加味五子衍宗丸神經(jīng)保護(hù)作用靶點(diǎn)群的鑒定與功能分析

曾克武+萬(wàn)彥軍+廖理曦+姜昆+王學(xué)美+劉蓮英+屠鵬飛

[摘要] 中藥復(fù)雜體系的作用靶點(diǎn)群鑒定是中藥藥理機(jī)制研究的關(guān)鍵。該研究構(gòu)建了一種表面鍵合有光敏二苯甲酮基團(tuán)的磁性微球，利用紫外光激發(fā)下二苯甲酮基團(tuán)活化并與中藥化學(xué)成分中的碳?xì)滏I發(fā)生共價(jià)鍵合的特性，將中藥加味五子衍宗丸的化學(xué)成分組鍵合到磁性微球表面，并與神經(jīng)細(xì)胞裂解液共孵育，進(jìn)而富集加味五子衍宗丸對(duì)應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)靶點(diǎn)群。針對(duì)靶點(diǎn)群進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共發(fā)現(xiàn)32個(gè)潛在結(jié)合靶點(diǎn)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要與Hippo和Cell cycle信號(hào)通路關(guān)系密切，提示加味五子衍宗丸可能參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化。該研究從靶點(diǎn)源頭上解釋了加味五子衍宗丸發(fā)揮抗癡呆和神經(jīng)保護(hù)作用的潛在藥理機(jī)制，進(jìn)而也提供了一種用于解析中藥復(fù)雜成分體系作用靶點(diǎn)群的研究方法，可為今后中藥方劑藥理機(jī)制的科學(xué)詮釋提供重要的方法學(xué)借鑒與參考。

[關(guān)鍵詞] 靶點(diǎn)鑒定； 加味五子衍宗丸； 神經(jīng)保護(hù)； 靶點(diǎn)群； 作用機(jī)制

[Abstract] Targets group identification in complex Chinese medicine system is a key step for revealing the potential mechanism of Chinese medicine. The solid beads with magnetic core and benzophenone-modified surface were made in our study， and then benzophenone was activated and cross-linked with the C-H bonds of chemical compositions in Chinese medicines under UV excitation. Thus the chemical compositions of modified Wuzi Yanzong pill（MWP） were linked to the solid bead surface， and enriched the neuroprotective targets group of MWP after being co-incubated with nerve cell lysate. We performed proteomics analysis on these targets and discovereda total of 32 potential binding targets. KEGG analysis revealed that these targets were mainly associated with Hippo and Cell cycle signaling pathways， suggesting that MWP might be involved in regulating the proliferation and differentiation of neural stem cells. Our findings elucidate the potential targets and mechanism of MWP on anti-dementia and neuroprotection， and further providean approach for investigating the targets group in complex Chinese medicine system. This novel method may provide methodological references for exploring the pharmacological mechanism of Chinese medicinal formulae in the future.

[Key words] target identification； modified Wuzi Yanzong pill； neuroprotection； targets group； mechanism

靶點(diǎn)是藥物分子發(fā)揮疾病治療作用的關(guān)鍵生物學(xué)基礎(chǔ)，因此藥物靶點(diǎn)的闡明對(duì)于揭示藥物作用機(jī)制至關(guān)重要。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，尋找合適方法探究中藥復(fù)雜體系的作用靶點(diǎn)群，不僅有利于理解中藥的獨(dú)特作用機(jī)制，而且還可從中找到一些全新的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而為今后基于靶點(diǎn)的創(chuàng)新藥物設(shè)計(jì)提供重要技術(shù)參考^[1-2]。

加味五子衍宗丸是在古方五子衍宗丸的基礎(chǔ)上加味淫羊藿而成的中藥方劑，主要包含菟絲子、枸杞子、五味子、覆盆子、車前子和淫羊藿，在臨床上對(duì)治療老年癡呆以及早期輕度認(rèn)知障礙有確切療效^[3-4]。但是其成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)繁多，對(duì)其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制一直未能進(jìn)行深入闡明。本研究試圖制備一種表面修飾有光敏二苯甲酮基團(tuán)的磁性微球，通過(guò)光活化反應(yīng)將加味五子衍宗丸的化學(xué)成分組鍵合到微球表面，進(jìn)而與神經(jīng)細(xì)胞裂解液混合孵育，富集相應(yīng)的靶點(diǎn)群并進(jìn)行高分辨質(zhì)譜鑒定。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)群中每個(gè)靶點(diǎn)的生物學(xué)功能解析，闡釋了加味五子衍宗丸神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。本研究不僅為加味五子衍宗丸的抗癡呆藥理機(jī)制研究提供了一種全新的研究思路，而且對(duì)今后其他同類中藥或復(fù)雜方劑體系的作用機(jī)制研究也具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 藥材 加味五子衍宗丸各單味藥材：枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車前子、淫羊藿購(gòu)自北京同仁堂有限責(zé)任公司。各藥材按質(zhì)量比8∶8∶4∶1∶2∶8混合，并用10倍量超純水煮沸提取2次，每次提取時(shí)間為1 h。將提取液混合后低溫冷凍干燥成粉末，備用。

1.2 試劑 SHSY5Y神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Macgene公司，胎牛血清購(gòu)自PAN Biotech公司。endprint

1.3 儀器 冷凍干燥機(jī)（FDU-1100，Eyela，日本）；微量紫外分光光度計(jì)（ND-1000，NanoDrop公司，美國(guó)）；Sunrise-Basic酶標(biāo)儀（TECAN公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 SHSY5Y神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 U·L-1青霉素，100 μg·L-1鏈霉素）進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2 d傳代1次。收集1×107左右的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液（Tris，pH 7.4，150 mmol·L-1 NaCl，1% NP-40，cocktail蛋白酶抑制劑）后，冰浴30 min，然后在4 ℃下12 000 r·min-1離心20 min，取上清液并保存。

1.5 磁性光敏微球的制備 采用共沉淀法制備Fe3O4納米粒子：將FeSO4·7H2O（0.35 g），F(xiàn)eCl3·6H2O（0.32 g），HS-PEG1k-SH（0.1 g，按文獻(xiàn)方法自制^[5]）及30 mL去離子水加入100 mL三口燒瓶中；攪拌、通N2，溫度升至70 ℃；30 min后，迅速加入4 mL的NH3·H2O（25%），繼續(xù)反應(yīng)2 h；用磁鐵分離所得Fe3O4納米粒子（Fe3O4-PEG1k-SH NPs），分別用去離子水、甲醇洗滌至少3次，然后分散于少量甲醇中備用。

在100 mL三口燒瓶中加入Fe3O4-PEG1k-SH NPs（0.05 g），丙烯酰氧基二苯甲酮（ABP，0.01 g，按文獻(xiàn)方法自制^[6]），三乙胺（TEA，30 μL）和20 mL丙酮，通N2、室溫、攪拌反應(yīng)3 h，所得磁性粒子（Fe3O4-PEG1k-BP NPs）分別用丙酮、甲醇洗滌至少3次，然后分散于少量甲醇中備用。

1.6 磁性微球表面鍵合中藥化學(xué)成分 在一帶磨口、平面石英蓋的直管光照反應(yīng)瓶中，加入Fe3O4-PEG1k-BP NPs（0.01 g），加味五子衍宗丸（0.01g）及20 mL去離子水，通N2 30 min后置于UV光下（375 W汞燈，光強(qiáng)12.5 W·m-2，λ=254 nm）反應(yīng)1 h，用磁鐵分離所得磁性粒子，并用去離子水洗滌至少3次。然后采用紅外光譜法比較微球在鍵合加味五子衍宗丸前后光譜變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用微球表面BP光敏基團(tuán)鍵合加味五子衍宗丸后，3 440 cm-1處羥基吸收峰變的尖銳，說(shuō)明鍵合加味五子衍宗丸化學(xué)組分后粒子表面羥基形成氫鍵締合；此外，紅外譜圖中明顯呈現(xiàn)出加味五子衍宗丸化學(xué)組分在1 620 cm-1處的特征吸收峰，也表明微球表面成功鍵合了中藥分子。

1.7 靶點(diǎn)群的富集與鑒定 將表面鍵合加味五子衍宗丸化學(xué)成分組的磁性微球與SHSY5Y神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞裂解液混合后，于4 ℃下孵育12 h，以充分捕獲靶點(diǎn)蛋白。然后用洗脫液（Tris，pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，1% TritonX100，cocktail蛋白酶抑制劑）反復(fù)清洗微球6遍，并加入200 μL的loading buffer（2×），煮沸5 min。然后5 000 r·min-1離心2 min，取上清液并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。銀染后對(duì)捕獲的靶點(diǎn)蛋白條帶進(jìn)行顯影，并對(duì)所有蛋白條帶進(jìn)行酶解和高分辨質(zhì)譜鑒定，進(jìn)而確定每個(gè)靶點(diǎn)蛋白的屬性及名稱。

1.8 作用靶點(diǎn)群的KEGG通路分析^[7]利用DAVID 6.7（https：//david-d.ncifcrf.gov/）在線分析工具對(duì)全部靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行 KEGG 路徑分析，在Upload框架中粘貼所有靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因ID。選擇P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 加味五子衍宗丸神經(jīng)保護(hù)作用靶點(diǎn)群的富集與鑒定 對(duì)富集所得靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行凝膠電泳、銀染，共發(fā)現(xiàn)16條主要蛋白條帶。對(duì)每個(gè)蛋白條帶分別酶解后，進(jìn)行LC-MS-MS高分辨質(zhì)譜鑒定，共計(jì)發(fā)現(xiàn)32個(gè)潛在結(jié)合靶點(diǎn)蛋白（圖1）。因此推測(cè)：加味五子衍宗丸的作用靶點(diǎn)群可能主要包括這32個(gè)靶點(diǎn)。此外，選取了其中的5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白（14-3-3zeta，CDK1，Hsc70，Hsp70，Prxd1），并采用Western blot法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白均能夠被加味五子衍宗丸微球所特異性富集。

2.2 加味五子衍宗丸作用靶點(diǎn)群的分類與功能解析 根據(jù)鑒定所得靶點(diǎn)群，按照不同蛋白功能進(jìn)行分類，主要可分為如下10類功能靶點(diǎn)蛋白。①細(xì)胞能量代謝：主要包括ATP synthase subunit beta，pyruvate kinase；②蛋白質(zhì)量控制：主要包括heat shock cognate 71 kDa protein（Hsc70），heat shock 70 kDa protein（Hsp70），ATP-dependent Clp protease，ubiquitin thioesterase，vesicle-associated membrane protein-associated protein；③細(xì)胞凋亡：主要包括Rho-related GTP-binding protein，14-3-3 protein；④離子通道：主要包括voltage-dependent anion-selective channel，chloride intracellular channel protein；⑤細(xì)胞增殖與分化：主要包括eukaryotic translation initiation factor 3，stress-70 protein，stress-induced-phosphoprotein，serine/threonine-protein kinase，cyclin-dependent kinase 1（CDK1）；⑥線粒體功能調(diào)控：主要包括78 kDa glucose-regulated protein，calcium-binding mitochondrial carrier protein，hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase，phosphate carrier protein；⑦抗氧化：主要包括catalase，peroxiredoxin-1（Prdx1），pyrroline-5-carboxylate reductase；⑧神經(jīng)突觸發(fā)育：isoform 2 of ATPase family AAA domain-containing protein，Ras-related protein Rap-1A；⑨炎癥與免疫調(diào)控：elongation factor 1-alpha；⑩其他：actin，60S acidic ribosomal protein，guanine nucleotide-binding protein。endprint

2.3 加味五子衍宗丸抗癡呆和腦保護(hù)作用的機(jī)制詮釋 通過(guò)生物信息學(xué)分析，作者對(duì)鑒定得到的32個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行了研究。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些靶點(diǎn)主要與4條信號(hào)通路相關(guān)，包括：Hippo signaling pathway，Cell cycle，Biosynthesis of antibiotics和Shigellosis（圖2）。其中，加味五子衍宗丸與Hippo和Cell cycle 2條信號(hào)通路的相關(guān)性更為密切（P<0.05）。在Hippo信號(hào)通路中主要包含chloride intracellular channel 4和ras homolog family member G等靶點(diǎn)。在Cell cycle信號(hào)通路中主要包含hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，catalase，pyruvate kinase和pyrroline-5-carboxylate reductase等靶點(diǎn)。其中，加味五子衍宗丸對(duì)Hippo通路的調(diào)控作用可能主要體現(xiàn)在對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控方面，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮了重要作用，因此推測(cè)加味五子衍宗丸的活性成分可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)和改善神經(jīng)病理?yè)p傷的作用^[8]。此外，加味五子衍宗丸還可能通過(guò)作用于Cell cycle信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的周期進(jìn)程，進(jìn)而加快神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖以及向神經(jīng)元的分化^[9]。因此，Hippo和Cell cycle通路作為調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化的重要信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在加味五子衍宗丸的抗癡呆和腦保護(hù)作用中發(fā)揮了重要角色。

3 討論

如何將中藥復(fù)雜體系的作用靶點(diǎn)群從細(xì)胞中特異性富集出來(lái)并進(jìn)行鑒定是本研究的關(guān)鍵。在此制備了一種表面含光敏二苯甲酮基團(tuán)的磁性微球，二苯甲酮基團(tuán)在紫外光激發(fā)下可以活化為碳自由基，進(jìn)而與中藥活性分子中的碳?xì)滏I發(fā)生化學(xué)鍵合，鑒于中藥活性分子大多具有碳?xì)滏I，因此利用該法可以實(shí)現(xiàn)將中藥復(fù)雜體系的化學(xué)成分整體鍵合到磁性微球表面，進(jìn)而用于后續(xù)靶點(diǎn)富集的操作。此外，磁性微球在磁力架上可迅速?gòu)募?xì)胞裂解液中分離，不必反復(fù)高速離心，大大簡(jiǎn)化了操作程序，更易進(jìn)行靶點(diǎn)富集實(shí)驗(yàn)。

在對(duì)鑒定得到的靶點(diǎn)群進(jìn)行生物學(xué)功能分析后發(fā)現(xiàn)：靶點(diǎn)大致可分為10類，包括細(xì)胞能量代謝、蛋白質(zhì)量控制、細(xì)胞凋亡、離子通道、細(xì)胞增殖與分化、線粒體功能調(diào)控、抗氧化、神經(jīng)突觸發(fā)育、炎癥與免疫調(diào)控以及其他功能等。細(xì)胞能量代謝、線粒體功能調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)可能主要是改善并增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞線粒體內(nèi)的ATP合成，提高線粒體功能，進(jìn)而為神經(jīng)細(xì)胞提供更多的能量；蛋白質(zhì)量控制類靶點(diǎn)可能主要參與了清除神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)不正常蛋白（比如β淀粉樣蛋白）的合成；細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化類靶點(diǎn)可能是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的存活與凋亡通路，進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的活力；離子通道、神經(jīng)突觸發(fā)育類靶點(diǎn)可能是要參與了神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)與通訊，進(jìn)而增強(qiáng)了神經(jīng)元的信息傳導(dǎo)功能；抗氧化類靶點(diǎn)主要是清除神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的氧化自由基，進(jìn)而使神經(jīng)細(xì)胞免受氧化性損傷；炎癥與免疫調(diào)控類靶點(diǎn)可能是通過(guò)調(diào)控炎癥相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)炎性損傷。此外，通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)加味五子衍宗丸可能主要是通過(guò)作用于兩大類信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)揮抗癡呆和腦保護(hù)作用的，即Hippo和Cell cycle通路。這2個(gè)通路均涉及到神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化進(jìn)程，因此推測(cè)加味五子衍宗丸的核心調(diào)控機(jī)制可能是靶向與神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞，并通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元新生和定向分化實(shí)現(xiàn)抗癡呆和腦保護(hù)作用的^[10-11]。綜合來(lái)看，加味五子衍宗丸的活性成分可能涉及到多個(gè)方面的神經(jīng)功能調(diào)節(jié)，這也正好體現(xiàn)了中藥方劑多成分、多靶點(diǎn)的作用特色。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 劉麗寧.傳統(tǒng)中藥臨床用藥優(yōu)勢(shì)之一多靶點(diǎn)探討[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2010， 21（3）： 745.

[2] 肖斌，陶歐，羅計(jì)，等.中藥藥性與功能靶點(diǎn)的關(guān)系[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)， 2011，9（7）： 789.

[3] 富宏，王學(xué)美，劉庚信，等.加味五子衍宗顆粒對(duì)輕度認(rèn)知障礙患者記憶功能及血清β淀粉樣蛋白的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)， 2007（8），27： 715.

[4] 富宏，王學(xué)美，劉庚信，等.加味五子衍宗顆粒對(duì)輕度認(rèn)知障礙患者記憶功能及海馬體積的磁共振研究[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2006，26（12）：1066.

[5] Lundberg P， Walter M， Montanez M I， et al. Linear dendritic polymeric amphiphiles with intrinsic biocompatibility： synthesis and characterization to fabrication of micelles and honeycomb membranes[J]. Polym Chem，2011， 2：394.

[6] Wang S L， Yue K， Liu L Y， et al. Photoreactive， core-shell cross-linked/hollow microspheres prepared by delayed addition of cross-linker in dispersion polymerization for antifouling and immobilization of protein[J]. J Colloid Interface Sci， 2013， 389：126.

[7] Kanehisa M， Furumichi M， Tanabe M， et al. KEGG： new perspectives on genomes， pathways， diseases and drugs[J]. Nucleic Acids Res， 2017， 45（D1）：D353.

[8] Sarikaya D P， Extavour C G. The Hippo pathway regulates homeostatic growth of stem cell niche precursors in the drosophila ovary[J]. PLoS Genet， 2015， 11（2）： e1004962.

[9] Hiemer S E， Varelas X. Stem cell regulation by the Hippo pathway[J]. Biochim Biophys Acta， 2013， 1830（2）：2323.

[10] Ding R， Berger C. Hippo pathway regulates neural stem cell quiescence[J]. Cell Cycle， 2016， 15（12）：1525.

[11] 宋芳嬌，曾克武，于倩，等.基于基因芯片分析研究加味五子衍宗方對(duì)SAMP8小鼠大腦神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫微環(huán)境的調(diào)控作用[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2015，50（21）： 1874.

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint