姜黃素逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌TKI靶向藥物耐藥機制的研究

張衛(wèi)平+王玨+冉冉

[摘要] 目的 探討姜黃素逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌（NSCLC）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）靶向藥物耐藥的分子機制。 方法 選用非小細胞肺癌NCI-H1975細胞，分別采用相應藥物進行處理。采用MTT法檢測姜黃素對NCI-H1975細胞增殖的抑制作用，同時檢測姜黃素對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，采用流式細胞術(shù)檢測姜黃素對NCI-H1975細胞凋亡率的影響，采用Western Blot法檢測各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平。 結(jié)果 與對照組比較，姜黃素5 μmol/L組、10 μmol/L組、15 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組在24 h、48 h、72 h對NCI-H1975細胞增殖抑制率明顯較高（P<0.05），并且具有劑量及時間依賴性；對NCI-H1975細胞TKI耐藥性的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)比較，預處理+姜黃素+吉非替尼組>姜黃素+吉非替尼組>預處理+吉非替尼組（P<0.05）。與對照組比較，各組NCI-H1975細胞凋亡率較高，其中聯(lián)合用藥組>吉非替尼組>姜黃素組（P<0.05）。與對照組比較，各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平較低，其中聯(lián)合用藥組<吉非替尼組<姜黃素組（P<0.05）。 結(jié)論 姜黃素能有效逆轉(zhuǎn)NCI-H1975細胞TKI靶向藥物耐藥性，抑制細胞增殖并促進其凋亡，最佳給藥方式是姜黃素預處理后再與吉非替尼聯(lián)用，作用機制可能與下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素；非小細胞肺癌；TKI靶向藥物；耐藥機制

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0037-05

Study on the resistance mechanism of curcumin in reversing TKI targeted drugs in non-small cell lung cancer

ZHANG Weiping WANG Jue RAN Ran

Department of Oncology， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Medical Chinese University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of curcumin in reversing the drug resistance of tyrosine kinase inhibitor（TKI） targeted drugs in non-small cell lung cancer（NSCLC）. Methods NCI-H1975 cells of NSCLC were selected and treated with corresponding drugs. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of curcumin on the proliferation of NCI-H1975 cells. The reversal effect of curcumin on NCI-H1975 cell resistance was also detected. The effect of curcumin on the apoptosis rate of NCI-H1975 cells was detected by flow cytometry. The expression levels of p-PI3K， p-Akt， p-Ras and p-ERK proteins in NCI-H1975 cells were detected by Western Blot method. Results Compared with the control group， the cell proliferation inhibitory rate of NCI-H1975 cells was significantly higher in the curcumin 5 μmol/L group， 10 μmol/L group， 15 μmol/L group， 20 μmol/L group and 40 μmol/L group at 24 h， 48 h and 72 h（P<0.05）， showing a dose and time dependence； the reversing fold of TKI resistance of NCI-H1975 cells was compared， and pretreatment+curcumin+gefitinib group>curcumin+gefitinib group>pretreatment+gefitinib group（P<0.05）. Compared with the control group， the apoptosis rate of NCI-H1975 cells in each group was higher， and the combined drug use group>gefitinib group>curcumin group（P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of p-PI3K， p-Akt， p-Ras and p-ERK protein in NCI-H1975 cells in each group were lower， and the combined drug use group gefitinib group

[Key words] Curcumin； Non-small cell lung cancer； TKI targeted drugs； Resistance mechanism

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占80%[1]。流行病學資料顯示，2012年全球有182萬新發(fā)肺癌患者，158萬患者死亡，已經(jīng)成為世界性健康問題[2]。我國隨著吸煙人數(shù)增加、人口老齡化程度加深等，近年來肺癌發(fā)病率也呈現(xiàn)不斷上升趨勢，關(guān)于肺癌治療手段的研究也備受關(guān)注。分子靶向藥物是NSCLC治療的新手段，具有靶向性、安全性等優(yōu)點[3]，其中以酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）最為常見。TKI類藥物以人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變引起的酪氨酸激酶異?；罨癁樽饔冒悬c，能有效阻斷EGFR磷酸化，調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞凋亡，療效確切，已經(jīng)被推薦用于EGFR突變陽性患者的一線治療[4]。但有研究發(fā)現(xiàn)，一般治療8～11個月會有獲得性耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生[5]，影響治療效果。姜黃素是提取自中藥姜黃的多酚類物質(zhì)，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用[6]，但關(guān)于其對NSCLC細胞TKI耐藥性的影響及機制的研究較少。本研究即探討姜黃素逆轉(zhuǎn)NSCLC細胞TKI靶向藥物耐藥的分子機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 人非小細胞肺癌NCI-H1975細胞株，品牌：ATCC，購自北京中原公司。

1.1.2 藥品與試劑 姜黃素，CAS號：458-37-7，純度：≥98%，品牌：克拉瑪爾，購自上海紫一試劑廠，采用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解后加雙蒸水配制成濃度為500 μmol/L的溶液，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；吉非替尼片，規(guī)格：0.25 g，國藥準字J20100014，購自英國阿斯利康制藥有限公司，采用DMSO溶解配制25 mmol/L溶液，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS），購自北京奧博來科技有限責任公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶消化液，購自美國GIBCO公司；胎牛血清（FBS），以色列Biological Industries公司產(chǎn)品；DMSO、四甲基偶氮唑藍（MTT），購自山海索萊寶生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素、BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海銘博生物科技有限公司；增強型化學發(fā)光底物（enhanced chemiluminescence substrate，ECL）檢測試劑盒，購自上海炎熙生物科技有限公司；小鼠磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、p-Ras、磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)的激酶（phosphorylated extracellular signal regulated kinase，p-ERK）抗體，廈門慧嘉生物科技有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG，購自上海朗頓生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 細胞培養(yǎng)板、75 cm2細胞培養(yǎng)瓶，購自北京思齊生物技術(shù)有限公司；3121型CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱、902-ULTS超低溫冰箱，美國Thermo Scientific Forma公司產(chǎn)品；DK-8D型電熱恒溫水槽，購自上海優(yōu)耳儀器科技有限公司；TD5M型低速離心機，購自長沙湘智離心機儀器有限公司；K40型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；680型臺式酶標儀，美國Bio-Rad公司；EPICS-XL型流式細胞儀、DC-7型紫外分光光度計，美國Beckman Coulter公司；DYY-7C型電泳儀，購自北京六一儀器廠；JS-680全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀，購自上海培清科技有限公司；SRC20BA型高速冷凍離心機，日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇及培養(yǎng) 取出凍存的非小細胞肺癌NCI-H1975細胞株，37℃恒溫水浴融化，之后置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶中有含10%滅活FBS、100 U/mL青霉素及100 g/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，在5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，每3～4天進行換液傳代，待傳代至第3代，NCI-H1975細胞貼壁生長至占滿培養(yǎng)瓶80%時，即處于對數(shù)生長期，收集對數(shù)生長期的細胞作為實驗對象。

1.2.2 姜黃素對NCI-H1975細胞增殖的抑制作用檢測 取對數(shù)生長期NCI-H1975細胞，滴加0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL消化，孵育3 min后加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL，將細胞液接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，分別滴加濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的姜黃素溶液200 μL，每個濃度設6個復孔，另外設置姜黃素濃度為0 μmol/L的對照組以及不含細胞的空白組，空白組加入200 μL完全培養(yǎng)基，于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別孵育24 h、48 h、72 h后，滴加5 mg/mL MTT溶液20 μL/孔，培養(yǎng)4 h，采用高速冷凍離心機500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀內(nèi)加入100 μL DMSO溶液，振蕩10 min充分溶解，采用680型臺式酶標儀，在490 nm波長處測定各培養(yǎng)孔的光密度（OD值）。計算NCI-H1975細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%，并計算作用48 h后，姜黃素的半數(shù)抑制量（IC50）及IC15值。endprint

1.2.3 姜黃素對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用檢測 取對數(shù)生長期NCI-H1975細胞，滴加0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL消化，孵育3 min后加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×105個/mL，將細胞液接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，設置吉非替尼組、預處理+姜黃素+吉非替尼組、姜黃素+吉非替尼組、預處理+吉非替尼組、對照組及空白組，每組設6個復孔，吉非替尼組分別滴加0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；預處理+姜黃素+吉非替尼組首先采用100 μL 10 μmol/L姜黃素溶液預處理，孵育30 min后，分別滴加10 μmol/L姜黃素溶液100 μL及0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；姜黃素+吉非替尼組不經(jīng)預處理，直接分別滴加10 μmol/L姜黃素溶液100 μL及0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；預處理+吉非替尼組采用100 μL 10 μmol/L姜黃素溶液預處理，孵育30 min后，分別滴加0.01、0.04、0.1、0.4 μmol/L吉非替尼溶液200 μL；對照組加入200 μL完全培養(yǎng)基；空白組不含細胞，只含200 μL完全培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h、48 h、72 h后，按照1.2.2的步驟，采用MTT法檢測各培養(yǎng)孔OD值，計算細胞增殖抑制率，并據(jù)此計算各組IC50值，根據(jù)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=吉非替尼組IC50/姜黃素干預組IC50，計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

1.2.4 流式細胞術(shù)（FCM）檢測NCI-H1975細胞凋亡率 取對數(shù)生長期NCI-H1975細胞，制備濃度為2×105個/mL的單細胞懸液，取6孔板，接種細胞懸液2 mL/孔，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基200 μL，于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，設置吉非替尼組、姜黃素組、聯(lián)合用藥組及對照組，每組設6個復孔，吉非替尼組加入0.1 μmol/L吉非替尼溶液200 μL，姜黃素組加入10 μmol/L姜黃素溶液200 μL，聯(lián)合用藥組首先采用100 μL 10 μmol/L姜黃素溶液預處理，孵育30 min后，分別滴加10 μmol/L姜黃素溶液100 μL+0.1 μmol/L吉非替尼溶液200 μL，對照組加入200 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后，加入0.25%胰蛋白酶4 mL進行消化，采用離心機1000 r/min速度離心5 min，棄上清液，PBS沖洗3次后，采用500 μL binding buffer重懸細胞，滴加異硫氰酸熒光素（FITC）標記的 Annexin V 10 μL，4℃70%乙醇5 mL進行固定；過夜后，1000 r/min速度離心5 min，棄乙醇，200 μL PBS重懸細胞，避光孵育 15 min后滴加碘化丙啶（PI）5 μL，避光孵育5 min后采用流式細胞儀檢測各組NCI-H1975細胞凋亡率。

1.2.5 Western Blot法檢測NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平 按照1.2.4中的方法培養(yǎng)細胞及分組干預，每組取100 mg細胞，加入組織裂解液，提取組織蛋白質(zhì)，按照試劑盒說明書操作，采用BCA法測定總蛋白濃度；取20 g蛋白質(zhì)樣品，采用電泳儀，通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE），將凝膠轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，滴加5%脫脂奶粉，封閉90 min后，分別滴加小鼠p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK一抗（1∶1000稀釋），分子量為42 KD的β-Actin抗體（1∶400稀釋）作為內(nèi)參，孵育2 h，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG二抗（1∶1000稀釋），孵育1 h，按照ECL檢測試劑盒說明，進行顯影、定影。采用數(shù)碼凝膠成像分析儀掃描圖像，分析電泳結(jié)果，計算p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件包分析，符合正態(tài)性的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間資料比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用GraphPad Prism軟件繪制圖表。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素對NCI-H1975細胞的增殖抑制率比較

MTT法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，姜黃素5 μmol/L組、10 μmol/L組、15 μmol/L組、20 μmol/L組、40 μmol/L組在24 h、48 h、72 h對NCI-H1975細胞增殖抑制率明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且具有劑量及時間依賴性。經(jīng)計算姜黃素48 h對NCI-H1975細胞的IC50為25.1 μmol/L，IC15為10.75 μmol/L，選用10 μmol/L作為姜黃素后續(xù)實驗濃度。見表1。

2.2 姜黃素不同用藥方式對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用比較

結(jié)果顯示，姜黃素能夠明顯逆轉(zhuǎn)NCI-H1975細胞對吉非替尼的耐藥性，且逆轉(zhuǎn)倍數(shù)比較，預處理+姜黃素+吉非替尼組>姜黃素+吉非替尼組>預處理+吉非替尼組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組NCI-H1975細胞凋亡率比較

與對照組比較，吉非替尼組、姜黃素組、聯(lián)合用藥組NCI-H1975細胞凋亡率明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中聯(lián)合用藥組>吉非替尼組>姜黃素組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平比較

與對照組比較，各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平明顯較低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中聯(lián)合用藥組<吉非替尼組<姜黃素組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4、封三圖6。endprint

3討論

NSCLC的發(fā)病率及死亡率近年來不斷增加，給我國造成沉重的社會負擔。目前，NSCLC治療的主要手段仍為外科手術(shù)，但是只適用于早期患者，而大部分患者在確診時已經(jīng)發(fā)展至中晚期，失去手術(shù)治療時機。傳統(tǒng)的放療、化療等手段能一定程度延長患者生存期，但療效有限，且副作用較多。分子靶向治療是目前研究的熱點，吉非替尼等TKI類藥物是治療EGFR突變陽性NSCLC的有效靶向藥物，能顯著延長患者無疾病進展生存期[7]。但是，吉非替尼治療肺腺癌的緩解期僅為9～11個月，之后極易產(chǎn)生耐藥性，影響藥物療效。吉非替尼耐藥包括原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥，原發(fā)耐藥可能與EGFR下游信號分子K-ras突變、抑癌基因PTEN功能喪失等機制有關(guān)[8]，繼發(fā)耐藥的產(chǎn)生可能與EGFR基因exon-20二次突變、MET原癌基因擴增、腫瘤微環(huán)境改變等機制有關(guān)[9-10]。逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥性對于提高治療效果、改善患者預后意義重大。中藥中多酚、黃酮、生物堿等多種成分在逆轉(zhuǎn)腫瘤對化療藥物耐藥性方面具有較好作用，姜黃素是提取自中藥姜黃的多酚類活性成分，具有抗炎、抗氧化應激、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成等藥理作用[11-13]。此外，姜黃素還是一種有效的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，有研究認為，姜黃素能夠通過抑制p-糖蛋白（P-gp）表達，來降低乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR對紫杉醇的耐藥性[14]；姜黃素還能通過抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）表達量，來提高吉西他濱對胰腺癌耐藥株BXPC-3細胞移植瘤的治療效果[15]。而目前關(guān)于姜黃素逆轉(zhuǎn)TKI耐藥性的研究較少。

本次研究選擇吉非替尼耐藥細胞株NCI-H1975細胞常規(guī)進行傳代培養(yǎng)，分別采用5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的姜黃素溶液進行干預，通過MTT法對各組細胞增殖抑制率進行檢測，結(jié)果顯示，與對照組比較，各濃度姜黃素在24 h、48 h、72 h對NCI-H1975細胞增殖抑制率明顯較高，且濃度越高、作用時間越長，細胞增殖抑制率越高（P<0.05），表明姜黃素對于NCI-H1975細胞增殖有良好抑制作用，并且具有劑量及時間依賴性。姜黃素不同用藥方式對NCI-H1975細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用比較結(jié)果顯示，姜黃素能夠明顯逆轉(zhuǎn)NCI-H1975細胞對吉非替尼的耐藥性，且逆轉(zhuǎn)倍數(shù)比較，預處理+姜黃素+吉非替尼組>姜黃素+吉非替尼組>預處理+吉非替尼組（P<0.05），表明經(jīng)姜黃素預處理后，再給予姜黃素聯(lián)合吉非替尼的用藥方式能取得最好的逆轉(zhuǎn)效果。表3檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，吉非替尼組、姜黃素組、聯(lián)合用藥組NCI-H1975細胞凋亡率明顯較高，且聯(lián)合用藥組>吉非替尼組>姜黃素組（P<0.05），表明姜黃素具有促進NCI-H1975細胞凋亡的作用，與吉非替尼聯(lián)合使用促凋亡作用更強，二種藥物具有協(xié)同作用。

TKI靶向藥物是EGFR抑制劑，EGFR在許多NSCLC細胞中過高表達，主要通過PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK兩條下游信號通路來誘導腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等，TKI類藥物則可抑制信號通路信號轉(zhuǎn)導，誘導細胞阻滯，加速細胞凋亡，起到抗腫瘤作用[16-18]。TKI的耐藥性也與EGFR下游通路信號轉(zhuǎn)導子的改變密切相關(guān)[19]。PI3K-Akt的信號轉(zhuǎn)導子主要包括PI3K、磷脂酰肌醇依賴性激酶（PDK）、Akt等，在腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移中起重要作用；Ras-Raf-MEK-ERK通路則主要包含細胞膜小分子蛋白Ras、Raf激酶、絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK）、ERK等，主要參與細胞增殖及凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)過程[20]。信號通路中相關(guān)蛋白分子的磷酸化水平與該信號通路的活化程度正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，各組NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白表達水平明顯較低，其中聯(lián)合用藥組<吉非替尼組<姜黃素組（P<0.05），表明姜黃素聯(lián)合吉非替尼能夠下調(diào)NCI-H1975細胞p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白水平，抑制PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK通路磷酸化水平，這可能是姜黃素逆轉(zhuǎn)NCI-H1975細胞TKI耐藥性的機制。

綜上所述，姜黃素能有效逆轉(zhuǎn)NCI-H1975細胞TKI靶向藥物耐藥性，抑制細胞增殖并促進其凋亡，最佳給藥方式是姜黃素預處理后再與吉非替尼聯(lián)用，作用機制可能與下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-Ras、p-ERK蛋白水平有關(guān)。

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