建澤瀉鯊烯合酶原核表達(dá)、功能驗(yàn)證及其免疫檢測研究

劉青芝+谷巍+吳啟南+巢建國+桑曉華+劉琪+王小浩

[摘要] 澤瀉鯊烯合酶 （AoSS） 催化法呢基焦磷酸[（farnesyl diphosphate， FPP）]合成鯊烯，是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。為深入研究AoSS基因的功能及表達(dá)，課題組將前期克隆獲得的建澤瀉鯊烯合酶基因（accession No. JX866770） 的開放閱讀框（ORF）構(gòu)建到原核表達(dá)載體 pCzn1上，并在大腸桿菌BL21（Roseta）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)出的融合蛋白主要以包涵體的形式存在，經(jīng)純化獲得高純度的目的蛋白；以此目的蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng)驗(yàn)證其功能，其結(jié)果顯示該目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鯊烯的活性；為進(jìn)一步研究其表達(dá)規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，利用該蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體并純化，ELISA檢測抗體效價(jià)大于1∶51 200，Western blotting 檢測表明其具有較好的特異性；用制備得到的抗體免疫檢測建澤瀉AoSS在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示建澤瀉塊莖中AoSS表達(dá)最高，其次為葉，根中表達(dá)甚微。原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建、基因功能的進(jìn)一步驗(yàn)證及快速免疫檢測方法的建立，為進(jìn)一步開展AoSS基因功能及其調(diào)控的研究奠定基礎(chǔ)，為澤瀉資源性成分原萜烷型三萜的合成生物學(xué)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 建澤瀉； 鯊烯合酶； 原核表達(dá)； 功能驗(yàn)證； 免疫檢測

[Abstract] Squalene synthase of Alisma orientale catalyzes farnesyl diphosphate （FPP） to form squalene， which is the key regulatory enzyme of the carbon source flow to protostane triterpenes biosynthesis. For further research on the function and expression of AoSS gene， the open reading frame （ORF） of squalene synthase gene （accession no. JX866770） from A. orientale was subcloned into a prokaryotic expression vector pCzn1 and induced the expression of AoSS gene in Escherichia coli BL21（Roseta）. The fusion protein was mainly in the form of inclusion bodies and purified to obtain high purity protein. By verifying its functionality through vitro enzymatic reaction， the results showed that the catalytic protein had the catalytic activity of FPP into squalene. In order to research the expression of AoSS in A. orientale， the purified protein was used to immunized rabbits to prepare polyclonal antibody which was then purified， the titer of the antibody was greater than 1∶51 200 by ELISA detection， and displayed good specificity by Western blotting. The prepared antibody was used for immunoassay of AoSS in different organs of A. orientale， and the results showed that the AoSS expression level was the highest in tubers， followed by leaves， and lowest in root. Successful construction of prokaryotic expression vector， validation of gene functions and establishment of rapid immunoassay lay the foundation for further researches on the function and regulation of AoSS gene， and also provide scientific basis on the application of the protostane triterpenes of A. orientale in the field of synthetic biology.

[Key words] Alisma orientale； squalene synthase； prokaryotic expression； functional identification； immunoassay

澤瀉Alismatis Rhizoma為澤瀉科植物東方澤瀉Alisma orientale的干燥塊莖，具有利水、滲濕、泄熱之功效，道地產(chǎn)區(qū)為福建^[1-2]。澤瀉的主要藥效成分為原萜烷型（protostane）四環(huán)三萜類^[2-3]，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，C-10位和C-14位上有β-CH3，C-8上有α-CH3，C-20為S構(gòu)型，該類成分具有抗高血脂、降血壓、抗HIV1、抗癌等顯著活性^[4-7]。近期的研究表明，原萜烷型三萜能促進(jìn)肝再生和防止ANIT誘導(dǎo)的肝毒性和膽汁淤積^[5-8]，但該類成分在植物體中含量低，分布窄，僅存在于澤瀉屬等少數(shù)植物類群中^[9-11]，限制了其進(jìn)一步開發(fā)利用。生物工程是提高活性成分含量的有效途徑之一，而活性物質(zhì)的生物合成效率與其合成途徑中的關(guān)鍵酶密切相關(guān)。endprint

植物體內(nèi)三萜類化合物的生物合成主要通過甲羥戊酸（mevalonic acid pathway，MVA） 途徑^[12]，鯊烯合酶（squalene synthase，SS） 能夠催化2分子的法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP） 生成1分子的鯊烯，是碳源流向三萜類化合物合成路徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶^[13-14]。目前，SS基因從雷公藤Tripterygium wilfordii^[13]、甘草Glycyrrhiza uralensis^[14]、人參Panax ginseng^[15]、睡茄Withania somnifera^[16]、厚樸Magnolia officinalis^[17]等藥用植物中已克隆獲得。研究發(fā)現(xiàn)，通過誘導(dǎo)睡茄鯊烯合酶的表達(dá)，能夠提高植物甾醇的含量^[18]；而通過抑制人參鯊烯合酶的表達(dá)，可使三萜皂苷的生成量降低^[19]。鯊烯合酶作為三萜類成分生物合成途徑的關(guān)鍵酶，在合成途徑中發(fā)揮重要的作用，而有關(guān)建澤瀉三萜類成分生物合成鯊烯合酶的研究除本課題組前期工作外未見報(bào)道^[20]。

課題組前期已克隆獲得建澤瀉鯊烯合酶基因全長AoSS（accession No. JX866770）^[20]，其功能以及在植物體內(nèi)的表達(dá)有待進(jìn)一步驗(yàn)證與研究。目的蛋白的獲取是研究其功能的前提，而制備高效價(jià)的抗體是研究蛋白基因表達(dá)的重要工具。本研究通過原核表達(dá)獲得目的蛋白，利用體外酶促反應(yīng)驗(yàn)證其功能，并運(yùn)用獲得的純化蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，建立快速免疫檢測方法，分析AoSS在建澤瀉中不同組織的表達(dá)，為研究AoSS的功能及參與的蛋白翻譯調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為該類資源性成分生物合成途徑的闡明提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品 實(shí)驗(yàn)用材料采自福建建甌，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院谷巍教授鑒定為澤瀉科植物東方澤瀉A. orientale。取建澤瀉的葉、塊莖、根分裝于凍存管中，在液氮中保存?zhèn)溆?。原核表達(dá)載體pCzn1購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)化菌株Escherichia coli DH5α、表達(dá)宿主細(xì)胞BL21（Roseta）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、羊抗兔IgG （HRP標(biāo)記） 購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、異丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、蛋白酶抑制劑（bacteria protease inhibitor cocktail）、FPP購自Sigma公司；Ni2+IDA親和色譜膠購自Novagen公司；0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Millipore公司，其他試劑均為分析純；引物合成及測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) （Beckman）、Biologic LP層析系統(tǒng)（Bio-Rad）、小型垂直電泳槽Mini-PROTEAN Tetra System （Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、PTC-200基因擴(kuò)增儀（MJ Research）、Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量儀（Thermo）、氣質(zhì)聯(lián)用儀Agilent7890B-7000C（DB-5MS，0.25 μm×0.25 mm×30 m，Agilent）。

2 方法

2.1 原核表達(dá)載體pCzn1-SS的構(gòu)建 根據(jù)提交到NCBI上的建澤瀉AoSS基因全長cDNA序列 （accession No. JX866770），找出其完整的ORF序列設(shè)計(jì)并合成引物，上游引物5′-ATGGAGCTCGACCCGCACC-3′（下劃線為SacI酶切位點(diǎn)），下游引物5′-TAATCTAGATAGGTAATCTC-3′（下劃線為XbaI酶切位點(diǎn)）。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR緩沖液5.0 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 4.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 4.0 μL，10 nmol·L-1上下游引物各1.0 μL，cDNA模板5.0 μL，5 U rTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 29.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，切膠回收PCR目的片段，用SacI和XbaI進(jìn)行雙酶切后，連接到表達(dá)載體pCzn1上，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，酶切和測序鑒定陽性克隆。

2.2 AoSS基因的原核表達(dá) 將測序正確的重組質(zhì)粒pCzn1-SS轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21（Roseta）中，篩選出陽性克隆，挑取陽性克隆接入含有50 mg·L-1 Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，按1∶100將過夜菌轉(zhuǎn)接至100 ml 含50 mg·L-1 Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時(shí)，取出 1 mL留作誘導(dǎo)前的對照，向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為 0.5 mmol·L-1，11 ℃ 220 r·min-1誘導(dǎo)12 h，離心收集菌體。分別取誘導(dǎo)前菌液，誘導(dǎo)后菌液，誘導(dǎo)后菌液的上清及沉淀作為樣品，進(jìn)行 10% SDS-PAGE 電泳分析。

2.3 重組蛋白的純化與復(fù)性 將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌液低溫離心10 min，菌體沉淀重懸與20 mL裂解緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl，含1 mmol·L-1 PMSF、bacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0）超聲破碎20 min，破碎液12 000 r·min-1 4 ℃離心 20 min，收集沉淀，使用包涵體洗滌液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1 EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體3次，用包涵體溶解液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1 DTT，8 mol·L-1尿素 pH 8.0） 按一定比例溶解包涵體，4 ℃放置過夜后，15 000 r·min-1離心15 min，將包涵體溶解液滴加到20 mmol·L-1 Tris，pH 8.0 緩沖液逐步成倍梯度稀釋，緩慢攪拌，至尿素濃度達(dá)到0.5 mol·L-1時(shí)，將蛋白溶液裝入透析袋，于4 ℃ 在20 mmol·L-1 PBS，pH 7.4中透析過夜；進(jìn)行10% SDS-PAGE 分析。endprint

2.4 原核表達(dá)蛋白體外酶促反應(yīng) 酶促反應(yīng)體系^[21]：總體系為200 μL，5 mmol·L-1 FPP，50 mmol·L-1 MgCl2，25 μmol·L-1巰基乙醇，25 μmol·L-1 NADPH，0.8 g·L-1AoSS蛋白純化產(chǎn)物，pH 7.2 磷酸緩沖液補(bǔ)足，上覆400 μL正己烷，在35 ℃反應(yīng)2 h，充分渦懸振蕩后1萬 r·min-1離心，取攜帶空載體菌液提取的蛋白代替AoSS蛋白，其他組分不變，作為對照組，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對催化產(chǎn)物進(jìn)行檢測。GC-MS條件：電離方式EI，電子能量70 eV，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度260 ℃，120 ℃ 3 min，以15 ℃·min-1升至180 ℃，再以25 ℃·min-1升至260 ℃，保持25 min。

2.5 多克隆抗體制備及純化 將純化蛋白免疫新西蘭白兔（2～2.5 kg），皮下免疫400 μg/次，2～3周免疫1次，免疫4次。采血檢測，通過間接ELISA方法確定抗血清針對蛋白的效價(jià)，待效價(jià)大于1∶5萬 進(jìn)行最終采血制備抗血清，并準(zhǔn)備純化。將蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化色譜柱，將所得抗血清與PBS等量混合后緩慢上樣，待抗原抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，得到所需純化抗體，立即在PBS中進(jìn)行4 ℃透析過夜，隔日進(jìn)行濃度、純度及效價(jià)測定。

2.6 多克隆抗體濃度、純度及效價(jià)測定 采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對所得抗體進(jìn)行濃度測定；通過SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察純化抗體的純度；采用間接ELISA檢測抗體效價(jià)：用包被液（0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）將AoSS稀釋至5 mg·L-1，每孔加入100 μL，置于4 ℃中包被過夜。次日每孔加入100 μL 5%的脫脂奶粉，37 ℃孵育1 h，PBST（pH 7.4）洗滌3次；加100 μL倍比稀釋的兔抗血清，以陰性血清作為對照，37 ℃孵育1 h，同上洗滌3次。加100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，同上洗滌3次。加底物 TMB室溫顯色20 min，終止反應(yīng)后，于450 nm處讀取吸光度（A）。

2.7 Western blotting 測定抗體特異性 將純化的AoSS蛋白和未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，以純化的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，進(jìn)行蛋白Western blotting分析，洗膜增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）進(jìn)行顯影。

2.8 多克隆抗體在建澤瀉組織中的免疫檢測 分別取建澤瀉的塊莖、葉及根各200 mg，剪碎加入適量裂解液（使用前加PMSF），勻漿器勻漿，充分裂解，以制備的多克隆抗體為一抗，β-actin 蛋白作為內(nèi)參照，取上清進(jìn)行Western blotting，Image J軟件進(jìn)行灰度定量分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 利用PCR的方法，將建澤瀉鯊烯合酶基因（accession No. JX866770）的ORF插入到原核表達(dá)載體pCzn1的SacI和XbaI酶切位點(diǎn)之間，獲得了N端攜帶有HIS6表達(dá)標(biāo)簽的重組表達(dá)載體pCzn1-SS （圖1A），提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，獲得了1條1 500 bp大小的DNA 片段和1條約5 000 bp的載體片段（圖1B），與預(yù)期大小一致；測序結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體pCzn1-SS插入的序列與本課題組克隆的澤瀉AoSS基因的ORF序列完全一致，此結(jié)果表明，獲得了正確的重組原核表達(dá)載體pCzn1-SS。

3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCzn1-SS轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（Roseta）中，經(jīng)過0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)，將IPTG 誘導(dǎo)后的菌體超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，在46 kDa處出現(xiàn)1條預(yù)期大小的特異性條帶，與預(yù)測的蛋白分子量相吻合，表明已表達(dá)出融合蛋白AoSS，且蛋白存在于沉淀中，為包涵體蛋白（圖2A）。

3.3 重組蛋白的純化及復(fù)性 超聲破碎表達(dá)菌后離心收集包涵體，用包涵體洗滌液洗滌除去雜質(zhì)，然后采用8 mol·L-1尿素使包涵體變性溶解，逐步成倍梯度稀釋尿素濃度使其蛋白復(fù)性，SDS-PAGE檢測獲得單一目的條帶，結(jié)果表明獲得純度較高的鯊烯合酶重組蛋白（圖2B）。

3.4 蛋白酶促反應(yīng)產(chǎn)物分析 取純化的鯊烯合酶重組蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，催化產(chǎn)物經(jīng)正己烷萃取后用GC-MS分析，結(jié)果顯示催化的產(chǎn)物單一，樣品的保留時(shí)間（RT）在18.901存在特征峰，而對照中并未檢測到相應(yīng)的特征峰，根據(jù)GC-MS聯(lián)用儀所得質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照分析^[17，21]，由此確定該催化產(chǎn)物為鯊烯（圖3）。此結(jié)果表明，經(jīng)RACE方法克隆的全長cDNA編碼的建澤瀉鯊烯合酶具有催化FPP生成鯊烯的活性。

3.5 多克隆抗體濃度、純度及效價(jià)測定 利用純化的蛋白免疫新西蘭兔，制備AoSS多克隆抗體并純化，測得抗體濃度為0.22 g·L-1，其純度在 95%以上（圖4A）。以純化的融合蛋白為包被抗原，抗血清以500～512 000倍數(shù)稀釋，按酶標(biāo)儀檢測的A450大于陰性對照A450的2.1倍時(shí)，則判為陽性，其結(jié)果顯示抗體效價(jià)在1∶512 000以上。

3.6 Western blotting 測定抗體特異性 采用Western blotting對純化的多克隆抗體進(jìn)行特異性檢測，檢測結(jié)果顯示制備的抗體可特異識別目標(biāo)抗原，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌表達(dá)的蛋白未見信號（圖4B），表明制備的AoSS多克隆抗體特異性好。

3.7 建澤瀉組織中AoSS蛋白的免疫檢測 采用制備的抗體對建澤瀉不同組織中的AoSS蛋白進(jìn)行檢測。AoSS在塊莖和葉中均有表達(dá)（圖5A），而根中表達(dá)甚微。塊莖、葉通過Western blotting 檢測和ImageJ軟件灰度定量分析，建澤瀉塊莖中AoSS蛋白表達(dá)量高于葉（圖5B）。endprint

4 討論

鯊烯合酶為三萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，競爭利用 FPP 合成三萜，其含量和活性決定了下游產(chǎn)物的含量，SS基因的過量表達(dá)可促進(jìn)三萜類化合物合成^[17，22]。本研究在前期克隆獲得AoSS全長的基礎(chǔ)上，開展建澤瀉鯊烯合酶原核表達(dá)、功能驗(yàn)證及其免疫檢測研究，為進(jìn)一步開展AoSS基因功能及其調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

構(gòu)建原核表達(dá)載體，將目的蛋白在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)。但由于原核生物缺乏蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾的過程，使蛋白無法折疊或形成正確的二硫鍵，常以包涵體的形式存在于細(xì)胞中^[23]。包涵體因立體結(jié)構(gòu)存在錯(cuò)誤，沒有生物活性，包涵體的復(fù)性是獲取有活性蛋白的關(guān)鍵步驟，包涵體的復(fù)性條件對其構(gòu)象和活性有著重要的影響^[24]。因此，本研究將充分洗滌的包涵體溶解于8 mol·L-1的尿素，逐步成倍梯度稀釋降低尿素濃度，有助于減少蛋白復(fù)性過程中產(chǎn)生的沉淀，確保包涵體能夠形成正確的二硫鍵，進(jìn)行特定空間結(jié)構(gòu)的折疊，最終獲得可溶性且具有生物活性的AoSS蛋白。AoSS目的蛋白的獲得為其功能鑒定提供底物，同時(shí)也為多克隆抗體的制備提供材料基礎(chǔ)。

體外表達(dá)蛋白催化活性分析是基因功能研究的重要手段^[25]，本研究對得到的蛋白，采用體外酶促反應(yīng)驗(yàn)證其功能，GC-MS結(jié)果顯示該蛋白具有催化FPP生成鯊烯的活性。本研究首次證明了建澤瀉鯊烯合酶基因的功能，為揭示澤瀉三萜形成的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，為全面解析三萜生物合成的機(jī)制提供依據(jù)。

從翻譯水平探討澤瀉原萜烷型三萜類化合物與AoSS表達(dá)的關(guān)系，免疫學(xué)技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達(dá)水平的有效方法，因其快速、簡便、特異性高、不依賴酶活性、易于標(biāo)記等特點(diǎn)，得到較為廣泛的應(yīng)用^[26]。本研究利用純化的AoSS蛋白免疫新西蘭兔，制備獲得多克隆抗體，ELISA及Western blotting 結(jié)果顯示其抗體具有較高的效價(jià)及良好的特異性，建立快速免疫檢測方法，對建澤瀉不同組織中的AoSS蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其在塊莖中表達(dá)量最高，其次是葉，根中表達(dá)甚微。澤瀉塊莖不僅是原萜烷型三萜成分形成的主要器官，也是貯藏器官^[11]，較高的表達(dá)量可能與原萜烷型三萜合成部位有關(guān)，推測澤瀉原萜烷型三萜生物合成的主要器官為塊莖。本研究為澤瀉原萜烷型三萜生物合成途徑闡明及其調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，為該類資源性成分的合成生物學(xué)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]endprint