L－肉堿對NAFLD脂肪肝大鼠肝臟線粒體能量代謝及抗氧化能力的影響

彭麗娜，趙艷薇，彭麗研

（1.廊坊師范學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)教研室，河北廊坊065000；2.廊坊師范學(xué)院健美操教研室，河北廊坊 065000；3.北京北大方正軟件技術(shù)學(xué)院，河北廊坊065000）

1 引 言

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是因飲食不當(dāng)和結(jié)構(gòu)不合理而引起的一種代謝性綜合癥，進(jìn)一步發(fā)展為肝炎、肝硬化、肝癌等，嚴(yán)重危及患者生命。目前尚無特效藥物可以全面抑制NAFLD的發(fā)生。L－肉堿（Carnitine），一種從紅色肉類中提取，促使脂肪酸移向線粒體基質(zhì)內(nèi)而被氧化的關(guān)鍵物質(zhì)，具有減脂，防衰老，改善脂肪肝，促進(jìn)心腦血管等癥效果顯著［1－2］。研究表明，補(bǔ)充肉堿能促進(jìn)肝臟中甘油三酯的分解，減輕肝臟負(fù)擔(dān)［3］。本課題組前期研究成果表明，肉堿可以提高大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性，提高機(jī)體利用脂肪酸的速率［4］。根據(jù)現(xiàn)有對肉堿的研究成果，通過補(bǔ)充肉堿結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法，探討肉堿對脂肪肝大鼠機(jī)體能量代謝的影響，了解NAFLD的作用機(jī)制，同時(shí)為醫(yī)務(wù)工作者合理地利用訓(xùn)練手段結(jié)合營養(yǎng)補(bǔ)劑改善NAFLD的康復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

選取10月齡健康雄性wistar大鼠56只，體重在460±20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。NADH，antimycin A，rotenone，cytochrome C等為 sigma公司產(chǎn)品；Dodecyl－β－D－maltoside（DB），2、6－Dichlorophenolindophenol（DCPIP）為Fluka產(chǎn)品；蔗糖、Tris－Hcl、EDTA等試劑均為國產(chǎn)；GSH－Px、SOD、MDA（南京建成）。XT20719型動(dòng)物跑臺(tái)（北京），YQ－3型電動(dòng)勻漿機(jī)（江蘇），KS50R臺(tái)式高速高性能冷凍離心機(jī)（凱達(dá)），UV－1500紫外可見分光光度計(jì)（北京）。

2.2 方法

2.2.1 對象分組及造模 采用高脂飲食結(jié)合藥物注射復(fù)制脂肪肝模型，每天投高脂飼料，吃完不添加，自由飲水。并按 10 mg／100 g［5］劑量腹腔注射氧四環(huán)素（每1ml針劑含藥物20 mg），5天給藥1次。模型制備期間分別于第4、6周后隨機(jī)擇其處死，取肝臟組織鏡檢觀察成模情況，直至模型成功。淘汰模型不成功及死亡大鼠，保留48只模型大鼠參與試驗(yàn)。分4組：模型對照組（不運(yùn)動(dòng)，無肉堿，灌胃等量生理鹽水），肉堿組（不運(yùn)動(dòng)，服肉堿），運(yùn)訓(xùn)組（運(yùn)動(dòng)，無肉堿，灌胃等量生理鹽水），肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組（運(yùn)動(dòng)且服肉堿）。

2.2.2 訓(xùn)練方案及肉堿的補(bǔ)充 根據(jù)有氧運(yùn)動(dòng)模型［6－7］，運(yùn)訓(xùn)組和肉堿 ＋運(yùn)訓(xùn)組兩組動(dòng)物進(jìn)行6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練；每周5天，每天1次，速度12、14、16、18、20、25m／min，時(shí)間是20、25、30、35、40、50 min。肉堿組大鼠每天 500 mg／kg［8］的肉堿灌胃，肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組大鼠按照訓(xùn)練計(jì)劃，訓(xùn)練結(jié)束按劑量灌胃，最后一次運(yùn)動(dòng)至力竭，速度是 35 m／min［6］（除對照組），訓(xùn)練期間每周周末稱體重一次。

2.2.3 肝臟線粒體的提取 力竭后腹腔注射2℅戊巴比妥鈉麻醉，剖腹取肝，冰浴中剪碎，按體積比1∶5加入緩沖液勻漿，勻漿液在0～4℃下，離心（2000 rpm，15 min），棄沉淀，取上清；懸浮后再離心（2000 rpm，15 min），棄沉淀，取上清；兩次離心所得上清液混合，離心（12000 rpm，15 min），棄上清，取沉淀；再次（12000 rpm，15min）離心，所得沉淀物即為大鼠肝臟線粒體［9］。

2.2.4 肝臟線粒體呼吸鏈酶活性及抗氧化指標(biāo)的測定 將10μl線粒體蛋白加入到酶RCCI～I(xiàn)V反應(yīng)緩沖液 2 ml中，3 min內(nèi)連續(xù)測定 340、600、550 nm處NADH、FADH2、細(xì)胞色素C吸光值的變化表示肝臟線粒體呼吸鏈酶RCCI～I(xiàn)V的活性［10］。GSH－Px、SOD活性及MDA含量測定選自南京建成生物有限公司。在25℃室溫下，測定肝臟線粒體呼吸鏈酶活性，考馬斯亮藍(lán)G250測定蛋白量。

2.2.5 數(shù)理統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)采用 SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。組間采用t檢驗(yàn)，差異顯著采用單因素方差分析，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 L－肉堿對脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性的影響

與對照組比較，肉堿組大鼠肝臟線粒體呼吸鏈RCCI、RCCIII、RCCIV活性提高無顯著性差異（P＞0.05），RCCII活性提高出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；與對照組比，運(yùn)訓(xùn)組 RCCI、RCCIII活性提高出現(xiàn)顯著性和非常顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），RCCII、RCCVI活性提高出現(xiàn)非顯著性差異（P＞0.05）；與對照組比較，肉堿 ＋運(yùn)訓(xùn)組 RCCI、RCCII、RCCIII活性提高出現(xiàn)顯著差異和非常顯著差異（P＜0.05或P＜0.01），RCCIV活性提高無顯著性差異。與肉堿組比較，肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組RCCI、RCCIII活性出現(xiàn)顯著差異和非常顯著差異（P＜0.05或 P＜0.01），RCCII、RCCIV活性提高無顯著性差異（P＞0.05）。與運(yùn)訓(xùn)組比，肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組RCCI活性提高出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），RCCII、RCCIII、RCCIV活性提高無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

表1 L－肉堿對脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性的影響n＝12Table 1 Enzyme activities of liver m itochondrial respiratory chain with L－carnitine on fatty liver in rats（μmol／m in／mg.prot，±S，n＝12）

表1 L－肉堿對脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性的影響n＝12Table 1 Enzyme activities of liver m itochondrial respiratory chain with L－carnitine on fatty liver in rats（μmol／m in／mg.prot，±S，n＝12）

注：a與對照組比，P＜0.05，b與對照組比，P＜0.01；c與對照組比，P＜0.05，d與對照組比，P＜0.01。

.68分組 NADH－CoQ還原酶 FADH2－CoQ還原酶 CoQ－細(xì)胞色素C還原酶 細(xì)胞色素C±1.252 －－－ 122.936±20.425 －－－肉堿組 159.643±16.01814.99 －－－ 98.376±15.217a 27.68 －－－ 35.687±1.343 3.26 －－－ 137.981±11.11610.90 －－－運(yùn)訓(xùn)組 180.852±17.239a 24.97 －－－ 86.195±13.20617.46 －－－ 68.617±1.639b 49.69 －－－ 118.667±15.2433.47 －－－肉堿＋運(yùn)訓(xùn) 233.225±24.356bc 41.8131.5522.46103.438±16.642a 31.224.8916.6772.956±2.023bd 52.6851.085.95145.919±23.03515.755.4418氧化酶對照組 135.702±13.144 －－－ 71.142±12.174 －－－ 34.523

3.2 L－肉堿對脂肪肝大鼠肝臟線粒體抗氧化能力的影響

與對照組比，肉堿組、肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組大鼠肝臟線粒體GSH－Px活性提高出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；運(yùn)訓(xùn)組提高無顯著差異（P＞0.05）；與對照組比，肉堿組、運(yùn)訓(xùn)組、肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組SOD活性提高出現(xiàn)顯著和非常顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）；肉堿組、運(yùn)訓(xùn)組、肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組大鼠肝臟線粒體MDA含量較對照組下降出現(xiàn)顯著和非顯著差異（P＞0.05或P＜0.05）。與肉堿組和運(yùn)訓(xùn)組比，肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組GSH－Px、SOD活性提高、MDA含量下降出現(xiàn)顯著性和非顯著性差異（P＞0.05或P＜0.05）。見表2。

表2 L－肉堿對脂肪肝大鼠肝臟線粒體抗氧化能力的影響Table 2 Effect of on fatty liver rat liver m itochondrial antioxidant capacity w ith L－carnitine（U per mg protein，±S，n＝12）

表2 L－肉堿對脂肪肝大鼠肝臟線粒體抗氧化能力的影響Table 2 Effect of on fatty liver rat liver m itochondrial antioxidant capacity w ith L－carnitine（U per mg protein，±S，n＝12）

注：a與對照組比，P＜0.05，b與對照組比，P＜0.01；c與對照組比，P＜0.05，d與對照組比，P＜0.01。

分組 GSH－Px活性 活性% SOD活性 活性% MDA含量 含量（%）53.24±8.25 －－－ 21.31±7.52 －－－ 15.25±.57 －－－肉堿組 74.57±11.65a 28.60 －－－ 33.88±8.13a 37.10 －－－ 12.53±3.15 17.84 －－－運(yùn)訓(xùn)組 61.85±10.67 13.92 －－－ 42.90±10.17b 50.33 －－－ 11.81±2.19 22.56 －－－運(yùn)動(dòng)＋肉堿 86.24±15.65a 38.2713.5328.2855.13±14.90bc 61.3538.5522.18 9.94±1.23a對照組34.8220.6715.83

4 討論

4.1 L－肉堿對NAFLD脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性的影響

NAFLD的形成與線粒體TCA的關(guān)鍵酶，線粒體呼吸鏈傳遞酶和丙酮酸脫氫酶等活性下降，氧化磷酸化功能受阻及游離脂肪酸進(jìn)入線粒體釋放能量受限等因素有關(guān)［11－12］。實(shí)驗(yàn)顯示，力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肝臟功能下降，嚴(yán)重?fù)p壞細(xì)胞呼吸功能［4］；而科學(xué)規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可改善大鼠心肌線粒體RCCI－RCCIV活性，降低 NAFLD患者血漿 SREBP－1c、RBP4、TNF－α水平，改善脂代謝紊亂，降低肝臟甘油三酯水平，有利于 NAFLD轉(zhuǎn)歸［13－14］。也有研究發(fā)現(xiàn)，肉堿可以降低脂肪肝患者血脂及肝臟中膽固醇含量，改善肝功能［15－16］。肉堿能夠保護(hù)線粒體膜結(jié)構(gòu)及電子傳遞鏈的完整性，提高大鼠肝臟線粒體電子傳遞鏈酶活性早已通過實(shí)驗(yàn)證明［4］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)充肉堿、運(yùn)動(dòng)、補(bǔ)充肉堿結(jié)合運(yùn)動(dòng)均可提高脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸功能，出現(xiàn)肉堿＋運(yùn)訓(xùn)組＞肉堿和運(yùn)訓(xùn)組。顯示，補(bǔ)充肉堿結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法在改善脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈功能效果更佳。其機(jī)制一方面是由于有氧運(yùn)動(dòng)促使大量游離脂肪酸進(jìn)入肝臟線粒體進(jìn)行β－氧化，減少肝臟脂肪堆積而產(chǎn)生的毒性作用，也不同程度的提高了線粒體電子傳遞鏈酶活性，提高線粒體ATP的合成能力［17］。另一方面，通過體外補(bǔ)充肉堿，加大肉堿的儲(chǔ)備量，增加長鏈脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，降低肝臟TG的合成，加速VLDL合成，改善胰島素抵抗，抑制肝細(xì)胞色素P4502E1的活性表達(dá)，緩解肝臟內(nèi)脂肪堆積和代謝紊亂，減輕由于細(xì)胞色素氧化酶缺失和能量代謝失調(diào)而造成的脂肪肝，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，提高肝臟功能［18］；總之，補(bǔ)充肉堿結(jié)合運(yùn)動(dòng)療法可以通過提高線粒體呼吸鏈酶活性及能量代謝的速率來改善脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈功能，改善NAFLD癥狀。

4.2 L－肉堿對NAFLD脂肪肝大鼠肝臟線粒體抗氧化能力的影響

研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以提高大鼠肝臟等線粒體GSH－Px、SOD活性，降低MDA含量；降低因高脂膳食而造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除氧自由基，減輕脂肪肝［19］。研究顯示，運(yùn)動(dòng)結(jié)合肉堿在改善NAFLD患者的膽固醇代謝中比單純補(bǔ)充肉堿效果更加明顯［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，適量的有氧運(yùn)動(dòng)、補(bǔ)充肉堿、運(yùn)動(dòng)結(jié)合補(bǔ)充肉堿均可以提高脂肪肝大鼠肝臟線粒體GSH－Px、SOD活性和降低MDA含量。其機(jī)制一方面是由于大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)后肝臟中FFA增多，喪失線粒體跨膜電位，導(dǎo)致線粒體腫脹、破裂及壞死［21］；同時(shí)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)體內(nèi) ROS、MDA的過量生成，造成肝臟膜結(jié)構(gòu)破壞，線粒體DNA改變，肝免疫力下降使肝出現(xiàn)纖維化，進(jìn)一步加重NAFLD；而有氧運(yùn)動(dòng)可以降低肝內(nèi)脂肪貯存，改善NAFLD癥狀［22］。另一方面，補(bǔ)充肉堿可以提高肝臟線粒體GSH－Px、SOD活性，減少肝臟受自由基的損傷，降低甘油三脂、總膽固醇、低密度脂蛋白和提高高密度脂蛋白的含量，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)和再生，達(dá)到預(yù)防與防止NAFLD的不良反應(yīng)［23］。

總之，補(bǔ)充肉堿結(jié)合運(yùn)動(dòng)可以提高脂肪肝大鼠肝臟線粒體呼吸鏈酶活性，提高機(jī)體的抗氧化能力和抵抗自由基的能力。但是，NAFLD的發(fā)生還與遺傳、基因、年齡、環(huán)境、缺氧、吸煙、免疫、營養(yǎng)、藥物、激素、鐵超載、微量元素缺乏、體力活動(dòng)不足及冠心病、高血壓、高血脂、2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性綜合征密切相關(guān)［24］，更應(yīng)慎重綜合多方面因素考慮，以達(dá)到最佳的康復(fù)療法來減輕NAFLD患者的痛苦。