傳統(tǒng)酸面團(tuán)中抗霉菌乳酸菌的篩選及其在蒸蛋糕中的應(yīng)用

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(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.無錫麥吉貝可生物食品有限公司,江蘇無錫 214131;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;4.三菱化學(xué)食品株式會(huì)社,日本東京 100-8251)

傳統(tǒng)酸面團(tuán)中抗霉菌乳酸菌的篩選及其在蒸蛋糕中的應(yīng)用

何艷霞1,王鳳2,楊文丹1,陳佳芳1,徐巖3,黃衛(wèi)寧1,小川晃弘4

(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.無錫麥吉貝可生物食品有限公司,江蘇無錫 214131;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;4.三菱化學(xué)食品株式會(huì)社,日本東京 100-8251)

蒸蛋糕含水量高,不易貯藏。因此,篩選具有抑菌活性的乳酸菌,并將其應(yīng)用于蒸蛋糕的防腐保鮮具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。采用牛津杯法初篩、微量孔板復(fù)篩,從傳統(tǒng)酵頭中篩選得到一株對(duì)蒸蛋糕中主要腐敗菌具有高抑菌活性的乳酸菌,對(duì)該乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,并分析其抑菌活性的有效成分;以該乳酸菌酸面團(tuán)發(fā)酵粉替代低筋粉(替代率分別為0、25%、50%、75%),研究其對(duì)蒸蛋糕的質(zhì)構(gòu)、感官和微生物的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)鑒定該乳酸菌為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),對(duì)不同蛋白酶的處理表現(xiàn)出不同的敏感性,發(fā)酵液對(duì)熱穩(wěn)定,對(duì)pH變化最為敏感,推測(cè)抑菌作用主要是有機(jī)酸。有機(jī)酸分析可知,苯基乳酸的含量高達(dá)95.91 mg/L。隨著替代率的增加,微生物數(shù)顯著降低;當(dāng)替代率為25%和50%時(shí),可以顯著降低蒸蛋糕的硬度和咀嚼性;當(dāng)替代率為50%時(shí),蒸蛋糕的感官評(píng)價(jià)和空白接近,可以被消費(fèi)者接受。

蒸蛋糕,乳酸菌,抑菌活性,傳統(tǒng)酸面團(tuán)

乳酸菌是食品加工業(yè)不可缺少的主要工業(yè)用菌,它賦予了食品獨(dú)特的風(fēng)味[1-2],改善了食品的營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)[3],抑制食品中腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)[4-5]。乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)是使用乳酸菌發(fā)酵制得的面團(tuán)。乳酸菌的一些代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸[6]、乳酸菌素[7]、過氧化氫和特殊的酶系[8]可以起到抑菌作用。已有大量應(yīng)用實(shí)例證明,乳酸菌能提高食品安全性,延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[9-10]。因此,對(duì)乳酸菌抑菌物質(zhì)的研究,尤其是對(duì)其作用機(jī)理和在食品中的應(yīng)用研究顯得尤為重要。

近年來在中國(guó)市場(chǎng)上出現(xiàn)了具有中國(guó)傳統(tǒng)特色的蛋糕-蒸蛋糕,因其組織細(xì)膩、彈性好、口感綿軟、入口即化且采用蒸制工藝,所以廣受現(xiàn)代人的追捧[11]。但是蒸蛋糕含水量高達(dá)28%～33%,幾乎是烤制蛋糕的一倍[12],是糕點(diǎn)中最難貯存的品種之一,因此蒸蛋糕的防霉保鮮值得重視和深入研究。

目前,乳酸菌酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)在面包中的應(yīng)用研究較多,例如植物乳桿菌發(fā)酵紫薯粉對(duì)酸面團(tuán)面包影響[13]、乳酸菌發(fā)酵栗粉對(duì)無麩質(zhì)面包的影響[14]和乳酸菌對(duì)面包貯藏性的研究[15-16]等。有關(guān)在蒸蛋糕中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。因此本論文從傳統(tǒng)老酵頭中篩選了具有較高抑菌活性的乳酸菌,研究了其抑菌特性,并用其制備酸面團(tuán)發(fā)酵粉應(yīng)用于蒸蛋糕中,研究其對(duì)蒸蛋糕質(zhì)構(gòu)特性、感官特性和微生物的影響。從而為蒸蛋糕的天然生物防腐保鮮提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

低筋粉 江蘇省南順食品有限公司;白砂糖和奶粉 福臨門食品有限公司;雞蛋和鹽 均為市售食品級(jí);植物油 金龍魚葵花籽油;菱友TM MFC-68 三菱化學(xué)食品有限公司;糖醇和丙三醇 珠海市宏泰生物科技有限公司;泡打粉 焙樂道公司;蒸蛋糕 日本三菱化學(xué)有限公司;米粉發(fā)酵液、酒醅和老面酵頭 采集自中國(guó)各個(gè)地區(qū)(廣西、湖南、貴州和云南等地);菌落總數(shù)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、甘油、無水乙醇、異丙醇、瓊脂、氯化鈉、瓊脂糖、胰蛋白酶、胃蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司;蛋白酶k、苯基乳酸和過氧化氫 美國(guó)Sigma公司。

KitchenAid打蛋器 美國(guó)Heavy Duty公司;美的中式電蒸鍋 廣州美的電器有限公司;SM-25攪拌機(jī) 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;蘇州安泰凈化工作臺(tái)SW-CJ-2F 蘇州安泰凈化公司;APX-150C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JY20002型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;NanoDrop2000分光度計(jì)、Legend Micro17型離心機(jī) Thermo公司;PC300 型PCR儀、DYY-8C 型電泳儀 Bio-Rad;T-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)S
Table Micro Systems公司;熒光倒置顯微鏡Zeiss Axio Vert.A1 蔡司中國(guó);Agilent1100 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒸蛋糕的制作 根據(jù)表1中的配方準(zhǔn)確稱取各種原料,首先將除去低筋粉和奶粉的所有原料攪拌均勻,然后加入低筋粉和奶粉高速打發(fā)。將攪拌好的面糊分裝到模具中在蒸鍋中蒸熟即可。室溫冷卻1 h后裝入塑封袋中,放置在室溫(20±2) ℃貯藏待用[17]。

表1 蒸蛋糕配方Table 1 Formulations of steamed cake

1.2.2 蒸蛋糕中主要腐敗菌的分離純化及鑒定 無菌操作下取25 g蒸蛋糕,加入225 mL無菌水中,振蕩器振蕩30 min,再取1 mL稀釋液加入9 mL無菌水中,依次稀釋成10-1,10-2、10-3倍稀釋液,分別取0.1 mL稀釋液接種到菌落總數(shù)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,每個(gè)處理3次重復(fù),置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù)并挑取不同形態(tài)的單菌落。無菌操作下取不同形態(tài)的細(xì)菌單菌落于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基上劃線純化[18],純化后的單菌落用于顯微鏡鏡檢和分子鑒定。細(xì)菌采用16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序,真菌采用26S rDNA基因擴(kuò)增測(cè)序[19]。

1.2.3 乳酸菌的純化及保藏 將米粉發(fā)酵液、酒醅和老面酵頭中分離得到的近500株乳酸菌進(jìn)行了純化和保藏。乳酸菌的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h。菌落在MRS固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化,并保藏于MRS 斜面上保藏(4 ℃),備用[20]。

1.2.4 具有抑菌活性乳酸菌的初篩

1.2.4.1 產(chǎn)酸菌上清液的制備 從傳統(tǒng)酸面團(tuán)中分離純化的產(chǎn)酸菌中進(jìn)行篩選,首先將菌株在37 ℃ 24 h下傳代活化兩次,然后將活化好的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,將發(fā)酵菌液以10000 r/min 離心 10 min,后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾制得乳酸菌無菌體發(fā)酵液(Cell free supernatant,CFS),4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

1.2.4.2 指示菌孢子懸液的制備 將從蒸蛋糕中分離得到的霉菌接種在 PDA平板,28 ℃,培養(yǎng)4～7 d后,用無菌水刮取孢子。然后將孢子液經(jīng)已滅菌的紗布過濾,除去菌絲體即為孢子懸液。采用血球計(jì)數(shù)板,將孢子濃度調(diào)整為105個(gè)/mL[22]。

1.2.4.3 抑菌實(shí)驗(yàn) 牛津杯法[23]將培養(yǎng)好的指示菌曲霉和青霉分別吸取0.1 mL于PDA固體培養(yǎng)基上,用涂布器涂抹均勻。將每個(gè)固體培養(yǎng)基6等分,于每個(gè)區(qū)域放置一只高壓滅菌過的牛津杯,即每個(gè)培養(yǎng)基放6只。用移液槍吸取 0.20 mL乳酸菌上清液于牛津杯中。操作完成后,放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,通過抑菌圈大小以判斷抑菌效果。

1.2.5 具有抑菌活性的乳酸菌的復(fù)篩 采用微量孔板法[24]。96孔板每孔加入190 μL的乳酸菌無菌體發(fā)酵液以及10 μL濃度為104孢子/mL的指示菌懸液。在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后于酶標(biāo)儀580 nm下測(cè)定其吸光值。乳酸菌的抑菌活性以其對(duì)指示真菌的抑菌率表示。

抑菌率(%)=(1-ODLAB/ODControl)×100

1.2.6 具有抑菌活性乳酸菌的鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取乳酸菌的DNA,用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD值(A260/A280)和濃度。對(duì)其進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增,得到的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度,將純度符合要求的16S rRNA 片段送往上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。得到的菌株序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源性比對(duì)分析。檢索與16S rRNA序列同源性最高的已知分類的菌種,確定其種屬[20]。

1.2.7 乳酸菌抑菌作用的分析 pH的影響:將乳酸菌CFS用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L乳酸分別將MRS肉湯培養(yǎng)基的初始pH調(diào)到為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,同時(shí)將MRS 液體培養(yǎng)基調(diào)制相同的pH為對(duì)照,按1.2.4的方法進(jìn)行測(cè)定。

熱處理的影響:將乳酸菌CFS分別在60、80和100 ℃下作用30 min,在121 ℃下作用15 min,同時(shí)以乳酸菌CFS作為對(duì)照,按1.2.4的方法進(jìn)行測(cè)定。

酶處理的影響:將乳酸菌CFS分別用1.0 mol/L NaOH或1.0 mol/L HCl調(diào)至酶的最佳pH(胃蛋白酶pH2.0,胰蛋白酶pH7.4,蛋白酶K pH7.4),分別添加至乳酸菌CFS使其終濃度為1 mg/mL。在 37 ℃下處理4 h,調(diào)pH至代謝產(chǎn)物初始pH,同時(shí)以乳酸菌CFS為對(duì)照,按1.2.4的方法進(jìn)行測(cè)定。

過氧化氫作用的排除:取2.0 mL的菌株發(fā)酵液,將其pH調(diào)為7.0,加入20 mg過氧化氫酶,輕輕搖晃至溶解,置于37 ℃保溫2 h,再將pH調(diào)為排除酸作用時(shí)所確定的對(duì)照pH,以未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液作為對(duì)照,測(cè)定抑菌活性。

1.2.8 乳酸菌無細(xì)胞上清液中有機(jī)酸含量的測(cè)定 HPLC條件:流動(dòng)相為0.05%的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05%的三氟乙酸/水(B)的混合液,梯度洗脫程序?yàn)?0～20 min由10%A線性變化至100%,20～23 min保持100%A,23～25 min由100%A線性變化至10%。流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm,柱溫30 ℃[25]。

1.2.9 具有抑菌活性的乳酸菌在蒸蛋糕中的應(yīng)用

1.2.9.1 植物乳桿菌酸面團(tuán)發(fā)酵粉的制備 低筋粉與水的比例為1∶1 (m/m),將篩選出的高抑菌活性的植物乳桿菌活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,取其菌液5000 r/min離心10 min,用無菌生理鹽水沖洗兩次后,加入水中,與低筋粉混合均勻,放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為38 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

將上述酸面團(tuán)放入保鮮袋后與-40 ℃預(yù)凍,然后真空冷凍干燥48 h。樣品冷凍干燥后進(jìn)行磨粉,過80目篩,4 ℃儲(chǔ)藏備用[26]。

1.2.9.2 蒸蛋糕全質(zhì)構(gòu)分析 將蒸蛋糕于室溫下冷卻1 h后,切割成1.2 cm厚的均勻薄片,采用TA-XT2I質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)分析,實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定為:測(cè)試前速率1.0 mm/s,測(cè)試速率1.0 mm/s,測(cè)試后速率1.0 mm/s,壓縮程度50%,兩次壓縮間隔時(shí)間30 s。測(cè)定的指標(biāo)包括硬度、彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性。

1.2.9.3 蒸蛋糕感官分析采用九分嗜好評(píng)分法 對(duì)不同替代比例的酸面團(tuán)發(fā)酵粉的蒸蛋糕感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)分。測(cè)試前產(chǎn)品隨機(jī)編號(hào),測(cè)試所用感官評(píng)定人員為江南大學(xué)本校學(xué)生,年齡在20～30歲之間,感官評(píng)定人員按男女比例3∶7進(jìn)行分類。篩選20名經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)的評(píng)定人員分別對(duì)編號(hào)后的產(chǎn)品色澤、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、口感、滋味以及總體可接受度進(jìn)行評(píng)分[28]。

1.2.9.4 儲(chǔ)藏期的測(cè)定 菌落總數(shù)的測(cè)定按GBT4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[29]。

酵母菌和霉菌的計(jì)數(shù)按GBT4789.15-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》[30]。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為三次平行測(cè)量的平均值,運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和最小顯著差異分析(LSD),顯著差異df水平取p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1蒸蛋糕中主要腐敗菌的分離鑒定

從蒸蛋糕中總共分離出11種霉菌,7種細(xì)菌。其中Staphylococcuswarneri和Staphylococcusepidermidis是主要腐敗細(xì)菌,Penicillium、Cladosporium和Aspergillus是主要腐敗霉菌,其中青霉最為主要的腐敗霉菌,且蒸蛋糕在貯藏過程中主要以霉變?yōu)橹?。EunjongBaek等[27]發(fā)現(xiàn)Cladosporium,Neurospora和Penicillium是烘焙和米制品中的主要霉菌,Legan 等[31]發(fā)現(xiàn)青霉是面包霉變的主要霉菌,與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。部分霉菌的平板圖如圖1所示,顯微鏡圖如圖2所示。

2.2具有抑菌活性乳酸菌的分離純化、篩選及鑒定

從不同地區(qū)的傳統(tǒng)酸面團(tuán)中分離得到的近150株乳酸菌中篩選對(duì)蒸蛋糕中主要霉菌具有抑菌活性的乳酸菌,經(jīng)過初篩,篩選得到25株具有抑菌活性的菌株。從25株中復(fù)篩得到11株具有抑菌活性的菌株(表2),選擇其中抑菌活性最好的菌株DT2-4作為應(yīng)用菌株進(jìn)行研究。DT2-4對(duì)不同霉菌的抑菌圈如圖3所示。

DT2-4菌株菌落形態(tài)為乳白色圓形,表面光滑,中央凸起,邊緣整齊,直徑約1 mm,是典型的乳酸菌菌落特征(圖4a),可初步判斷為乳酸菌,革蘭氏染色鏡檢確定為桿菌(圖4b)。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中參考菌株Lactobacillusplantarumstrain Z55對(duì)比,相似性達(dá)100%,所以將其鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp),登錄號(hào)為KC887524。

2.3抑菌作用的研究

從圖5分析可知,當(dāng)pH≥5時(shí),對(duì)四種霉菌的抑制作用明顯減弱,與發(fā)酵原液之間的差異具有較大的顯著性(p>0.05),當(dāng)pH<5時(shí),和發(fā)酵原液的差異不顯著(p<0.05)。pH對(duì)菌液抑菌作用的影響依次為產(chǎn)黃青霉、聚多曲霉、球孢枝孢和黃曲霉。由此可知pH對(duì)每種霉菌抑制效果的影響是不一樣的。

表2 DT2-4發(fā)酵液對(duì)蒸蛋糕中主要霉菌的抑制作用Table 2 Antifungal of lactic acid bacterium DT2-4 culture supernatants to molds isolated from steamed cake

注:牛津杯內(nèi)徑 7.8 mm,外徑 8.0 mm;+++:抑菌圈直徑>20 mm;++:抑菌圈直徑:14～20 mm;+:抑菌圈直徑:<14 mm;-:無抑菌活性。

圖1 產(chǎn)黃青霉(a)、黃曲霉(b)、球孢枝孢(c)和聚多曲霉(d)培養(yǎng)基平板圖Fig.1 Colonies of Penicillium chrysogenum strain,Spergillus flavus strain,Cladosporiumsphaerospermumstrain and Aspergillus sydowii strain

圖2 產(chǎn)黃青霉(b)、黃曲霉(a)、球孢枝孢(c)、聚多曲霉(d)顯微鏡圖(40×)Fig.2 Morphology of Penicillium chrysogenum strain,Spergillus flavus strain,Cladosporium sphaerospermumstrain and Aspergillus sydowii strain

圖3 DT2-4對(duì)產(chǎn)黃青霉(a)、黃曲霉(b)、球孢枝孢(c)、聚多曲霉(d)的抑菌圈Fig.3 Inhibitory effect of lactic acid bacterium DT2-4on Penicillium chrysogenum strain,Spergillus flavus strain,Cladosporium sphaerospermum strain and Aspergillus sydowii strain

圖4 植物乳桿菌的平板圖(a)和顯微鏡圖(b)(40×)Fig.4 Colonies(a)and morphology(b)of Lp(40×)

圖5 不同pH對(duì)菌株CFS抑菌活性的影響Fig.5 Effects of pH on the anti-bacterial activity of CFS注:G:產(chǎn)黃青霉；B:球孢枝孢；H:黃曲霉；S5:聚多曲美，下同。相同圖案的柱子上小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05),下同。

圖6是將菌株DT 2-4的發(fā)酵液分別在60、80、100 ℃處理30 min,121 ℃處理15 min后的抑菌效果,在60 ℃和80 ℃處理后對(duì)四種指示菌的抑菌性沒有顯著性差異,在121 ℃處理后與原液有一定的顯著差異,可能是高溫使某些抑菌物質(zhì)失活?？傮w來看,溫度對(duì)黃青霉、聚多曲霉、球孢枝孢和黃曲霉的抑菌活性影響較小。

圖6 熱處理對(duì)乳酸菌DT2-4CFS抑菌活性的影響Fig.6 Influence of heat treatment on the effect ofDT2-4 CFS to indicator bacteria

圖7為采用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K酶解菌株2-4后測(cè)得的抑菌率。經(jīng)過胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K酶解后,植物乳桿菌發(fā)酵液對(duì)四種指示菌的抑菌活性有一定的提高,可能是經(jīng)過蛋白酶酶解后形成了新的具有抑菌活性的小分子的多肽或蛋白質(zhì)[32]。除胰蛋白酶對(duì)黃曲霉的抑制作用無顯著性差異外,其他幾種酶對(duì)各種霉菌的抑制作用均有顯著性差異。

表3 株乳酸菌CFS中有機(jī)酸和苯乳酸含量Table 3 Organic acid and phenyllactic acid contents of strain DT2-4 CFS

圖7 酶處理對(duì)菌株CFS抑菌活性的影響Fig.7 Effects of proteases treatmenton the anti-bacterial activity of DT2-4 CFS

由圖8可知,MRS發(fā)酵液經(jīng)過過氧化氫處理后抑菌活性變化不顯著,說明過氧化氫不是主要抑菌物質(zhì)。

圖8 排除過氧化氫后的抑菌效果Fig.8 Inhibitory effects after eliminating hydrogen peroxide

通過抑菌性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸是該植物乳桿菌抑菌作用的主導(dǎo)因素,李院[33]從市售醬菜中篩選得到三株對(duì)醬菜中分離的青霉菌有抑制作用的乳酸菌,pH調(diào)節(jié)對(duì)抑菌活性影響較大,不同蛋白酶處理乳酸菌發(fā)酵濃縮液的抑菌活性會(huì)有不同影響,但是三種加熱處理并不改變抑菌效果。石金鑫等[10]篩選得到的菌株P(guān)C3和SC3對(duì)擴(kuò)展青霉和黑曲霉均有較強(qiáng)的拮抗作用,對(duì)青霉和黑曲霉抑制活性物質(zhì)主要為酸性物質(zhì)。馬妙蓮[34]篩選分離得到六株對(duì)指示霉菌有抑菌作用的乳酸菌,其抑菌作用的主要成分初步確定為有機(jī)酸混合物。

圖9是苯基乳酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖,其峰值的保留時(shí)間為22.907 min。圖10是菌株DT2-4發(fā)酵液色譜圖,表3是利用高效液相色譜法測(cè)定菌株DT2-4 中苯基乳酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸結(jié)果。由表3可知,菌株DT2-4產(chǎn)苯基乳酸的能力較強(qiáng)。產(chǎn)生其他酸的能力一般。Valerio等[35]對(duì)在發(fā)酵食品中作為發(fā)酵劑或非發(fā)酵劑的幾乎所有代表乳酸菌進(jìn)行了研究,根據(jù)在MRS培養(yǎng)基中的苯乳酸和羥基苯乳酸的產(chǎn)生情況將乳酸菌分為3個(gè)類群:第一大類:既產(chǎn)生苯乳酸又產(chǎn)生羥基苯乳酸的乳酸菌,苯乳酸濃度范圍為26. 56～76. 36 mg/L、羥基苯乳酸的濃度范圍為12. 74～52. 78 mg/L;第二大類:只產(chǎn)生苯乳酸的乳酸菌,濃度為28. 22～94. 62 mg/L;第三大類:苯乳酸和羥基苯乳酸均不產(chǎn)生的乳酸菌,苯乳酸≤16. 6 mg/L、羥基苯乳酸≤3. 64 mg/L。按照此分類方法,菌株DT2-4應(yīng)屬于第2類群,其產(chǎn)量與第2類群中苯基乳酸產(chǎn)量最高的Leuconostocmesenteroidessubsp. mesenteroides ITMY30(94. 62 mg/L)相近。表明該菌株產(chǎn)苯基乳酸的能力比較好。李興峰[36]等人從泡菜中篩選得到一株高產(chǎn)苯基乳酸的植物乳桿菌,經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化確定該菌株30 ℃下在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后苯乳酸的含量可達(dá)91 mg/L。已有相關(guān)文獻(xiàn)證明苯基乳酸是一種新型的光譜生物防腐劑,對(duì)多種致病菌(革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌)以及引起食品腐敗的真菌(如青霉和曲霉)都有抑制作用[37-38]。說明苯基乳酸的抑菌作用對(duì)該菌株的抑菌活性的貢獻(xiàn)較大,使該菌株具有較高的抑菌能力。

圖9 苯基乳酸標(biāo)品色譜圖Fig.9 The chromatograms of phenyllactic acid

圖10 菌株DT2-4 CFS中有機(jī)酸測(cè)定色譜圖Fig.10 The determination of organic acidsin the chromatograms of DT2-4 CFS

2.4具有抑菌活性的乳酸菌在蒸蛋糕中的應(yīng)用

2.4.1 蒸蛋糕全質(zhì)構(gòu)分析 硬度是蛋糕芯部達(dá)到一定形變所需的力,是評(píng)價(jià)蛋糕質(zhì)構(gòu)的主要指標(biāo),它與蛋糕品質(zhì)呈負(fù)相關(guān),硬度值越小,蛋糕更加柔韌、綿軟,口感更佳。從表4中可以看出,當(dāng)發(fā)酵粉替代率為25%和50%時(shí),其硬度均顯著小于空白組,當(dāng)替代率為75%時(shí),硬度大于空白組,主要因?yàn)榘l(fā)酵后面粉的淀粉和蛋白質(zhì)發(fā)生變化,持氣能力減弱,導(dǎo)致最后產(chǎn)品收縮與硬度增加。由于低筋粉經(jīng)過發(fā)酵后,淀粉和蛋白質(zhì)被分解,導(dǎo)致最終蒸蛋糕產(chǎn)品彈性,內(nèi)聚性,膠著性和咀嚼性下降。這與張思佳等[39]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵酸面團(tuán)可以降低面包的硬度的研究結(jié)果相一致。

表4 不同發(fā)酵粉替代率對(duì)蒸蛋糕質(zhì)構(gòu)的影響Table 4 Effect of fermented cake flour substitution at various levels on texture parameters of steamed cakes

注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.4.2 蒸蛋糕感官分析 從圖11可以看出,當(dāng)替代率為25%和50%時(shí),蒸蛋糕的質(zhì)地,氣味和色澤沒有顯著性差異,在滋味和整體可接受度有差異。75%替代率的蒸蛋糕與其他實(shí)驗(yàn)組存在明顯差異。因?yàn)槿樗峋l(fā)酵,導(dǎo)致蒸蛋糕呈現(xiàn)較為明顯的酸味。從整體感官評(píng)定可以看出25%和50%的添加量的蒸蛋糕的整體可接受度和空白相近,可以被消費(fèi)者接受。

圖11 不同替代比例的發(fā)酵粉對(duì)蒸蛋糕感官評(píng)定的影響Fig.11 Effect of fermented cake flour substitutionat various levels on sensory characteristics of steamed cakes

2.4.3 微生物的變化 由表5可得,在室溫條件(20±2) ℃,隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),所有實(shí)驗(yàn)組的菌落總數(shù)和真菌數(shù)都呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。經(jīng)過5 d貯藏后,其菌落總數(shù)已經(jīng)超過國(guó)標(biāo)范圍(<1500 cfu/g)。添加發(fā)酵粉實(shí)驗(yàn)組的菌落總數(shù)均小于空白組,且隨著發(fā)酵粉替代率增加,菌落總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

隨著發(fā)酵粉替代率的增加,酵母菌和霉菌總數(shù)呈下降趨勢(shì)。5 d貯藏期后,空白組和25%的實(shí)驗(yàn)組真菌總數(shù)超過國(guó)標(biāo)范圍(<100 cfu/g),替代率為50%的實(shí)驗(yàn)組在第7 d才超過國(guó)標(biāo)范圍,第9 d時(shí)所有實(shí)驗(yàn)組都超過國(guó)標(biāo)。從蒸蛋糕表觀觀察可知,經(jīng)過7 d貯藏期后,空白組表皮出現(xiàn)霉點(diǎn),而替代率為25%,50%實(shí)驗(yàn)組在第9 d出現(xiàn)霉點(diǎn),替代率為75%的實(shí)驗(yàn)組直至第10 d才出現(xiàn)霉點(diǎn)。說明發(fā)酵粉替代率的增加,可以延緩蒸蛋糕發(fā)霉。綜上所述,添加乳酸菌發(fā)酵粉可以抑制蒸蛋糕中微生物的生長(zhǎng),從而延長(zhǎng)蒸蛋糕保質(zhì)期。這與Samapundo等[40]的研究相一致,其主要原因是發(fā)酵粉中含有大量有機(jī)酸從而降低了其pH,延長(zhǎng)了蒸蛋糕保質(zhì)期。

表5 蒸蛋糕在貯藏期間微生物的變化Table 5 Effect of fermented cake flour substitution at various levels on microorganism of steamed cakes

3 結(jié)論

從蒸蛋糕中分離得到10種霉菌,7種細(xì)菌,且發(fā)現(xiàn)蒸蛋糕的腐敗以霉變?yōu)橹?其中Penicillium、Cladosporium和Aspergillus是主要腐敗霉菌。以分離得到的主要霉菌為指示菌,經(jīng)過牛津杯初篩、微量孔板法復(fù)篩從傳統(tǒng)酵頭中分離得到1株具有高抑菌活性的乳酸菌。經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

對(duì)乳酸菌抑菌活性有效成分的分析顯示,抑菌活性成分對(duì)熱穩(wěn)定,對(duì)蛋白酶的處理表現(xiàn)出不同的敏感性,對(duì)pH變化最為敏感,推測(cè)抑菌作用主要是有機(jī)酸起主導(dǎo)作用。有機(jī)酸分析可知,苯基乳酸的含量為95.91 mg/L,與只產(chǎn)苯基乳酸的乳酸菌類群中產(chǎn)苯乳酸最高產(chǎn)量94.62 mg/L相近。

TPA結(jié)果表明,當(dāng)替代率為25%和50%時(shí),可以顯著降低蒸蛋糕硬度和咀嚼性。微生物研究結(jié)果表明,隨著乳酸菌發(fā)酵粉替代率增加,其抑菌活性增加。綜合感官評(píng)分結(jié)果顯示,當(dāng)乳酸菌發(fā)酵粉的替代率為50%時(shí),蒸蛋糕品質(zhì)和空白接近,可以被消費(fèi)者接受。將乳酸菌發(fā)酵粉應(yīng)用于蒸蛋糕,不僅可以延長(zhǎng)蒸蛋糕的保質(zhì)期,而且提高了蒸蛋糕的質(zhì)構(gòu),具有潛在的市場(chǎng)前景。

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Screeningofantifungallacticacidbacteriafromtraditionalsourdoughanditsapplicationinthesteamedcake

HEYan-xia1,WANGFeng2,YANGWen-dan1,CHENJia-fang1,XUYan3,HUANGWei-ning1,AkihiroOgawa4

(1.State Key of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Magibake International Co.,Ltd.,Wuxi 214131,China;3.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,School ofBiotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4.Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation,Tokyo 100-8251,Japan)

To isolate and identify lactic acid bacteria which could inhibit mainly molds from steamed cake. The antifungal activity was determined by oxford cup method firstly and then 96-microwells plates method,and analysis of the active components of bacteriostatic activity of lactic acid bacteria,and the molecular biology identification of lactic acid bacteria. The sourdough fermented flour was used to substitute for the cake flour(0,25%,50%,75%)and studied the influence of it on the quality,structure,the senses and the shelf life of steamed cake. Results indicated that the culture supernatant of lactic acid bacteria treatmenting with different proteases had different effects on the antibacterial activity. It was very sensitive to pH,while three heat treatments did not hardly affect the inhibitory efficiency. Organic acid analysis showed that the content of phenyl lactic acid was 95.91 mg/L. The lactic acid bacteria was identified asL.plantarum. Adding sourdough fermented flour can significantly reduce the hardness and chewiness of steamed cake when replacement rate was 25% and 50%. With the increasing of replacement rate,bacteriostatic activity increased. Sensory results showed that when the replacement rate was 50%,it had no significant changes,which can be accepted by consumers.

steamed cake;lactic acid bacteria;antibacterial activity;traditional sourdough

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0088-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.017

2017-03-22

何艷霞(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：烘焙科學(xué)、加工配料與食品添加劑，E-mail:yanxiachrissa@163.com。