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    骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)載體的構(gòu)建及生物學(xué)功能鑒定

    2017-11-06 01:24:56姥偉代建寧景調(diào)平鄧彩霞楊海旭
    生物技術(shù)通訊 2017年4期
    關(guān)鍵詞:磷酸化定量質(zhì)粒

    姥偉,代建寧,景調(diào)平,鄧彩霞,楊海旭

    解放軍第五醫(yī)院 a.骨科中心;b.麻醉手術(shù)科;c.高壓氧;寧夏 銀川 750004

    骨形態(tài)發(fā)生蛋白2表達(dá)載體的構(gòu)建及生物學(xué)功能鑒定

    姥偉a,代建寧a,景調(diào)平b,鄧彩霞c,楊海旭a

    解放軍第五醫(yī)院 a.骨科中心;b.麻醉手術(shù)科;c.高壓氧;寧夏 銀川 750004

    目的:從真核細(xì)胞中獲得骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)編碼基因,構(gòu)建其真核表達(dá)載體并進(jìn)行鑒定。方法:提取人HeLa細(xì)胞總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用特異性引物擴(kuò)增BMP2編碼區(qū),連接至pcDNA3.1載體,篩選陽性克隆并進(jìn)行功能學(xué)鑒定。結(jié)果:反轉(zhuǎn)錄PCR獲得1100bp的片段,經(jīng)分子克隆后鑒定序列與BMP2一致,并且在真核細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)Smad1/5/8的磷酸化。結(jié)論:構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-BMP2并驗(yàn)證了其體內(nèi)功能,為后續(xù)探討B(tài)MP2在骨發(fā)育中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

    骨形態(tài)發(fā)生蛋白2;真核表達(dá)載體;Smad1/5/8

    骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic pro?teins,BMP)家族成員有20種,在結(jié)構(gòu)上相對保守,在骨骼的發(fā)育、再生和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。其中,對BMP2的研究較多。BMP2通過自分泌或旁分泌的方式刺激間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化,并進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞[3]。BMP2可以激活細(xì)胞內(nèi)諸多發(fā)育相關(guān)信號通路的活化,如PI3K/Akt通路、Smad通路、WNT通路等。因此,充分明確BMP2的功能及其在骨形成中的作用機(jī)制,對于骨相關(guān)疾病的研究和治療具有重要意義[4-6]。我們利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建了BMP2真核表達(dá)載體,為后續(xù)的功能研究打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;大腸桿菌TOP10、限制性內(nèi)切酶及連接酶購自TaKaRa公司;pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000購自Invitrogen公司;BMP2抗體和磷酸化Smad1/5/8抗體購自Cell Signaling Technology公司;β-actin購自博士德公司。

    1.2 pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    提取HeLa細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)BMP2的編碼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為5'-GAATTCATGGTGGCCGGGACCCGC-3',酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ;下游引物為5'-CTCGAGC?TAGCGACACCCACAACC-3',酶切位點(diǎn)為 XhoⅠ。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,30個(gè)循環(huán);72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收,用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,連接至pcDNA3.1質(zhì)粒反應(yīng)過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10,待單克隆長至肉眼可見菌落時(shí)轉(zhuǎn)接至含氨芐西林的LB培養(yǎng)基,擴(kuò)增宿主菌并進(jìn)行酶切鑒定,對陽性克隆進(jìn)行測序。

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

    將HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞接種至6孔板,待細(xì)胞密度長至約60%時(shí),取4μg pcDNA3.1質(zhì)粒(陰性對照)或4μg pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒,分別與10μL脂質(zhì)體2000混勻,轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,24h后收取細(xì)胞,分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western印跡實(shí)驗(yàn)。

    1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

    用TRIzol試劑盒分別提取HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞pcDNA3.1、pcDNA3.1-BMP2過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組樣品的總RNA,RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測各組中BMP2(上游引物:5'-ACTACCAGAAACGAGTGGGAA-3',下游引物:5'-GCATCTGTTCTCGGAAAACCT-3')和內(nèi)參照GAPDH(上游引物:5'-ACCCAGAA GACTGTGGATGG-3',下游引物:5'-TCTAGACGG CAGGTCAGGTC-3')mRNA的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性10s,55℃退火10s,72℃延伸 10s,30個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后,將所得循環(huán)數(shù)按照公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.5 Western印跡

    分別收取陰性對照、過表達(dá)pcDNA3.1-BMP2的HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞,加入RIPA蛋白裂解液,超聲波裂解細(xì)胞提取蛋白;離心后收取蛋白上清,通過BCA定量法對各組蛋白進(jìn)行定量;按照一定體積加入5×上樣緩沖液,于沸水中10min,保證蛋白充分變性;取30μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳實(shí)驗(yàn)(SDSPAGE),濃縮膠電壓為120 V,分離膠電壓為160 V;電泳完成后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上,用5%脫脂奶粉封閉1h;分別用BMP2抗體(1∶1000稀釋)、磷酸化Smad1/5/8抗體(1∶1000稀釋)和β-actin抗體(1∶500稀釋)與NC膜于4℃孵育過夜,次日用含0.5%Tween-20的TBST洗 3次,5min/次,再分別加入1∶5000的HRP標(biāo)記的二抗,室溫?fù)u床孵育1h,TBST洗3次,5min/次,ECL發(fā)光檢測,膠片顯色,分析結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參照。

    2 結(jié)果

    2.1 pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    以HeLa細(xì)胞的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增出BMP2編碼區(qū)域,將BMP2和pcDNA3.1分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10,挑取克隆提取質(zhì)粒,酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)1號和2號克隆均可在1000~2000bp位置切得條帶,此為BMP2編碼區(qū)基因序列(圖1)。經(jīng)測序鑒定正確后準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.2 BMP2 mRNA表達(dá)水平鑒定

    為了驗(yàn)證BMP2是否能在真核細(xì)胞中正確轉(zhuǎn)錄翻譯,將pcDNA3.1-BMP2和陰性對照pcDNA3.1空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞或HepG2細(xì)胞。通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與陰性對照相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP2質(zhì)粒的細(xì)胞中,BMP2的mRNA水平顯著升高,提示pcDNA3.1-BMP2質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)(圖2)。

    2.3 BMP2蛋白表達(dá)及Smad1/5/8磷酸化水平鑒定

    Smad1/5/8復(fù)合體是BMP2下游作用的信號分子,在BMP2高表達(dá)時(shí),Smad1/5/8的磷酸化水平顯著增加。為了驗(yàn)證pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒是否在細(xì)胞中發(fā)揮作用,我們通過Western印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在HeLa和HepG2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒均可顯著誘導(dǎo)BMP2蛋白水平的表達(dá),同時(shí)Smad1/5/8的磷酸化水平也顯著增加(圖3)。這表明pcDNA3.1-BMP2重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可成功表達(dá)并在體內(nèi)發(fā)揮功能。

    圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BMP2的EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

    圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測BMP2 mRNA表達(dá)

    圖3 Western印跡檢測BMP2和磷酸化Smad1/5/8表達(dá)水平

    3 討論

    生長因子在誘導(dǎo)干細(xì)胞向骨細(xì)胞發(fā)育的過程中扮演重要角色,目前已知BMP、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming grouth factor β,TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、成纖維素樣生長因子(fibroblast growth factor,F(xiàn)GF)在骨分化方面具有重要作用[7]。自1988年發(fā)現(xiàn)BMP2可以誘導(dǎo)骨和軟骨形成,BMP家族成員就已成為骨骼生物學(xué)研究的重要內(nèi)容[8]。BMP是TGF-β超家族成員,包含20多種亞型,通過調(diào)控BMP信號通路,可以改善骨骼質(zhì)量,治療骨生長相關(guān)疾病,修復(fù)骨和關(guān)節(jié)的損傷[9]。

    BMP2作為BMP家族中的一種亞型,在調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的過程中具有重要意義[10]。許多研究表明,BMP2表達(dá)降低或基因突變,可導(dǎo)致骨折、骨密度下降等骨相關(guān)疾病的發(fā)生。細(xì)胞膜表面分布著BMP受體,包括Ⅰ型受體(BMPRIA、BMPRIB和ACVRI)和Ⅱ型受體(BMPRII、ActRIIA和 ActRIIB)[11-12]。在BMP2刺激下,Ⅱ型受體被識別和激活,進(jìn)而募集Ⅰ型受體,Ⅰ型受體可活化下游R-Smad(包括Smad1、Smad5、Smad8)[13-14]。R-Smad與Smad4結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞,調(diào)控骨發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。此外,BMP2還可以通過激活WNT/β-Catenin、MAPK/ERK等非經(jīng)典的通路調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),促進(jìn)成軟骨、成骨信號,如軟骨分化轉(zhuǎn)錄因子Sox9、成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2[16-17]。

    本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了BMP2的真核表達(dá)載體,并利用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)對其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證,BMP2的過表達(dá)顯著促進(jìn)了R-Smad的磷酸化水平。上述結(jié)果為后續(xù)研究BMP2在骨發(fā)育中對干細(xì)胞分化的功能以及探討相關(guān)機(jī)制打下了重要基礎(chǔ)。

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    Construction and BiologicalFunction Characterization of BMP2 Expression Plasmid

    LAO Weia,DAI Jian-Ninga,JING Diao-Pingb,DENG Cai-Xiac,YANG Hai-Xua*
    a.Department of Orthopedics;b.Department of Anesthesiology;c.Department of Hyperbaric Oxygen;the 5th Hos?pital of PLA,Yinchuan 750004,China
    *Corresponding author,E-mail:bioyhx@126.com

    Objective:To clone bone morphogenetic protein 2(BMP2) full length gene from mammal cells,and then construct and characterize the mammal expression vector.Methods:The total RNA was extracted from HeLa cells.Amplify BMP2 full length cDNA through RT-PCR with a pair of specific gene primers.Clone it into pcD?NA3.1 vector.The positive clone was selected and sequenced.Verify the biological function of BMP2 in mammal cells.Results:The 1100bp specific fragment was obtained by RT-PCR.After the molecular cloning and sequenc?ing,BMP2 over-expressed in mammal cells can induce the phosphorylation of Smad1/5/8.Conclusion:We con?stucted pcDNA3.1-BMP2 and confirmed its function.These data provide a basis of the mechanistic study of BMP2 function in bone development.

    bone morphogenetic protein 2;mammal expression vector;Smad1/5/8

    Q78;Q24

    A

    1009-0002(2017)04-0506-04

    2016-12-26

    姥偉(1979- ),男,碩士,主治醫(yī)師,(E-mail)mulaowei@126.com

    楊海旭,(E-mail)bioyhx@126.com

    10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.020

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