超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞糞中16種殘留抗生素

吳丹 韓梅琳 鄒德勛 王旭明 高敏+仇天雷

摘要建立了固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）同時檢測畜禽糞便中四環(huán)素類、磺胺類、氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類16種抗生素的分析方法。針對目標(biāo)物化學(xué)性質(zhì)和樣品雜質(zhì)情況，對質(zhì)譜條件、提取液種類、超聲功率等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。最終以50%乙腈（V/V）的磷酸鹽緩沖溶液（pH=4）提取3次，經(jīng)過超聲、離心、旋蒸、稀釋后，SAXHLB串聯(lián)小柱凈化富集，用10 mL甲醇丙酮混合液（80∶20，V/V）洗脫，35℃氮吹近干后，用含0.1%甲酸甲醇（1∶1， V/V）定容，在UPLCMS/MS多反應(yīng)檢測模式下進(jìn)行定性及定量分析。結(jié)果表明，糞便中四環(huán)素類、磺胺類、氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的平均加標(biāo)回收率為56.4%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.6%～19.8%之間，方法檢出限（LOD， S/N=3）和定量限（LOQ， S/N=10）分別為0.01～2.50 μg/ kg和0.05～7.90 μg/kg。本方法簡便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于畜禽糞便中多種抗生素的同時檢測。

關(guān)鍵詞四環(huán)素類； 磺胺類； 氟喹諾酮類； 大環(huán)內(nèi)酯類； 固相萃取； 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 畜禽糞便

1引 言

抗生素在促進(jìn)動物生長、預(yù)防和治療動物疾病等方面具有重要作用，因此被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[1]。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國抗生素總使用量約16.2萬噸，其中52%為獸用抗生素[2]。攝入動物體內(nèi)的抗生素大多未能被充分吸收，約有60%～90%的抗生素以原型或代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排放到環(huán)境中，人為地增加了土壤或水體環(huán)境中抗生素含量[3，4]，提高了環(huán)境中抗性基因豐度，給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來長期、潛在的危害[5]。目前，畜禽糞便中抗生素的處理主要有好氧發(fā)酵和厭氧消化兩種途徑，大量研究表明，好氧發(fā)酵可以更有效地降解畜禽糞便中抗生素[6，7]。為了更有效地監(jiān)測畜禽糞便中抗生素殘留，提高抗生素在環(huán)境中的檢出效率，建立有效的前處理方法，減少基質(zhì)干擾，發(fā)展靈敏、可靠的分析技術(shù)是研究抗生素環(huán)境殘留的基礎(chǔ)。

目前，畜禽糞便中抗生素藥物殘留的檢測技術(shù)有酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）[8，9]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas chromatographymass spectrometry， GCMS）[10]、毛細(xì)管電泳分析技術(shù)（Capillary electrophoresis detection technique，CE）[11]、液相色譜技術(shù)（Liquid chromatography， LC）[12～14]和高效液相色譜質(zhì)譜（HPLCMS）[15]等。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)操作簡單，但對試劑的選擇性高，不能同時分析多種成分； 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)靈敏度高，且具有廣泛的譜庫，適合分析揮發(fā)性成分，缺點是測定前需要采用衍生化處理，操作繁瑣，穩(wěn)定性差； 毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)分辨率高，進(jìn)樣量少，保留時間短，但是靈敏度低，重現(xiàn)性差； 液相色譜檢測技術(shù)測定范圍廣， 可靈活調(diào)節(jié)流動相的組成和pH值，能夠使相當(dāng)數(shù)量極難分離的待測物質(zhì)得以測定，與質(zhì)譜檢測器串聯(lián)可以提高靈敏度和精確度，已成為應(yīng)用廣泛的檢測分析技術(shù)[16～18]。

本研究采用具有高靈敏度和高選擇性的固相萃取超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，建立了雞糞中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類等16種抗生素的快速檢測方法。經(jīng)優(yōu)化后，本方法以50%乙腈的磷酸鹽緩沖液提取3次，確保目標(biāo)物的提取效率； 同時采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，保證了樣品檢測的靈敏度。采用本方法優(yōu)化的提取液和旋蒸的凈化方式，得到的目標(biāo)物回收率更高，方法檢出限和定量限更低。結(jié)果表明，本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可在25 min內(nèi)完成糞便中四環(huán)素、磺胺、氟喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯類16種抗生素的同步提取與同時測定。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜、Thermo LTQ XL離子阱質(zhì)譜（美國Thermo公司）； Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，美國Thermo公司）； SAX陰離子交換柱（3 mL/200 mg，美國Thermo公司）； HLB小柱（6 mL/500 mg，美國Waters公司）； 十二孔固相萃取裝置（美國Supelco公司）； AvantiTMJ20XP離心機（美國Beckman Coulter公司）； NEVAPTM111氮吹儀（美國Organomation公司）； RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； QL901旋渦混合器（海門市其林貝兒儀器制造有限公司）。

目標(biāo)物鹽酸土霉素（OTC）、四環(huán)素（TC）、鹽酸金霉素（CTC）、強力霉素（DOX）、磺胺對甲氧嘧啶（SM）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺甲惡唑（SMX）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹噁啉（SQ）、諾氟沙星（NOR）、鹽酸環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、紅霉素（ERY）、羅紅霉素（ROX），均購于中國食品藥品檢定研究院； 泰樂菌素（TS）和醋酸鈉購于SigmaAldrich公司。

甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）； 實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）； Na2EDTA、Na2HPO4、HCl、NaOH、H3PO4等均為分析純。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液與緩沖溶液配制

將1 L 0.1 mol/L檸檬酸溶液和625 mL 0.2 mol/L Na2HPO4溶液混合，配制成McIlvaine 緩沖溶液。必要時用0.1 mol/L HCl或NaOH調(diào)至pH 4.00±0.05。將McIlvaine 緩沖溶液和乙腈溶液按1∶1（V/V）混合，制得提取液。

準(zhǔn)確稱取上述13種抗生素目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，以甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，配制成100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星用0.1%甲酸甲醇（1∶1，V/V）溶液溶解并定容至100 mL， 在endprint

Symbolm@@ 20℃保存。使用時，用0.1%甲酸甲醇（1∶1，V/V）稀釋至所需濃度。

2.3樣品的采集和樣品前處理

蛋雞和肉雞雞糞采集自北京市平谷、懷柔、密云、大興等地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)雞場，堆肥樣品采集自北京市懷柔區(qū)某堆肥廠，空白雞糞樣品（不含抗生素）采集自重慶市某農(nóng)家雞舍。

將采集的樣品自然風(fēng)干后，過2 mm孔徑篩，稱取1 g研磨樣品于50 mL離心管中，加入提取液10 mL，渦旋1 min，超聲提取15 min，8000 r/min離心10 min（10℃），上清液轉(zhuǎn)移至蒸餾瓶中。反復(fù)提取3次后，合并上清液。在35℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至乙腈完全揮發(fā)，用超純水稀釋至200 mL，加入0.4 g Na2EDTA，溶解以螯合陽離子。將HLB小柱和SAX小柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，用固相萃取適配器將SAX和HLB小柱串聯(lián)。開啟真空泵，控制流速約為3～5 mL/min，將提取液上柱。過柱完成后，用10 mL超純水沖洗串聯(lián)柱，抽氣干燥10 min，拆下SAX小柱，將HLB柱于N2保護(hù)下干燥10 min。最后，加入洗脫液（甲醇丙酮，80∶20，V/V）10 mL，收集洗脫液， 在35℃水浴下用N2吹至近干，加入1 mL 0.1%甲酸甲醇（1∶1，V/V）溶液， 渦旋1 min， 0.22 μm膜過濾后檢測。

2.4優(yōu)化的儀器工作條件

2.4.1色譜條件Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×3 μm），柱溫35℃； 進(jìn)樣體積： 15 μL； 流速： 0.35 mL/min。四元梯度泵，流動相A為0.1%（V/V）甲酸和5 mmol/L乙酸銨，流動相B為甲醇，流動相C為超純水，流動相D為含0.1%甲酸的乙腈溶液。采用流動相A、D，具體的線性梯度如下： 0 min，5% D； 0～4 min，5%～16% D； 4～8 min，16%～40% D； 8～15 min，40%～65% D； 15～20 min，65%～95% D； 20～25 min，5% D。

2.4.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜系統(tǒng)由Thermo LTQ XL檢測器和離子源組成。離子源： 電噴霧電離（ESI+）； 加熱溫度： 350℃； 鞘氣流速： 35 aribitrary unit（arb，自定義單位），輔助氣流速10 arb， 噴霧電壓3.5 kV， 離子傳輸管溫度： 350℃， Tube Lens電壓： 65 V； 檢測方式： SRM。各物質(zhì)的檢測參數(shù)見表1。

3結(jié)果與討論

3.1緩沖液種類的選擇

綜合考慮所檢測的16種抗生素的pKa[19]， 參考美國EPA推薦方法及文獻(xiàn)[20，21]， 分別以Na2HPO4、檸檬酸鈉和NaH2PO4與檸檬酸按一定比例配制McIlvaine 緩沖溶液， 與乙腈按1∶1（V/V）比例混合作為提取液， 提取400 μg/kg的加標(biāo)空白雞糞樣， 含乙腈的提取液用超純水稀釋至200 mL后過柱。如圖1所示， 以檸檬酸鈉作為緩沖液提取時， 四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類的平均回收率>60%， 但磺胺類和氟喹諾酮類的回收率<50%。以NaH2PO4作為緩沖溶液提取時， 四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類回收率>50%， 多數(shù)在60%～95%之間， 但是對氟喹諾酮類提取效率非常低。Na2HPO4作為緩沖溶液可以實現(xiàn)四類抗生素物質(zhì)的同時提取， 16種抗生素中回收率在48%～93%之間。因為在低pH值下， 目標(biāo)抗生素均以中性分子和陽離子態(tài)為主， 不易被SAX柱保留， 從而提高了目標(biāo)抗生素的回收率[22～25]。

3.2超聲功率優(yōu)化

在超聲功率分別為50、60和300 W下對抗生素進(jìn)行提?。▓D2）， 結(jié)果表明， 超聲波的空化作用可以增加有機相和水相間的接觸面積， 提高萃取速率， 但是超聲功率過大， 會導(dǎo)致待提取物降解， 影響抗生素的提取效果[26，27]。在超聲功率為60或300 W時， 磺胺類的回收率>50%， 而喹諾酮類的回收率低于10%。超聲功率為50 W時， 四大類抗生素的回收率在60%～97%之間， 提取效果最好。

3.3Na2EDTA用量對回收率的影響

在固相萃取前用超純水稀釋至200 mL， 分別加入0.2和0.4 g Na2EDTA螯合溶液中的陽離子（圖3）。結(jié)果表明， Na2EDTA的用量對四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類的回收率影響不大， 但是對氟喹諾酮類的回收率影響較大。Na2EDTA用量為0.2 g時， 氟喹諾酮類回收率約為20%； Na2EDTA用量為0.4 g時， 氟喹諾酮類回收率在58%～62%之間。這可能是由于Na2EDTA充分絡(luò)合糞便中的金屬離子， 減少抗生素與糞便中金屬離子鏊合， 增加了固相萃取柱對氟喹諾酮類抗生素的吸附， 從而提高了氟喹諾類抗生素的回收率[24]。

3.4方法的回收率

采用以上固相萃取條件優(yōu)化結(jié)果， 選取空白雞糞添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 添加水平分別為100和250 μg/kg， 每個添加水平取3個平行樣， 計算各目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）， 結(jié)果見表2。根據(jù)Matuszewski等[28]的方法， 絕對基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect）為樣品基質(zhì)提取后加標(biāo)除以純的標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到， 相對基質(zhì)效應(yīng)為選擇6個不同來源（豬糞、雞糞、牛糞、污泥、土壤和污水）樣品的基質(zhì)效應(yīng)， 計算變異系數(shù)得到相對基質(zhì)效應(yīng)。 16種抗生素的回收率為54.5%～97.9%， 方法相對偏差為2.6%～19.8%。與文獻(xiàn)[29]中四類抗生素加標(biāo)回收率42.3%～79.6%， 文獻(xiàn)[30]中磺胺類回收率47%～101%相比， 本方法的回收率明顯提高， 更有利于雞糞中抗生素的有效提取。

3.5方法學(xué)質(zhì)量控制endprint

配制添加水平為10～500 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述方法進(jìn)行實驗， 采用3倍信噪比計算檢出限（LOD）， 10倍信噪比計算定量限（LOQ）， 結(jié)果見表3。16種抗生素的檢出限為0.01～2.50 μg/kg， 定量限為0.05～7.90 μg/kg， 線性相關(guān)系數(shù)為0.9914～0.9996， 滿足定量分析要求。與文獻(xiàn)[29，31]的檢出限為0.1～2.8 μg/kg， 定量限為0.3～6.6 μg/kg相比， 本方法具有更高的檢測靈敏度。

3.6畜禽糞便樣品分析

樣品取自北京市郊區(qū)8個養(yǎng)雞場和2個堆肥廠， 共10個樣品。將采集的蛋雞和肉雞糞便樣品風(fēng)干后準(zhǔn)確稱取1 g，

按照2.3節(jié)前處理方法進(jìn)行操作， 利用2.4節(jié)設(shè)定的條件進(jìn)行UPLCMS/MS測定， 加標(biāo)雞糞樣品的HPLCMS總離子流圖如圖4所示， 樣品檢測結(jié)果見表4。4類抗生素在兩種糞便中均有不同程度檢出， 最多可同時檢出15種物質(zhì)。四環(huán)素類、磺胺類、氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯等四類抗生素的濃度范圍分別為： 蛋雞雞糞0.012～12.1 mg/kg， 0.0091～15.5 mg/kg， 0.0077～5.52 mg/kg， 0.0036～0.0436 mg/kg； 肉雞雞糞0.0792～11.6 mg/kg， 0.0064～3.12 mg/kg； 0.064～6.29 mg/kg， 0.0034～23.3 mg/kg。成品肥中四環(huán)素類、磺胺類、氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯等四類抗生素的濃度范圍分別為0.0078～0.536 mg/kg、0.0057～0.0324 mg/kg、0.0137～0.0404 mg/kg、0.024～0.0722 mg/kg， 其中TC、CIP和TS在好氧發(fā)酵過程中被完全降解， 說明好氧發(fā)酵可以有效消減抗生素的種類和含量， 減少畜禽糞便中抗生素對生態(tài)環(huán)境造成的危害。

4結(jié) 論

采用50%乙腈的磷酸鹽緩沖溶液提取， UPLCMS/MS檢測， 外標(biāo)法定量， 在10～500 μg/kg添加水平下， 16種抗生素在糞便中的平均回收率為54.5%～97.9%； 在雞糞樣品中總抗生素檢出的濃度范圍為0.0337～23.3 mg/kg， 經(jīng)過好氧發(fā)酵后總抗生素最高濃度殘留量為0.536 mg/kg， 說明好氧發(fā)酵是一種可以消減畜禽糞便中抗生素殘留污染的有效途徑。樣品經(jīng)過好氧發(fā)酵后， 四大類抗生素均有不同程度消減， 有的抗生素被完全去除， 如TC、CTC、SM、CIP和TS在高溫好氧發(fā)酵過程中被降解至檢出限以下。本方法靈敏度高， 檢出限低， 穩(wěn)定性好， 可用于畜禽糞便中抗生素含量的分析檢測。

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Ultra Performance Liquid ChromatographyTandem Mass

Spectrometry Analysis of 16 Kinds of Residual

Antibiotics in Chicken Manure

WU Dan1，2， HAN MeiLin2， ZOU DeXun1， WANG XuMing2， GAO Min2， QIU TianLei*2

1（Department of Environmental Science and Engineering， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 10029， China）endprint

2（Beijing AgroBiotechnology Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China）

AbstractA sensitive and effective method for determination of 16 kinds of antibiotics， including tetracycline， sulfonamide， fluoroquinolone and macrolide， in livestock and poultry manure using solid phase extractionultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was established. Aiming at the chemical properties and sample impurities of the target， the parameters such as mass spectrum conditions， types of extraction and ultrasonic power were optimized. Finally， the samples were extracted with 50% acetonitrile in phosphate buffer solution （pH = 4） for three times， followed by ultrasonic steaming， centrifugal and rotary， dilution， and purified by SAXHLB. After sample loading， the solid phase was washed with 10 mL of methanolacetone （80∶20， V/V）， evaporated to near dryness at 35℃， and then redissolved and vortex mixed in 1 mL of 0.1% formic acid∶methanol （1∶1， V/V）. The extracts were analyzed with UPLCMS/MS and calculated by external standard method based on the monitored product ion. The results indicated that the average spiked recoveries of tetracycline， sulfonamide， fluoroquinolone and macrolide in manure were 56.4%-94.6% with relative standard deviations （RSDs） of 2.6%-19.8%， the LODs （S/N=3） were 0.01-2.50 μg/kg， and the LOQs （S/N=10） were 0.05-7.90 μg/kg. The method was simple with high stability， high sensitivity and good reproducibility， and suitable for the simultaneously determination of many antibiotics in animal and poultry manure.

KeywordsTetracycline； Sulfonamide； Fluoroquinolone； Macrolide； Solidphase extraction； Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Animal and poultry manure

（Received 20 March 2017； accepted 24 June 2017）

This work was supported by the Natural Science Foundation of Beijing， China （No.BAIC042017）， the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China （No.2016YFD0800205）， Key Research and Development Plan of Ministry of Science and Technology of China（No. 2017YFD0801402）and National Natural Science Foundation of China（No. 51308022）.endprint