• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    穩(wěn)定表達GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y細胞系的建立和功能初探

    2017-11-06 01:24:56趙海洲莫燦坤林展樂劉文華
    生物技術(shù)通訊 2017年4期
    關(guān)鍵詞:細胞系質(zhì)粒載體

    趙海洲,莫燦坤,林展樂,劉文華

    肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 肇慶 526061

    穩(wěn)定表達GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y細胞系的建立和功能初探

    趙海洲,莫燦坤,林展樂,劉文華

    肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 肇慶 526061

    目的:建立穩(wěn)定表達GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系,并檢測Parkin對MPP+引起的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。方法:將Parkin編碼序列克隆到載體pEGFP-C1中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-Parkin,轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,通過G418篩選,建立穩(wěn)定表達GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系;熒光顯微鏡和Western印跡鑒定Parkin表達,MTT法檢測Parkin對MPP+致細胞損傷的保護作用。結(jié)果:酶切鑒定及測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pEGFP-Parkin構(gòu)建正確;熒光顯微鏡下可見細胞內(nèi)有GFP-Parkin的融合表達,Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量79×103的蛋白條帶;MTT結(jié)果顯示Parkin能夠減弱MPP+對SH-SY5Y細胞的損傷,與對照組相比,存活率高約15%,差異顯著(P<0.05)。結(jié)論:構(gòu)建了穩(wěn)定表達GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系,為進一步研究Parkin的細胞保護作用和其他功能機制奠定了基礎(chǔ)。

    Parkin蛋白;SH-SY5Y細胞;穩(wěn)定表達;MPP+

    帕金森?。≒arkinson's disease,PD)是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病,主要特征表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、姿勢異常及記憶力減退等。85%~90%的帕金森病患者呈散發(fā)性,其發(fā)病與農(nóng)藥、重金屬等環(huán)境因素息息相關(guān)[1]。此外,帕金森病也存在家族遺傳性,5%~15%的帕金森病患者由單基因家族遺傳方式引起,這些基因包括Parkin(PARK2)、DJ-1(PARK7)、ATP13A2(PARK9)、PTEN-induced putative kinase 1(PINK1)、LRRK2(PARK8)和 SNCA(PARK1,4)等[2]。

    Parkin基因于1998年被克隆,其突變呈現(xiàn)常染色體隱性遺傳的青少年型帕金森病(autosomal recessive juvenile parkinsonism,ARJP)[3]。該基因定位于染色體6q25.2-27,位于遺傳標記D6S305和D6S253之間,含12個外顯子,基因的開放讀框為1395bp,所編碼的蛋白Parkin含465個氨基酸殘基。Parkin基因的缺失和位點突變與ARJP相關(guān)[4-5]。Parkin是一種E3泛素連接酶,在上游基因PINK1的啟動下,Parkin可以識別異常折疊蛋白,介導(dǎo)底物蛋白泛素化,進而通過泛素-蛋白酶體途徑降解異常折疊蛋白[6]。Parkin還參與氧化應(yīng)激及線粒體的自噬、形態(tài)維持和功能調(diào)控等[7-8]。過表達Parkin可以保護MPTP或6-OHDA引起的毒性損傷[9-10]。Parkin在神經(jīng)和非神經(jīng)組織中都有表達。在腦組織中,Parkin的亞細胞定位廣泛,包括線粒體、高爾基體、突觸小泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核等[11-13];在培養(yǎng)的細胞中,Parkin的亞細胞定位還存在爭議[14-15]。

    轉(zhuǎn)基因細胞模型是研究Parkin在細胞內(nèi)的定位、功能,以及與其他蛋白相互作用的重要工具,已廣泛用來研究Parkin與PD的關(guān)系[16-18]。以往在研究Parkin功能及其相關(guān)機制時常采用瞬時轉(zhuǎn)染,但瞬時轉(zhuǎn)染因存在轉(zhuǎn)染效率低、外源基因低表達等問題,而不利于精確闡明Parkin在細胞中的定位、功能等。因此,建立穩(wěn)定表達細胞系有利于深入研究其功能機制。

    我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達融合蛋白GFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系,為深入研究Parkin的定位和其他功能機制提供了可靠的細胞模型。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    SH-SY5Y細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢);胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS為 Gibco公司產(chǎn)品;MTT、MPP+、G418為Sigma公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液購自碧云天公司;ECL發(fā)光液購自Tanon公司;抗體GFP來自Cell Signaling Technology公司,抗體actin、PRK8購自Santa Cruz Biotechnology公司;山羊抗兔二抗購自Merk Millipore公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司;Lipo?fectAMINE 3000、蛋白marker、EB、EcoRⅠ和BamHⅠ來自Thermo Fisher Scientific公司;DNA marker購自廣州東盛生物科技有限公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

    1.2 Parkin基因的擴增

    以pCMV-Tag2B-Parkin質(zhì)粒(本實驗室保存)為模板,引物1為5'-GCGCGAATTCTATGATAGT GTTTGTCAGGTTC-3',引 物 2 為 5'-GCGCGGATC CCTACACGTCGAACCAGTGG-3',分別添加酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ,PCR擴增出人源Parkin編碼序列。

    1.3 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

    上述PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠分離,用膠回收試劑盒對目的片段切膠回收,將PCR膠回收產(chǎn)物和pEGFP-C1質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切,用T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài),卡那霉素篩選并挑取陽性單克隆菌落,菌落于37℃培養(yǎng)過夜,用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切初步鑒定,DNA測序進一步確認。測序鑒定采用通用引物,上游引物為EGFP-Cfor(5'-AG CACCCAGTCCGCCCTGAGC-3'),下 游 引 物 為SV40-pArev(5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3')。

    1.4 細胞培養(yǎng)

    SH-SY5Y細胞用含10%胎牛血清的無抗生素DMEM培養(yǎng)基,在恒溫37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2~3d細胞傳代一次,用對數(shù)期細胞進行實驗。

    1.5 穩(wěn)定表達GFP-Parkin細胞系的建立

    轉(zhuǎn)染前將SH-SY5Y細胞接種于6孔板中,細胞密度為1×105/孔,待細胞生長至70%~80%融合度,用 LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染 pEGFP-Parkin,同時設(shè)未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染載體pEGFP-C1的對照。轉(zhuǎn)染方法參照試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染后48h,將細胞培養(yǎng)液更換為含600μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基,篩選陽性克隆,之后每隔3d更換一次培養(yǎng)基(含600μg/mL G418)。

    轉(zhuǎn)染3周后,對表達綠色熒光的陽性細胞用含300μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。每天在熒光顯微鏡下觀察細胞,陽性細胞用于后續(xù)實驗,部分細胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 細胞形態(tài)學(xué)觀察

    對挑選的陽性細胞每天用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照,觀察內(nèi)容包括細胞生長的快慢、突觸生長、細胞貼壁、細胞形態(tài)變化,以及細胞內(nèi)的熒光強度等。

    1.7 MTT法檢測細胞存活率

    SH-SY5Y細胞按1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板,鋪板后24h用于實驗。實驗設(shè)立空白組(只有培養(yǎng)基,無細胞)、對照組(不加藥物)和藥物組(1mmol/L MPP+處理)。實驗每組設(shè)3個復(fù)孔,藥物作用 48h后每孔加入200μL MTT(0.5 mg/mL),孵育4h,棄上清,加入150μL DMSO溶解甲瓚,用酶標儀測定D490nm值。細胞存活率(%)=(藥物組D490nm-空白組D490nm)/(對照組D490nm-空白組D490nm)×100%。實驗重復(fù)3次。

    1.8 Western印跡檢測Parkin的表達

    用6cm培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)細胞,待細胞達到90%~100%融合度,用PBS洗1次,將細胞刮下,12 000r/min離心1min,棄上清,加入細胞裂解液至細胞沉淀,冰上裂解細胞20min,15 000r/min離心10min后取上清。Western印跡檢測Par?kin、actin的表達,分離膠濃度10%,電泳后轉(zhuǎn)膜,加相應(yīng)的一抗(GFP、Parkin和actin)、二抗孵育,ECL法顯影,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件進行,數(shù)據(jù)以x±s表示,采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

    如圖1A所示,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,可以看到1.4kb左右的條帶(白色箭頭所示),與預(yù)期大小相符。

    本研究所構(gòu)建的pEGFP-Parkin重組質(zhì)粒是將人源Parkin編碼序列通過EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切位點插入pEGFP-C1載體。重組質(zhì)粒EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切結(jié)果如圖1B所示,可見1.4kb(目的基因大?。┖?.7kb(載體大小)2條片段,與預(yù)測結(jié)果相符,表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。進一步DNA測序結(jié)果也顯示Parkin基因成功構(gòu)建于pEGFP-C1載體上,與GenBank登錄序列(AB009973)進行序列比對,序列完全一致(序列未示)。

    2.2 熒光顯微鏡檢測GFP-Parkin的表達

    用質(zhì)粒pEGFP-C1和pEGFP-Parkin轉(zhuǎn)染SHSY5Y細胞,經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)。用熒光顯微鏡檢測穩(wěn)定表達載體質(zhì)粒pEGFP-C1的細胞(命名為SH/GFP)和穩(wěn)定表達pEGFP-Parkin的細胞(命名為SH/GFP-Parkin)的熒光情況。結(jié)果顯示(圖2),SH/GFP和SH/GFP-Parkin細胞都可以穩(wěn)定表達綠色熒光(圖2D和F),可用于后續(xù)實驗。

    2.3 Western印跡檢測GFP-Parkin的表達

    圖1 Parkin基因擴增和重組質(zhì)粒鑒定

    分別用GFP抗體和PRK8抗體對蛋白進行檢測。GFP抗體檢測顯示(圖3A),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒pEGFP-C1的SH/GFP細胞可見相對分子質(zhì)量約27×103的GFP條帶;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-Parkin的SH/GFP-Parkin細胞有相對分子質(zhì)量約79×103的蛋白條帶,與GFP-Parkin的預(yù)測相對分子質(zhì)量相符。PRK8抗體檢測也發(fā)現(xiàn),SH/GFP-Parkin細胞可見79×103的 GFP-Parkin融合蛋白(圖3B)。這表明在蛋白水平上,Parkin基因在SH/GFP-Parkin細胞中穩(wěn)定表達。

    2.4 Parkin對MPP+損傷的保護作用

    MTT實驗結(jié)果(圖4A)表明,經(jīng)1mmol/L MPP+處理 48h,載體組細胞(SH/GFP)存活率為(43.9±3.9)%,穩(wěn)定表達 Parkin組細胞(SH/GFPParkin)存活率為(58.9±8.4)%,Parkin穩(wěn)定表達組細胞比載體組細胞存活率高約15%,差異顯著(P<0.05)。這表明Parkin可以部分抑制 MPP+對SH-SY5Y的損傷。

    圖4B顯示,不經(jīng)MPP+處理的正常細胞呈梭形,而SH/GFP細胞經(jīng)1mmol/L MPP+作用48h后,較多細胞皺縮變圓;SH/GFP-Parkin細胞經(jīng)1mmol/L MPP+作用48h后,較少細胞變圓。該結(jié)果與MTT實驗結(jié)果相符。

    圖2 熒光檢測GFP-Parkin蛋白的穩(wěn)定表達

    圖3 Western印跡檢測GFP-Parkin的表達

    3 討論

    Parkin蛋白的確切功能尚不明確,但已知其是一個E3泛素蛋白連接酶[19]。E3泛素蛋白連接酶是蛋白酶體降解系統(tǒng)的組成部分,主要功能是降解細胞內(nèi)不需要的或錯誤折疊的蛋白質(zhì)。

    圖4 Parkin對MPP+損傷的保護作用

    Parkin基因缺失和突變是ARJP發(fā)病的原因之一。Parkin保護多巴胺能細胞的機制并不十分清楚,目前一般認為Parkin通過對特定底物的降解來清除胞內(nèi)異常折疊蛋白,對細胞起到保護作用[6]。Parkin具有多種多樣的重要功能。如可維持線粒體的完整性,調(diào)節(jié)線粒體的自噬過程[7];還可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自由基傷害導(dǎo)致的細胞死亡等[20]。另有研究顯示Parkin突變和黑色素瘤之間存在相關(guān)性[21]。Parkin過表達及Parkin轉(zhuǎn)基因動物顯示其對神經(jīng)毒素MPTP和6-OHDA引起的多巴胺神經(jīng)元損失,以及α-synuclein、A-beta對神經(jīng)元的毒性具有明顯的保護作用[9-10,22-23]。本研究也發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達Parkin可以保護MPP+對SHSY5Y細胞的毒性損傷。但Parkin可能還有更多功能未被發(fā)現(xiàn)。對Parkin進行深入研究,闡明其和PD病理之間的關(guān)系,將有助于提供新的藥物作用靶點,為PD的治療提供新的策略。

    目前,對Parkin的研究主要采用瞬時轉(zhuǎn)染方式[17,24-25]。雖然瞬時轉(zhuǎn)染較為簡單,但成本高,需要大量質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染效率偏低,并且基因表達不穩(wěn)定,表達時間有限,不利于重復(fù)實驗和實驗結(jié)果比較。所以建立穩(wěn)定表達Parkin蛋白的細胞系就顯得尤為重要,特別是在轉(zhuǎn)染效率較低的SH-SY5Y細胞中。

    目的蛋白與綠色熒光蛋白的融合表達具有檢測方便、不須染色、對細胞無毒、利于研究目的蛋白的細胞內(nèi)定位等優(yōu)點[26]。目前Parkin在細胞內(nèi)的亞細胞定位還存在爭議。

    本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達融合蛋白GFP-Parkin的細胞系,這將有利于對Parkin細胞內(nèi)亞細胞定位的進一步研究,尤其有利于蛋白在活細胞中的實時定位研究。目前已建立了穩(wěn)定表達Parkin的PC12和SH-SY5Y細胞系[27-28],但其中Parkin并未融合GFP,不利于Parkin亞細胞定位的研究。而本研究構(gòu)建的GFP-Parkin細胞系可實現(xiàn)對Parkin的可視化研究,這為今后觀察Parkin蛋白活細胞實時定位、細胞內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)運提供了理想的細胞系。

    盡管對Parkin蛋白的研究已進行多年,但由于其功能多樣,因此很多功能機制尚不清楚,目前還處于初級階段。本研究建立了一個在基因組DNA中穩(wěn)定整合pEGFP-Parkin的SH-SY5Y細胞系,在該細胞系中融合蛋白GFP-Parkin得到有效穩(wěn)定表達,并初步證明Parkin可以減弱MPP+對SH-SY5Y細胞的損傷。該細胞系的建立為深入研究Parkin基因功能提供了較好的細胞模型。

    [1] Kwakye G F,Mcminimy R A,Aschner M.Diseasetoxicant interactions in Parkinson's disease neuropathol?ogy[J].Neurochem Res,2017,42(6):1772-1786.

    [2] Farrer M J.Genetics of Parkinson disease:paradigm shifts and future prospects[J].Nat Rev Genet,2006,7(4):306-318.

    [3] Kitada T,Asakawa S,Hattori N,et al.Mutations in the parkin gene cause autosomalrecessive juvenile parkinsonism[J].Nature,1998,392(6676):605-608.

    [4] Matsumine H,Yamamura Y,Hattori N,et al.A micro?deletion of D6S305 in a family of autosomal recessive juvenile Parkinsonism(PARK2)[J].Genomics,1998,49(1):143-146.

    [5] Lücking C B,Dürr A,Bonifati V,et al.Association between early-onset Parkinson's disease and mutations in the parkin gene[J].N Engl J Med,2000,342(21):1560-1567.

    [6] Xiong H,Wang D,Chen L,et al.Parkin,PINK1,and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promot?ing unfolded protein degradation[J].J Clin Invest,2009,119(3):650-660.

    [7] Skujat D.PINK1/Parkin-mediated mitophagy is depen?dent on VDAC1 and p62/SQSTM1[J].Nat Cell Biol,2010,12(2):119-131.

    [8] Wang Y,Nartiss Y,Steipe B,et al.ROS-induced mi?tochondrial depolarization initiates PARK2/PARKIN-de?pendent mitochondrial degradation by autophagy[J].Au?tophagy,2012,8(10):1462-1476.

    [9] Paterna J C,Leng A,Weber E,et al.DJ-1 and Par?kin modulate dopamine-dependent behavior and inhib?it MPTP-induced nigral dopamine neuron loss in mice[J].Mol Ther,2007,15(4):698-704.

    [10]Vercammen L,Van der Perren A,Vaudano E,et al.Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxy?dopamine ratmodelforParkinson's disease[J].Mol Ther,2006,14(5):716-723.

    [11]Zarate-Lagunes M,Gu W J,Blanchard V,et al.Par?kin immunoreactivity in the brain of human and nonhuman primates:an immunohistochemical analysis in normal conditions and in Parkinsonian syndromes[J].J Comp Neurol,2001,432(2):184.

    [12]Shimura H,Hattori N,Kubo S,et al.Immunohisto?chemicaland subcellularlocalization ofParkin pro?tein:absence of protein in autosomal recessive juve?nile parkinsonism patients[J].Ann Neurol,1999,45(5):668-672.

    [13]Stichel C C,Augustin M,Kühn K,et al.Parkin ex?pression in the adult mouse brain[J].Eur J Neurosci,2000,12(12):4181.

    [14]Darios F,Corti O,Lücking C B,et al.Parkin pre?vents mitochondrial swelling and cytochrome c release in mitochondria-dependentcelldeath[J].Hum Mol Genet,2003,12(5):517-526.

    [15]Kubo S I,Kitami T,Noda S,et al.Parkin is associat?ed with cellular vesicles[J].J Neurochem,2001,78(1):42-54.

    [16]Koch A,Lehmann-Horn K,D?chsel J C,et al.Protea?somal inhibition reduces parkin mRNA in PC12 and SH-SY5Y cells[J].Parkinsonism Relat Disord,2009,15(3):220-225.

    [17]Narendra D,Tanaka A,Suen D F,et al.Parkin is re?cruited selectively to impaired mitochondria and pro?motes their autophagy[J].J Cell Biol,2012,183(5):795-803.

    [18]Joselin A P,Hewitt S J,Callaghan S M.ROS-depen?dent regulation of Parkin and DJ-1 localization dur?ingoxidativestressin neurons[J].Hum MolGenet,2012,21(22):4888-4903.

    [19]Imai Y,Soda M,Takahashi R.Parkin suppresses un?folded protein stress-induced cell death through its E3 ubiquitin-protein ligase activity[J].J Biol Chem,2000;275(46):35661-35664.

    [20]Wang H Q,Imai Y,Kataoka A,et al.Cell type-spe?cific upregulation of Parkin in response to ER stress[J].Antioxid Redox Signal,2007,9(5):533-542.

    [21]Hu H H,Kannengiesser C,Lesage S,et al.PARKIN inactivation links Parkinson's disease to melanoma[J].J Natl Cancer Inst,2015,108(3).

    [22]ShimuraH,SchlossmacherM G,HattoriN,etal.Ubiquitination of a new form of α-Synuclein by Par?kin from human brain:implications for Parkinson's dis?ease[J].Science,2001,293(5528):263-269.

    [23]Burns M P,Zhang L,Rebeck G W,et al.Parkin pro?motes intracellular Abeta1-42 clearance[J].Hum Mol Genet,2009,18(17):3206-3216.

    [24]Hou X O,Si J M,Ren H G,et al.Parkin represses 6-hydroxydopamine-induced apoptosisviastabilizing scaffold protein p62 in PC12 cells[J].Acta Pharmacol Sin,2015,36(11):1300-1307.

    [25]Kuroda Y,Mitsui T,Kunishige M,et al.Parkin af?fects mitochondrial function and apoptosis in neuronal and myogenic cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,348(3):787-793.

    [26]Stepanenko O V,Verkhusha V V,Kuznetsova I M,et al.Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors:throwing color lights on molecular and cellular process?es[J].Curr Protein Pept Sci,2008,9(4):338-369.

    [27]楊卉,陳生弟,李彪,等.人野生型parkin基因真核表達載體的構(gòu)建及其在PC12細胞中的表達[J].神經(jīng)科學(xué)通報(英文版),2004,20(1):60-64.

    [28]Jiang H,Ren Y,Zhao J,et al.Parkin protects human dopaminergic neuroblastoma cells against dopamine-in?duced apoptosis[J].Hum Mol Genet,2004,13(16):1745-1754.

    EstablishmentofSH-SY5Y CellLineStablyExpressing GFP-Parkin and its Preliminary Function

    ZHAO Hai-Zhou,MO Can-Kun,LIN Zhan-Le,LIU Wen-Hua*
    School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing 526061,China
    *Corresponding anthor,E-mail:wenhualiu@hotmail.com

    Objective:To establish SH-SY5Y cell line stably expressing GFP-Parkin,and evaluate its protective effect against MPP+by MTT assay.Methods:The coding sequence of human Parkin was cloned into the vector pEGFP-C1 to construct recombinant plasmid pEGFP-Parkin.The pEGFP-Parkin plasmid was transfected into SHSY5Y cells using LipofectAMINE 3000,and positive-expression cells were screened by using G418.The expres?sion of GFP-Parkin was identified with fluorescent microscopy and Western blot.The protective effect of Parkin against MPP+in SH-SY5Y cells was detected by MTT assay.Results:The constructed pEGFP-Parkin plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis.Fluorescence photographs and West?ern blot data revealed that the SH-SY5Y cells expressed GFP-Parkin protein stably.MTT assay showed that sur?vival of Parkin group was 15%higher than that of control group after exposure to 1mmol/L MPP+for 48h(P<0.05),indicating that Parkin significantly enhanced cell survival.Conclusion:SH-SY5Y cell line stably express?ing GFP-Parkin has been established,laying a foundation for further investigating cytoprotective effects and other functional mechanisms of Parkin.

    Parkin protein;SH-SY5Y cells;stable expression;MPP+

    Q78;R741.02

    A

    1009-0002(2017)04-0429-06

    2017-04-17

    國家自然科學(xué)基金(31271124);廣東省教育廳重大項目(2014KZDXM075);廣東省教育廳創(chuàng)新團隊項目(2015KCXTD032);廣東省教育廳青年創(chuàng)新人才項目(2016KQNCX178)

    趙海洲(1987- ),男,碩士,研究實習(xí)員,(E-mail)zhaohaizhou012@163.com

    劉文華,(E-mail)wenhualiu@hotmail.com

    10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.005

    猜你喜歡
    細胞系質(zhì)粒載體
    創(chuàng)新舉措強載體 為僑服務(wù)加速跑
    華人時刊(2022年9期)2022-09-06 01:02:44
    堅持以活動為載體有效拓展港澳臺海外統(tǒng)戰(zhàn)工作
    華人時刊(2020年15期)2020-12-14 08:10:36
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細胞系增殖與凋亡的影響
    TiO_2包覆Al_2O_3載體的制備及表征
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    抑制miR-31表達對胰腺癌Panc-1細胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的作用
    E3泛素連接酶對卵巢癌細胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    BAG4過表達重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞的鑒定
    国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产主播在线观看一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 少妇的逼好多水| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 中文资源天堂在线| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 免费在线观看日本一区| x7x7x7水蜜桃| 99国产综合亚洲精品| 欧美bdsm另类| 在线天堂最新版资源| 久久国产精品人妻蜜桃| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| av中文乱码字幕在线| netflix在线观看网站| 色av中文字幕| 国产精华一区二区三区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人精品一区二区免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 男女视频在线观看网站免费| 久久久久久久久久黄片| 亚洲 国产 在线| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲av不卡在线观看| 久久久久九九精品影院| 变态另类丝袜制服| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本一二三区视频观看| 色综合站精品国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品不卡国产一区二区三区| av专区在线播放| 一级av片app| 欧美成人一区二区免费高清观看| 哪里可以看免费的av片| 欧美又色又爽又黄视频| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产午夜福利久久久久久| 久久久久久久久中文| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲av免费高清在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| av国产免费在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 人人妻人人看人人澡| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久性视频一级片| av在线天堂中文字幕| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品福利观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| xxxwww97欧美| 久久久久久国产a免费观看| 午夜影院日韩av| 成年女人看的毛片在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲精华国产精华精| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 少妇被粗大猛烈的视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品国产高清国产av| 丁香六月欧美| 日本三级黄在线观看| 午夜激情福利司机影院| 在线观看午夜福利视频| 久久久精品欧美日韩精品| 精品一区二区免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美区成人在线视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 九色国产91popny在线| 国产精品久久久久久久久免 | 在线播放国产精品三级| 免费在线观看亚洲国产| 一本久久中文字幕| 国产高清有码在线观看视频| 久久精品影院6| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲一区二区三区色噜噜| 少妇的逼水好多| 国产av一区在线观看免费| 久久久久性生活片| 成年人黄色毛片网站| 亚洲黑人精品在线| or卡值多少钱| 波多野结衣高清作品| 一a级毛片在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 成年女人看的毛片在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 中文字幕高清在线视频| 观看免费一级毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲成人久久爱视频| 国模一区二区三区四区视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久性视频一级片| 夜夜爽天天搞| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久久国产a免费观看| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美在线黄色| av天堂在线播放| 身体一侧抽搐| 国产老妇女一区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩欧美在线乱码| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本三级黄在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 夜夜爽天天搞| а√天堂www在线а√下载| 亚洲无线在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费av毛片视频| 亚洲片人在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 男人舔奶头视频| 日韩免费av在线播放| 不卡一级毛片| 一区二区三区激情视频| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美激情国产日韩精品一区| av专区在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩欧美国产在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲最大成人手机在线| 最近最新免费中文字幕在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级毛片久久久久久久久女| or卡值多少钱| a级毛片a级免费在线| 亚洲内射少妇av| 国产av不卡久久| www.999成人在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 久久这里只有精品中国| 日韩中字成人| 国产野战对白在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲色图av天堂| 99久久九九国产精品国产免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| 日韩欧美在线乱码| 在线观看舔阴道视频| 亚洲午夜理论影院| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 看片在线看免费视频| av专区在线播放| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产av麻豆久久久久久久| 免费在线观看日本一区| 国产欧美日韩精品一区二区| 日本三级黄在线观看| 国产av一区在线观看免费| 精品久久久久久久久久久久久| 级片在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看| av在线老鸭窝| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 免费人成在线观看视频色| 看片在线看免费视频| 在线国产一区二区在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品456在线播放app | 国产亚洲欧美98| 国产v大片淫在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 成年免费大片在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 又爽又黄无遮挡网站| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产大屁股一区二区在线视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 99热精品在线国产| 国产精品人妻久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 国产高清三级在线| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久久久中文| 国产精品亚洲美女久久久| 99国产精品一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 精品福利观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产高潮美女av| av中文乱码字幕在线| 精品久久久久久久久亚洲 | 成人三级黄色视频| 久久久成人免费电影| 十八禁网站免费在线| 国产高清有码在线观看视频| 97热精品久久久久久| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av美国av| 亚洲国产欧美人成| 亚洲av一区综合| 老鸭窝网址在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 午夜激情欧美在线| 婷婷丁香在线五月| 久久人妻av系列| 午夜视频国产福利| 免费看光身美女| 亚洲中文字幕日韩| 一进一出抽搐gif免费好疼| 人人妻人人澡欧美一区二区| avwww免费| 十八禁网站免费在线| 中文字幕熟女人妻在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 青草久久国产| 国产综合懂色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费看光身美女| 精品不卡国产一区二区三区| 久久热精品热| 欧美在线黄色| 日本精品一区二区三区蜜桃| 舔av片在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美丝袜亚洲另类 | 男人狂女人下面高潮的视频| 天堂影院成人在线观看| 91在线观看av| 国产探花极品一区二区| 亚洲色图av天堂| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av免费在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲不卡免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本成人三级电影网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费高清视频大片| 淫秽高清视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 无人区码免费观看不卡| 国产久久久一区二区三区| 国产精品野战在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲一区二区三区色噜噜| 成人三级黄色视频| 一二三四社区在线视频社区8| 舔av片在线| 男人的好看免费观看在线视频| 久久久久性生活片| 一本精品99久久精品77| 看黄色毛片网站| 日本成人三级电影网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲,欧美精品.| 亚洲av一区综合| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费看日本二区| 国产精品电影一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 日韩免费av在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 丝袜美腿在线中文| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美激情在线99| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 麻豆一二三区av精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 他把我摸到了高潮在线观看| 嫩草影院精品99| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一级黄色大片毛片| 日本与韩国留学比较| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美激情在线99| 国产日本99.免费观看| 亚洲在线自拍视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 在线国产一区二区在线| 美女黄网站色视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲色图av天堂| 午夜影院日韩av| 亚洲国产欧美人成| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费av观看视频| 欧美日韩黄片免| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99热6这里只有精品| 亚洲在线自拍视频| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 男插女下体视频免费在线播放| 校园春色视频在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久热精品热| 男女床上黄色一级片免费看| 中亚洲国语对白在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 村上凉子中文字幕在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜福利在线在线| 国产精品三级大全| 欧美色视频一区免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品成人久久久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 熟女人妻精品中文字幕| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜两性在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 久久6这里有精品| 免费看日本二区| 欧美+日韩+精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜福利免费观看在线| 麻豆国产av国片精品| 老女人水多毛片| 麻豆成人av在线观看| 久久久成人免费电影| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品日产1卡2卡| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 极品教师在线免费播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 中文字幕高清在线视频| 日韩人妻高清精品专区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品91蜜桃| 亚洲av免费在线观看| 久久性视频一级片| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚州av有码| 最近在线观看免费完整版| 欧美极品一区二区三区四区| 又黄又爽又免费观看的视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久精品影院6| 一级作爱视频免费观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看成人毛片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 久久热精品热| 露出奶头的视频| 51国产日韩欧美| 国产精品不卡视频一区二区 | 能在线免费观看的黄片| 赤兔流量卡办理| av在线观看视频网站免费| 黄色视频,在线免费观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 看黄色毛片网站| 精品人妻1区二区| 国产黄色小视频在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| h日本视频在线播放| 亚洲av.av天堂| 在现免费观看毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩欧美免费精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 黄色日韩在线| 亚州av有码| 国产成人aa在线观看| 少妇的逼水好多| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲黑人精品在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产爱豆传媒在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 在线看三级毛片| 黄色一级大片看看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品女同一区二区软件 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 伊人久久精品亚洲午夜| www.色视频.com| av女优亚洲男人天堂| 高清日韩中文字幕在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久人人精品亚洲av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人av一区二区三区在线看| 舔av片在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品三级大全| 老司机午夜福利在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 少妇的逼好多水| 久久精品综合一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 免费av不卡在线播放| 亚洲内射少妇av| 欧美3d第一页| 麻豆成人av在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 免费看日本二区| 国产精品久久久久久久电影| 我要看日韩黄色一级片| 校园春色视频在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 露出奶头的视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美性感艳星| 午夜久久久久精精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产黄色小视频在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 大型黄色视频在线免费观看| 岛国在线免费视频观看| 亚洲av成人精品一区久久| 精品国产三级普通话版| 亚洲avbb在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 深爱激情五月婷婷| 一本精品99久久精品77| 精品人妻1区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 赤兔流量卡办理| 99久久精品热视频| 热99re8久久精品国产| 国产乱人伦免费视频| 久久久久久国产a免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 悠悠久久av| 日本a在线网址| 亚洲三级黄色毛片| eeuss影院久久| 久99久视频精品免费| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品综合一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成人久久性| 一区二区三区四区激情视频 | 国产成人a区在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 麻豆一二三区av精品| 一进一出好大好爽视频| 桃色一区二区三区在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 69人妻影院| 真人做人爱边吃奶动态| 国产伦精品一区二区三区视频9| 无人区码免费观看不卡| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品女同一区二区软件 | av黄色大香蕉| 久久久成人免费电影| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久九九热精品免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产成人福利小说| 国产av一区在线观看免费| 日本与韩国留学比较| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | or卡值多少钱| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美在线黄色| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本黄色视频三级网站网址| 国产高清有码在线观看视频| 成人精品一区二区免费| 在线免费观看的www视频| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩精品青青久久久久久| 日本一二三区视频观看| 婷婷亚洲欧美| 乱人视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费av毛片视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 最近在线观看免费完整版| 在线a可以看的网站| 搡老妇女老女人老熟妇| a级一级毛片免费在线观看| 色吧在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 少妇人妻一区二区三区视频| 无人区码免费观看不卡| 日本黄大片高清| a在线观看视频网站| 伦理电影大哥的女人| 免费大片18禁| 色综合婷婷激情| 少妇的逼好多水| 精品久久久久久久久久免费视频| 婷婷六月久久综合丁香| 99久国产av精品| 在线观看av片永久免费下载| 青草久久国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜亚洲福利在线播放| 18+在线观看网站| 有码 亚洲区| 怎么达到女性高潮| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 色av中文字幕| 久久国产乱子免费精品| 99热这里只有是精品在线观看 | 免费观看的影片在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 欧美zozozo另类| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美性感艳星| 91九色精品人成在线观看| 丰满乱子伦码专区| 成人一区二区视频在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜久久久久精精品| 他把我摸到了高潮在线观看| 日本三级黄在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产探花极品一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美精品国产亚洲| 亚洲在线观看片| 波多野结衣高清作品| 亚洲在线观看片| 天堂动漫精品| av在线老鸭窝| 欧美黑人欧美精品刺激| 观看免费一级毛片| 色综合站精品国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 乱人视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 午夜福利高清视频| 精品人妻熟女av久视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美一区二区精品小视频在线| av女优亚洲男人天堂| 成人毛片a级毛片在线播放| 简卡轻食公司| 成人国产一区最新在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 我的老师免费观看完整版| 欧美成狂野欧美在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看av片永久免费下载| 热99re8久久精品国产| av天堂在线播放| 欧美3d第一页| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩欧美在线二视频| 亚洲激情在线av| 夜夜躁狠狠躁天天躁|