三葉片對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂小鼠血清載脂蛋白A5的影響

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

三葉片對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂小鼠血清載脂蛋白A5的影響

路美娟1，2，王保和2，徐強(qiáng)2，莊建國(guó)1

目的通過(guò)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，觀察三葉片(又名三葉糖脂清)對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂小鼠血清載脂蛋白A5(ApoA5)的影響。方法采用高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂小鼠模型，用三葉片、非諾貝特、血脂康連續(xù)灌藥30 d后，取血、分離血清，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清ApoA5含量。結(jié)果與模型組比較，正常對(duì)照組、血脂康組、非諾貝特組、三葉片低劑量組(0.864 g/kg)ApoA5含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；非諾貝特組與血脂康組、三葉片高劑量組、三葉片低劑量組ApoA5比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；三葉片高、低劑量組之間ApoA5比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論三葉片降脂作用很有可能是通過(guò)影響ApoA5而實(shí)現(xiàn)的；三葉片的降脂作用不呈劑量依賴性。

高脂血癥；三葉片；載脂蛋白A5；血脂；痰濁

高脂血癥作為心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素[1-2]，發(fā)病率逐年上升。降脂治療成為防治心腦血管疾病重要基石，相關(guān)研究始終是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)。載脂蛋白作為脂質(zhì)代謝過(guò)程中的重要因素，逐漸被大家重視，血清載脂蛋白A5(ApoA5)作為最新的載脂蛋白家族成員，于2001年由Pennacchio 和 vander Vliet 等[3-4]所發(fā)現(xiàn)。目前，多項(xiàng)研究證明ApoA5 是一個(gè)關(guān)鍵性的血漿三酰甘油(TG)調(diào)節(jié)因子。

多項(xiàng)研究證明，三葉片(又名三葉糖脂清)具有明確的改善脂質(zhì)代謝紊亂作用，本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)制作高脂小鼠模型，觀察三葉片對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照藥調(diào)脂作用，并通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組ApoA5含量，探討三葉片調(diào)脂作用與ApoA5的關(guān)聯(lián)性，為三葉片調(diào)脂作用的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 三葉片，山東步長(zhǎng)神州制藥有限公司提供(CFDA批件號(hào)2010L00278)；血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20160602)；非諾貝特片，RECIPHARM FONTAINE生產(chǎn)(批號(hào)：23923)。實(shí)驗(yàn)前用0.5%檸檬酸(CMC)配成25 g/L的藥液。

1.2 動(dòng)物 健康雄性C57BL/6J小鼠90只，體質(zhì)量(20.52±0.08)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SPF級(jí)，合格證編號(hào)：11400700124871，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，溫度 19 ℃～24 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 試劑 三酰甘油測(cè)定試劑盒GPO-PAP法(生產(chǎn)批號(hào)：160871，中生北控生物科技股份有限公司提供)；總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒CHOD-PAP法(生產(chǎn)批號(hào)：161441，中生北控生物科技股份有限公司提供)；葡萄糖測(cè)定試劑盒葡萄糖氧化酶法(生產(chǎn)批號(hào)：160741，中生北控生物科技股份有限公司提供)；ELISA方法檢測(cè)小鼠ApoA5試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20160523，天津市萊博科技有限公司提供)。

1.3.2 飼料 高糖脂飼料12492，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.3.3 儀器 全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 7020型，日立公司)；離心機(jī) (Legend Micro17，Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 高脂模型制作 選取C57BL/6J小鼠90只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組法分為空白組和模型組，其中空白組12只，模型組78只。空白組喂普通飼料，模型組喂高脂飼料，連續(xù)8周。8周后，禁食(不禁水)24 h，檢測(cè)空腹血脂，以血清TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量顯著升高的小鼠為成功模型，納入實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組方法 保留空白組小鼠12只，選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的模型組小鼠60只，采用隨機(jī)區(qū)組法分為模型組、非諾貝特組、血脂康組及三葉片高、低劑量組，每組12只。

1.4.3 給藥方法 非諾貝特組給予非諾貝特0.1 g/(kg·d)；血脂康組給予血脂康0.25 g/(kg·d)；三葉片高、低劑量組給予三葉片4.320 g/(kg·d)、0.864 g/(kg·d)。各治療組均灌胃給藥，給藥體積為1 mL/30 g，空白組和模型組給予等體積的0.5%CMC，每周稱質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量，連續(xù)灌胃給藥30 d。用藥期間空白組喂普通飼料，模型組和各給藥組仍給予高脂飼料，自由飲水。

1.4.4 標(biāo)本采集 灌胃給藥30 d 后，禁食(不禁水)10 h，末次灌胃給藥1 h后，3.5%水合氯醛280 mg/kg，腹腔注射麻醉小鼠，眼球后取血。將全血注入1.5 mL EP離心管中靜置，3 500 r/min，離心10 min，分離血清，分裝于1.5 mL 凍存管中，-80 ℃冰箱冷貯待檢。

1.4.5 檢測(cè)方法 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(購(gòu)買相應(yīng)試劑盒)，采用終點(diǎn)法檢測(cè)TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。采用ELISA 方法檢測(cè)小鼠ApoA5的含量。按照ApoA5 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié) 果

2.1 三葉片對(duì)高脂模型小鼠TG、TC的影響(見(jiàn)表1)

表1 三葉片對(duì)高脂模型小鼠TG、TC的影響(±s)

2.2 三葉片對(duì)高脂模型小鼠LDL-C、HDL-C的影響(見(jiàn)表2)

表2 三葉片對(duì)高脂模型小鼠LDL-C、HDL-C的影響(±s)

2.3 三葉片對(duì)高脂模型小鼠ApoA5濃度的影響(見(jiàn)表3)

表3 三葉片對(duì)高脂模型小鼠ApoA5濃度的影響(±s)

3 討 論

在我國(guó)高脂血癥，尤其是高三酰甘油血癥的發(fā)病率較歐美國(guó)家升高，這可能與我國(guó)人民的飲食結(jié)構(gòu)以及遺傳基因有關(guān)。眾所周知，血脂異常是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要危險(xiǎn)因素，與心腦血管病的發(fā)病率和病死率相關(guān)聯(lián)；因此，改善脂質(zhì)代謝紊亂是防治心腦血管疾病的重要措施之一。

中醫(yī)藥在改善脂質(zhì)代謝紊亂方面具有整體調(diào)節(jié)的優(yōu)點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)沒(méi)有“高脂血癥”的病名，其應(yīng)屬于中醫(yī)“痰濁”“血濁”等范疇。其病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，其發(fā)生本源在脾，根本在腎，與肝、膽、心、肺密切相關(guān)。標(biāo)實(shí)為痰瘀阻滯于脈[5-6]。三葉糖脂清(最新劑型為三葉片)湯劑是天津中醫(yī)藥大學(xué)張伯禮教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，源自宋代《太平圣惠方》，為復(fù)方中藥，組方包括山楂、桑葉、荷葉、赤芍、丹參五味中藥組成。本方從痰瘀立論，以健脾除濕、 利水祛痰、活血逐瘀為原則，符合中醫(yī)對(duì)高脂血癥的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，三葉糖脂清(三葉片為其最新劑型)有良好的藥理毒理、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)研究[7-12]，證明有很好的改善脂代謝紊亂作用，但其作用機(jī)制尚需深入研究。vander Vliet等[4]通過(guò)研究證明，ApoA5 過(guò)表達(dá)伴腺病毒轉(zhuǎn)染的小鼠與野生型小鼠相比，其血漿TG水平降低了70%，且所降低的血漿TG依賴于極低密度脂蛋白(VLDL)降低的部分。而ApoA5基因敲除的小鼠則與此相反，其血漿TG水平較對(duì)照組增加4倍。以上結(jié)果表明，ApoA5與血漿TG水平間呈負(fù)相關(guān)，缺乏正常運(yùn)作的 ApoA5是高TG血癥的危險(xiǎn)因素之一?；谀壳皣?guó)內(nèi)外缺乏中藥通過(guò)調(diào)節(jié)ApoA5蛋白改善脂代謝作用研究，因而中藥改善脂代謝紊亂的作用是否與ApoA5有關(guān)將成為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)，為中藥降脂作用機(jī)制研究拓展方向。

本項(xiàng)研究證實(shí)，與模型組相比，三葉片能夠不同程度地降低實(shí)驗(yàn)性高脂小鼠TC、TG水平(P<0.01)。在降低TG方面，三葉片高、低劑量組與非諾貝特組及血脂康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三葉片高、低劑量組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在降低TC方面，各治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各治療組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明三葉片降低TC作用與非諾貝特、血脂康具有等效性。在LDL-C方面，各治療組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從數(shù)值上看有下降趨勢(shì)，很可能與動(dòng)物數(shù)少及灌藥時(shí)間短有關(guān)。在HDL-C方面，各治療組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組較其他治療組高，表明各治療組無(wú)升高HDL-C作用。通過(guò)ELISA法檢測(cè)高脂小鼠血清中ApoA5的濃度，除三葉片高劑量組外，其余治療組均高于模型組，各治療組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示三葉片有降低TG、TC作用，降低TG不優(yōu)于非諾貝特及血脂康組；降低TC作用與非諾貝特及血脂康組具有等效性；三葉片高、低劑量組在降低TG、TC方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且TG、TC濃度與ApoA5含量呈負(fù)相關(guān)，由此推斷，三葉片調(diào)脂作用機(jī)制很可能是通過(guò)影響ApoA5實(shí)現(xiàn)的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論提示中藥降脂作用，很可能通過(guò)調(diào)控ApoA5基因，影響ApoA5蛋白進(jìn)而改善脂質(zhì)代謝紊亂，從而為中藥調(diào)脂作用機(jī)制研究提供依據(jù)，拓展思路。

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Effect of Sanye Tablets on Serum Apolipoprotein A5 in Mice with Hyperlipidemia

Lu Meijuan，Wang Baohe，Xu Qiang，Zhuang Jianguo

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；Second Affiliated Hospital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China

Wang Baohe (Second Affiliated Hospital，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin，China)

Objective To observe the effect of Sanye tablets (SYT) on serum apolipoprotein A5 (ApoA5) in mice with hyperlipidemia.Methods The hyperlipidemia mice model were established by high fat diet.After giving SYT，enofibrate and Xuezhikang for 30 days，the serum ApoA5 level was detected by ELISA method.Results There was differences in the content of ApoA5 between model group and the normal control group，Xuezhikang group，fenofibrate group，SYT low dose group (P<0.05 or P<0.01).There was no difference in the content of ApoA5 between fenofibrate group and Xuezhikang group，SYT high dose group，SYT low dose group (P>0.05).There was no difference in the content of ApoA5 between SYT high dose group and SYT low dose group (P>0.05).Conclusion SYT has lipid-lowering effect，which is likely to be affected by ApoA5.The lipid lowering effect of SYT is not dose dependent.

hyperlipidemia；Sanye tablets；apolipoprotein A5；blood lipids；phlegm

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.8117634)；天津市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(No.2015117)

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津 300193)；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(天津 300150)

王保和，E-mail：lmj830127@163.com

信息：路美娟，王保和，徐強(qiáng)，等.三葉片對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂小鼠血清載脂蛋白A5的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(19)：2390-2392.

R589.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.19.007

1672-1349(2017)19-2390-03

2017-02-19)

(本文編輯 郭懷印)