(duì)照,其臨床毒性作用和耐藥性具有典型性[11]。因此,選擇MCF-7細(xì)胞系與5-FU研究乳腺癌是具有代表性和現(xiàn)實(shí)意義的。
乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),本研究選擇MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生呈負(fù)相關(guān),對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)率已經(jīng)成為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的可靠指標(biāo)[12],本研究運(yùn)用DAPI染色來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率的影響。
本研究發(fā)現(xiàn)2.5 μg/mL的蝙蝠葛堿對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡沒(méi)有影響,可以排除抗腫瘤效果。可以作為蝙蝠葛堿的閾下濃度。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用閾下濃度(2.5 μg/mL)的蝙蝠葛堿增強(qiáng)了5-FU的抗腫瘤效果,這與蝙蝠葛堿增強(qiáng)了乳腺癌對(duì)5-FU的化療敏感性有關(guān)。
但是蝙蝠葛堿抗乳腺癌的藥理及分子靶向機(jī)制研究甚少。本研究旨在探索蝙蝠葛堿體外的抗腫瘤可能的機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛堿抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)其凋亡,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛堿的抗腫瘤作用是通過(guò)抑制NF-κB相關(guān)基因的表達(dá)完成的,具體表現(xiàn)為使增殖相關(guān)的cyclinD1基因和抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)下降。NF-κB是炎癥和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)至關(guān)重要的控制因子[13]。有實(shí)驗(yàn)顯示NF-κB有著抑制細(xì)胞增殖、遷移和新生血管的生成,介導(dǎo)細(xì)胞死亡等多種生理效用[14]。蝙蝠葛堿使其下游靶基因cyclinD1和Bcl-2基因表達(dá)減少,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。
本研究結(jié)果表明開(kāi)發(fā)蝙蝠葛堿作為乳腺癌的輔助治療藥物是可能的。蝙蝠葛堿作為一種已經(jīng)應(yīng)用于臨床的抗心律失常藥,其藥物安全性已得到充分的證實(shí),其作為乳腺癌的輔助治療藥物具備基本的安全條件[15-16]。但是關(guān)于蝙蝠葛堿與5-FU的交互作用鮮有報(bào)道,而且蝙蝠葛堿是一種生物堿類(lèi)成分,有較好的脂溶性,具有體內(nèi)攝取快、發(fā)揮療效快等優(yōu)點(diǎn)[16],這為開(kāi)發(fā)乳腺癌的輔助治療藥物提供了理論依據(jù)。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)閾下濃度的蝙蝠葛堿可增強(qiáng)化療藥物的敏感性,為開(kāi)發(fā)化療藥物的輔助用藥提供了理論基礎(chǔ),但是開(kāi)發(fā)可適用于臨床的新藥需要進(jìn)一步的研究。
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Dauricineenhancesthesensitivityof5-fluorouracilinhumanbreastcancerMCF-7cells
LIHongyang1,SUNLiang2,JIANGXing3,YUANGuangjun3,LIUYan1
1.Department of Oncology,The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China;2.Department of Human Anatomy,Harbin Medical University;3.Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine
ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of dauricine on the sensitivity of 5-fluorouracil(5-FU)in human breast cancer MCF-7 cells.MethodsMCF-7 cells were treated with 2.5 μg/mL of dauricine,50 μg/mL of 5-FU,or 2.5 μg/mL of dauricine with 50 μg/mL of 5-FU,the cell proliferation was measured by MTT assay.The cell migration was determined by Transwell assay;The cell apoptosis was detected by DAPI staining;The expression of cyclin D1 and Bcl-2 gene was examined by Western blot.ResultsThe results showed that the combination of subthreshold concentration of dauricine enhanced the inhibitory effect of 5-FU on proliferation in MCF-7 cells.The combined use of subcutaneous concentration of dauricine further aggravated the inhibitory effect of 5-FU on cell migration.The combination of subcapsular dauricine enhanced the induction of apoptosis by 5-FU.The combination of dauricine with 5-FU could inhibit the expression of cyclin D1 and Bcl-2 protein in MCF-7 cells.ConclusionDauricine can effectively enhance the sensitivity of 5-FU in human breast cancer MCF-7 cells.
Dauricine;5-Fluorouracil;Breast cancer;MCF-7 cells
黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H201464);黑龍江省高校專(zhuān)項(xiàng)基金(003000166)
1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(哈爾濱 150001);2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院
李紅陽(yáng),男,(1989-),碩士研究生,從事腫瘤內(nèi)科的研究。
劉艷,E-mail:1953786691@qq.com
R737.9
A
10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.001
(收稿:2017-01-17)