結(jié)直腸癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12蛋白表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)侵襲的關(guān)系*

耿瑋，葉智斌，范亞男，梁巍，張夢(mèng)陽

（河北省人民醫(yī)院 普外五科，河北 石家莊 050051）

結(jié)直腸癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12蛋白表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)侵襲的關(guān)系*

耿瑋，葉智斌，范亞男，梁巍，張夢(mèng)陽

（河北省人民醫(yī)院 普外五科，河北 石家莊 050051）

目的觀察結(jié)直腸癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12（CCDC12）蛋白的表達(dá)情況，并探討CCDC12蛋白與腫瘤生長(zhǎng)侵襲的關(guān)系。方法免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)94例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12蛋白的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)與腫瘤生長(zhǎng)侵襲有關(guān)的蛋白質(zhì)Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)。記錄患者腫瘤生物學(xué)特征，分析CCDC12蛋白與結(jié)直腸癌生物學(xué)特征及Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白的關(guān)系。結(jié)果CCDC12、CyclinD1、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率均高于癌旁正常腸黏膜組織（χ2=38.480、30.312、38.368及 7.667，均P＜0.01），P21蛋白在兩種組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.862，P=0.353）。在結(jié)直腸癌組織中CCDC12蛋白陽性表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)（χ2=5.130、5.902、9.760 及 4.458，P=0.024、0.015、0.002 及 0.035）。Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CCDC12 與CyclinD1、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.302和0.365，P=0.003和0.001），CCDC12與P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.287，P=0.005）。結(jié)論結(jié)直腸癌中存在CCDC12蛋白表達(dá)增高現(xiàn)象，CCDC12可能通過與CyclinD1、P21及MMP-9蛋白的相互作用參與了結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲過程。

結(jié)直腸癌；卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12；腫瘤生長(zhǎng)；腫瘤侵襲

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率占惡性腫瘤第4位，死亡率居第5位[1]，雖然手術(shù)及藥物治療結(jié)直腸癌已取得了較大的進(jìn)展[2-3]，但由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿、無特異性癥狀，因此很難早期診斷，患者就診時(shí)多已處于進(jìn)展期。該病的整體治療效果還遠(yuǎn)不能令人滿意[4]。結(jié)直腸癌生長(zhǎng)迅速、具有較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，這是結(jié)直腸癌治療效果不佳的重要原因。結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲是多種基因異常表達(dá)的結(jié)果，探討其機(jī)制對(duì)結(jié)直腸癌的綜合診治意義重大。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil domain-containing，CCDC）基因家族有多個(gè)成員，研究發(fā)現(xiàn)一些CCDC基因與惡性腫瘤關(guān)系密切[5-7]，也有研究發(fā)現(xiàn)CCDC12與結(jié)直腸癌有關(guān)[8]。但有關(guān)結(jié)直腸癌組織中CCDC12表達(dá)及意義的相關(guān)報(bào)道極少。本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中CCDC12蛋白表達(dá)情況，為探討CCDC12蛋白與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲的關(guān)系提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月-2015年6月于河北省人民醫(yī)院外科手術(shù)的94例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁正常腸黏膜組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②患者有手術(shù)切除標(biāo)本確診為結(jié)直腸癌；③術(shù)前未接受過放療、化療及介入治療等措施；④患者為初診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤或有其他腫瘤病史的患者；②曾行手術(shù)治療的復(fù)發(fā)患者；③接受新輔助放化療或靶向治療的患者。男性61例，女性 33例；年齡 37～81歲，平均（53.52±8.95）歲?；颊呔炇鹬橥馕募?，本研究得到河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

CCDC12（購(gòu)自美國(guó) Aviva公司），CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1抗體（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（均購(gòu)自北京中杉生物公司），切片機(jī)（RM2255型）、組織細(xì)胞染色機(jī)（ST5020型）（購(gòu)自德國(guó)LEICA公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判斷

將石蠟包埋的組織在切片機(jī)上連續(xù)4 μm切片，然后進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)及阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，分別加入各一抗，浸泡、沖洗后加入二抗，37℃孵育30 min，最后進(jìn)行顯色、復(fù)染及封片。陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），陽性對(duì)照為各一抗提供的陽性對(duì)照。CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白均以在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為染色陽性。在鏡下（×400）隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用二次計(jì)分法將陽性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度的乘積作為讀片結(jié)果。乘積為0記為（-），1～2記為（+），3～4記為（++），＞4記為（+++）。（-）為陰性表達(dá)，其他均記為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，各蛋白在腫瘤組織與正常黏膜組織間的表達(dá)差異及腫瘤組織中各指標(biāo)表達(dá)與病理特征關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，腫瘤組織各指標(biāo)之間的相關(guān)性用Spearmann相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9 及 TIMP-1在結(jié)直腸癌腫瘤組織及癌旁正常腸黏膜組織中的表達(dá)情況

在結(jié)直腸癌組織中，CCDC12陽性表達(dá)率為75.53%、CyclinD1陽性率為61.70%、P21陽性率為37.23%、MMP-9陽性率為82.98%、TIMP-1陽性率為58.51%，癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12、Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1陽性率分別為19.15%、15.96%、31.91%、25.53%及34.04%。經(jīng)配對(duì) χ2檢驗(yàn)，CCDC12、CyclinD1、MMP-9 及 TIMP-1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率均高于癌旁正常腸黏膜組織（χ2=38.480、30.312、38.368 及 7.667，P=0.001、0.001、0.001及0.006），P21蛋白在兩種組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.862，P=0.353）。見表1和圖1。

2.2 CCDC12在結(jié)直腸癌組織表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織中CCDC12蛋白陽性率與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、神經(jīng)血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.163、1.973、1.057、4.458、2.729、0.146 及 0.132，P=0.141、0.160、0.788、0.099、0.703 及 0.716），CCDC12 蛋白陽性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.902、5.130、9.760及4.458，P=0.015、0.024、0.002 及 0.035）。見表 2。

表1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常腸黏膜組織中的表達(dá) （n=94，例）

圖1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) （×200）

2.3 CCDC12與CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，在結(jié)直腸癌組織中，CCDC12與CyclinD1、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.3022 和 0.3653，P=0.003 和 0.001），CCDC12 與 P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.2886，P=0.005）。

表2 CCDC12蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)發(fā)展及飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)生率不斷升高[9]，已成為最常見的消化道惡性腫瘤之一。該病無特異性癥狀，早期易于誤診漏診。結(jié)直腸癌具有生長(zhǎng)迅速、侵襲轉(zhuǎn)移快的特點(diǎn)，因而在就診時(shí)多數(shù)患者已處于進(jìn)展期，治療效果不理想。目前對(duì)結(jié)直腸癌的主要治療措施包括手術(shù)、放化療及部分靶向藥物的治療[4，10]，但總體治療效果尚待進(jìn)一步提高。因此，了解結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲機(jī)制有重要的臨床價(jià)值。結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲是多基因共同作用的結(jié)果，在該方面已有不少研究成果，但具體機(jī)制尚未完全闡明。

CCDC12基因是CCDC家族的成員之一，該家族有眾多成員，近年來研究發(fā)現(xiàn)該家族的多個(gè)成員與惡性腫瘤關(guān)系密切[5-7]。本研究顯示，在結(jié)直腸癌組織中CCDC12表達(dá)比正常腸黏膜增強(qiáng)，且CCDC12的陽性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，本研究結(jié)果提示CCDC12可能參與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲過程，具有導(dǎo)致結(jié)直腸癌進(jìn)展的作用。但CCDC12在腫瘤不同階段發(fā)揮的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

CyclinD1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一種重要蛋白，該蛋白可以使Rb蛋白磷酸化而失活，從而啟動(dòng)細(xì)胞周期。在腫瘤組織中CyclinD1表達(dá)異常，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)多種腫瘤的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中CyclinD1表達(dá)比正常腸黏膜增強(qiáng)，與LI等的研究結(jié)果符合[13]。P21蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能，其主要作用在于P21能抑制周期素依賴激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）復(fù)合物的活性，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制細(xì)胞分裂[14]。但本研究中P21蛋白在腫瘤與正常腸黏膜組織中表達(dá)無差異。筆者分析這可能是由于P21蛋白只在腫瘤的特定階段發(fā)揮作用，而正常組織中P21也保持一定的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)控作用，因而也有一定程度表達(dá)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）的重要成員之一，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，在腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移中有重要的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸癌腫瘤組織中具有高表達(dá)現(xiàn)象[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MMP-9在腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，且與腫瘤的浸潤(rùn)及分期有關(guān)，提示MMP-9在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。TIMP-1具有抑制MMP-9的功能，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用，研究表明TIMP-1在結(jié)直腸癌腫瘤組織的表達(dá)高于癌旁組織[16]，本研究也得到相似結(jié)果。筆者分析認(rèn)為在腫瘤中MMP-9表達(dá)增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致抑制劑TIMP-1表達(dá)也有所增強(qiáng)，因而腫瘤組織也出現(xiàn)TIMP-1高表達(dá)現(xiàn)象，但總的MMPs-TIMPs平衡破壞，導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中CCDC12與Cyclin D1及MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性，而與P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，說明CCDC12蛋白與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲有關(guān)，CCDC12可能通過上調(diào)CyclinD1、MMP-9，同時(shí)下調(diào)P21的表達(dá)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞周圍基質(zhì)降解，從而使結(jié)直腸癌易于侵襲轉(zhuǎn)移。但本研究結(jié)果僅為臨床結(jié)果的分析，具體調(diào)控關(guān)系是否存在還有待深入的研究進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CCDC12蛋白在結(jié)直腸癌組織中存在表達(dá)增高現(xiàn)象且與部分病理學(xué)特征相關(guān)，說明CCDC12蛋白可能參與腫瘤的生長(zhǎng)侵襲過程。CCDC12參與結(jié)直腸癌生長(zhǎng)侵襲的機(jī)制可能與CCDC12與 CyclinD1、MMP-9及 P21相互調(diào)控、共同作用有關(guān)，但具體情況還應(yīng)擴(kuò)大研究規(guī)模、并進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

[1]CHEN W,ZHENG R,ZENG H,et al.The incidence and mortality of major cancers in China,2012[J].Chin J Cancer,2016,35(8):73.

[2]DONG J,WANG W,YU K,et al.Outcomes of laparoscopic surgery for rectal cancer in elderly patients[J].Journal of B.u.on.Official Journal of the Balkan Union of Oncology,2016,21(1):80-86.

[3]JIN X,CHE D B,ZHANG Z H,et al.Ginseng consumption and risk of cancer:a meta-analysis[J].J Ginseng Res,2016,40(3):269-277.

[4]LIU J,ZHOU Q,XU J,et al.Detection of EGFR expression in patients with colorectal cancer and the therapeutic effect of cetuximab[J].J BUON,2016,21(1):95-100.

[5]GONG Y,QIU W,NING X,et al.CCDC34 is up-regulated in bladder cancer and regulates bladder cancer cell proliferation,apoptosis and migration[J].Oncotarget,2015,6(28):25856-25867.

[6]LIU Y,KHERADMAND F,DAVIS CF,et al.Focused analysis of exome sequencing data for rare germline mutations in familial and sporadic lung cancer[J].J Thorac Oncol,2016,11(1):52-61.

[7]YIN D T,XU J,LEI M,et al.Characterization of the novel tumor-suppressor gene CCDC67 in papillary thyroid carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(5):5830-5841.

[8]KE J,LOU J,ZHONG R,et al.Identification of a potential regulatory variant for colorectal cancer risk mapping to 3p21.31 in Chinese population[J].Sci Rep,2016(6):25194.

[9]BODE A M,DONG Z,WANG H.Cancer prevention and control:alarming challenges in China[J].Natl Sci Rev,2016,3(1):117-127.

[10]CHENG Y,SONG W.Efficacy ofFOLFOXIRI versus XELOXIRI plus bevacizumab in the treatment of metastatic colorectal cancer[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(10):18713-18720.

[11]GOPALAKRISHNAN N,SARAVANAKUMAR M,MADANKUMAR P,et al.Colocalization of beta-catenin with Notch intracellular domain in colon cancer:a possible role of Notch1 signaling in activation of CyclinD1-mediated cell proliferation[J].Mol Cell Biochem,2014,396(1/2):281-293.

[12]LIAO K,LI J,WANG Z.Dihydroartemisinin inhibits cell proliferation viaAKT/GSK3beta/cyclin D1 3beta/cycl n D1 pa apoptosis in A549 lung cancer cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(12):8684-8691.

[13]LI Q,DONG Q,WANG E.Rsf-1 is overexpressed in non-small cell lung cancers and regulates cyclinD1 expression and ERK activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,420(1):6-10.

[14]WANG S,CHEN Y,BAI Y.p21 participates in the regulation of anaplastic thyroid cancer cell proliferation by miR-146b[J].Oncol Lett,2016,12(3):2018-2022.

[15]JIN H,LI X J,PARK M H,et al.FOXM1-mediated downregulation of uPA and MMP9 by 3,3'-diindolylmethane inhibits migration and invasion of human colorectal cancer cells[J].Oncol Rep,2015,33(6):3171-3177.

[16]IONESCU C,BRAICU C,CHIOREAN R,et al.TIMP-1 expression in human colorectal cancer is associated with SMAD3 gene expression levels:a pilot study[J].J Gastrointestin Liver Dis,2014,23(4):413-418.

Effect of Coiled-coil domain-containing protein 12 on growth and invasion of colorectal cancer tissues*

Wei Geng,Zhi-bin Ye,Ya-nan Fan,Wei Liang,Meng-yang Zhang
(Department of Fifth General Surgery,Hebei General Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050051,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Coiled-coil domain-containing protein 12 (CCDC12)on growth and invasion of colorectal cancer.MethodsImmunohistochemistry (IHC)was used to detect expression of CCDC12 in 94 cases of colorectal cancer and associated adjacent healthy tissues.Growth and invasion related proteins including CyclinD1, P21, nD1, P 1, matrix metall 9 (MMP-9), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1)were also determined.Biological characteristics of cancer were recorded and correlated with concentrationsofCCDC12,CyclinD1,P21,MMP-9,TIMP-1 proteins.ResultsPositive expression rates of CCDC12,CyclinD1,MMP-9 and TIMP-1 in colorectal cancer tissues were significantly increased when compared with those in healthy tissues (χ2=38.480,30.312,38.368 and 7.667,respectively)(P＜ 0.01)while no significant difference was observed in concentration of P21 in the tissues (χ2=0.862,P=0.353).Intimate correlations of CCDC12 with characters of tumor such as differentiation,depth of invasion,lymphatic metastasis,and TNM stages(χ2=5.130,5.902,9.760 and 4.458;P=0.024,0.015,0.002 and 0.035,respectively)were observed.Spearman correlation analysisshowed thatthe expression ofCCDC12 was positively correlated with Cyclin D1 and MMP-9 (r=0.302 and 0.365,P=0.003 and 0.001,respectively)while negative correlation was found between CCDC12 and P21 (r=-0.287,P=0.005).ConclusionsCCDC12 is highly expressed in colorectal cancer,which affects Cyclin D1-,P21-and MMP-9-mediated growth and metastasis of colorectal cancer.

colorectal cancer;CCDC12 gene;tumor growth;tumor invasion

R735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.009

1005-8982（2017）24-0044-05

2017-01-10

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：162777218）

（王榮兵 編輯）