油酸對C57/BL6J小鼠脂肪干細胞體外成脂分化的影響

張 靖 偉， 姚 英 俊， 梁 媛， 王 晗， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

油酸對C57/BL6J小鼠脂肪干細胞體外成脂分化的影響

張 靖 偉1， 姚 英 俊2， 梁 媛1， 王 晗2， 王 際 輝2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

對C57/BL6J小鼠脂肪干細胞進行原代培養(yǎng)，通過流式細胞術(shù)鑒定細胞表面抗原標志物。體外培養(yǎng)條件下，在成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入不同濃度的油酸處理小鼠ADSCs 3 d，倒置顯微鏡下觀察ADSCs的形態(tài)變化，油紅O染色觀察胞質(zhì)中脂滴的聚集，并測定細胞中甘油三酯總量。結(jié)果表明，誘導(dǎo)3 d后，油酸處理組細胞胞體顯著增大，形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，胞質(zhì)內(nèi)脂滴顯著增多；油紅O染色細胞中可見大量紅色的脂滴染色。各濃度油酸處理組細胞胞漿內(nèi)甘油三酯總量增多，顯著高于對照組，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。說明油酸可促進小鼠ADSCs體外成脂分化。

油酸；脂肪干細胞；成脂分化

Abstract: Adipose-derived stem cells (ADSCs) from C57/BL6J mice were primary cultured and cell surface antigen markers were identificated by flow cytometry. ADSCs were treated with different concentration of oleic acid for 3 d. The morphological changes of ADSCs were observed and the differentiation level was assayed by oil red O staining and cellular triglyceride content was detected to confirm the degree of adipogenic differentiation. The cells increased in volume and lipid droplets in cytoplasm became round after stimulating for 3 d at different oleic acid concentrations. The cellular TG content was significant higher in oleic acid-treated cells than that in control group. The cells treated with oleic acid augmented cellular TG content in a dose dependent manner. The results suggested that oleic acid could promote adipogenic differentiation of C57/BL6J mice adipose-derived stem cellsinvitro.

Keywords: oleic acid; adipose-derived stem cells; adipogenic differentiation

0 引 言

日常膳食中的脂肪酸是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)。脂肪酸在攝入人體后可以形成甘油三酯儲存起來，為人體提供能量。脂肪酸在體內(nèi)還能以磷脂的形式參與細胞膜系統(tǒng)的組成[1]。此外，部分脂肪酸及其代謝產(chǎn)物具有重要的生物活性，可以參與形成類固醇激素等信號分子來發(fā)揮重要的生理調(diào)控作用[2]，如調(diào)節(jié)代謝、抗腫瘤以及與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。

肥胖是由多種因素引起的一種慢性代謝疾病[3]。對于兒童和青少年來說，肥胖的發(fā)生往往伴隨著脂肪細胞數(shù)目的增多和體積的增大[4]。脂肪細胞的數(shù)目增多是脂肪前體細胞成脂分化的結(jié)果，成脂分化在肥胖的發(fā)生過程中扮演著重要角色。脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是一類存在于脂肪組織中的干細胞，Zuk等[5]于2001年首次在人脂肪組織抽提物中發(fā)現(xiàn)。脂肪干細胞具有容易獲取、增殖迅速和多向分化潛能等明顯優(yōu)勢，因而被廣泛應(yīng)用于成脂分化研究中[6]。

在組成人體的脂肪酸中，十八碳烯酸是一類含量豐富的脂肪酸。在十八碳烯酸中，油酸(順9-十八碳一烯酸)是一種主要的脂肪酸。此外，油酸也同樣廣泛存在于動植物來源的食用油中，是食用油主要的組成成分[7]。目前一些研究結(jié)果表明，油酸可以有效保護心腦血管系統(tǒng)[8-9]。動物實驗表明，與魚油相比，長期攝入油酸豐富的橄欖油會引起實驗動物的肥胖[10]。但是，油酸引起肥胖的作用機制尚未見報道。

本實驗應(yīng)用C57/BL6J小鼠脂肪干細胞，以不同濃度的油酸干預(yù)脂肪干細胞成脂分化，探究了油酸對脂肪干細胞成脂分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8周齡雄性C57/BL6J小鼠，大連醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心。

油酸、硬脂酸，美國Cayman化學(xué)公司；DMEM/F12細胞培養(yǎng)液，美國Thermo Fisher公司；胎牛血清(FBS)，天津灝洋生物制品有限公司；MTT、牛胰島素，上海源葉生物科技有限公司；油紅O，美國Sigma公司；地塞米松，北京索萊寶科技有限公司；吲哚美辛，上海阿拉丁試劑；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標儀，Multiskan GO，美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡，IX81，日本奧林巴斯公司；流式細胞儀，F(xiàn)ACSAria Ⅲ，美國BD。

1.3 方 法

1.3.1 脂肪干細胞原代培養(yǎng)

脂肪干細胞的分離操作參考Zuk等[11]的方法并稍加改動。取8周齡雄性C57/BL6J小鼠，斷頸法處死，將鼠體浸入75%酒精消毒，無菌操作下取腹股溝脂肪墊，放在含有2%青鏈霉素的PBS中清洗多次，剔除肉眼可見的筋膜和血管，將組織盡量剪碎，將等體積的0.1%的Ⅰ型膠原酶加入組織塊中，37 ℃下恒溫消化40 min，每隔10 min用膠頭滴管吹打組織塊若干次，最后加入等體積的細胞培養(yǎng)基終止消化。400g離心5 min，棄去上層的脂肪細胞，沉淀物用PBS洗2次，最后用含10%胎牛血清重懸，70 μm細胞過濾網(wǎng)過濾，接種細胞于T-25細胞培養(yǎng)瓶中。將細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，每隔3 d更換培養(yǎng)基。

1.3.2 脂肪干細胞的鑒定

采用流式細胞術(shù)鑒定細胞的表面抗原標志。待細胞傳至第三代，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，用含有2% CD29和CD34一抗的PBS在4 ℃ 下孵育細胞30 min。孵育結(jié)束后，用PBS洗細胞2次，調(diào)整細胞量至1×106個/mL，將細胞用0.2 mL 的PBS重懸，最后用70 μm尼龍濾網(wǎng)過濾后上機分析。

1.3.3 油酸的濃度篩選

收集三代以后的細胞，在96孔板以1×105個/孔的密度接種細胞。待細胞融合至90%，將細胞培養(yǎng)基換成含1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰島素、100 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L IBMX、10% FBS的DMEM/F12的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，分別用20、40、60、80 μmol/L油酸作用細胞3 d，以同樣濃度的硬脂酸為對照。誘導(dǎo)3 d 后，每孔加入5 mg/mL的MTT，于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸棄液體，每孔加入150 μL DMSO，靜置10 min后，在酶標板中于570 nm下測量吸光度。

1.3.4 油酸對脂肪干細胞的干預(yù)處理

將細胞接種于96孔板中，待細胞融合至90%，更換培養(yǎng)基為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以終濃度為0、20、40、60 μmol/L的油酸干預(yù)脂肪干細胞分化3 d，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。

1.3.5 脂滴油紅O染色

取出終止誘導(dǎo)的細胞，在每孔中加入適量10%中性甲醛，室溫下固定細胞30 min。向每孔中加入適量的2%油紅O，室溫下染色15 min。再將各孔加入0.3%的蘇木精染液，室溫下復(fù)染15 min。再向各孔中加入1%碳酸氫鈉返藍5 min。返藍結(jié)束后，吸棄各孔碳酸氫鈉溶液，用PBS清洗各孔后，在鏡下觀察細胞油紅O染色程度。

1.3.6 胞質(zhì)甘油三酯含量的測定

按照“1.3.4”的方法，用脂肪酸干預(yù)細胞成脂分化3 d，每孔中加入100 μL的SDS細胞裂解液，收集細胞，在冰上進行超聲裂解(38 W，2 s/次，2 min)。按照甘油三酯測定試劑盒說明書的操作，37 ℃下孵育5 min，546 nm波長下測定吸光度。用甘油標準品作標準曲線，根據(jù)所測樣品的吸光度，計算樣品甘油三酯的實際濃度。

1.3.7 細胞總蛋白測定

按照BCA法測定總蛋白試劑盒說明書的方法，將各試劑和樣品混合，37 ℃下孵育30 min，在562 nm波長下測量吸光度。作標準曲線，根據(jù)所測樣品的吸光度，計算樣品蛋白的實際濃度。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用(平均數(shù)±標準差)表示，應(yīng)用SPSS 22.0對多組均數(shù)進行單因素方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 細胞鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，從脂肪組織分離接種的細胞3 d后貼壁呈纖維細胞樣，培養(yǎng)7 d后細胞達到80%以上融合。經(jīng)過若干次傳代后細胞仍為梭形，增殖迅速，生長排列呈漩渦狀，部分細胞集落出現(xiàn)層疊交錯生長，未出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，分離出的細胞符合脂肪干細胞形態(tài)學(xué)特征。

圖1 C57/BL6J小鼠脂肪干細胞Fig.1 Adipose-derived stem cells of C57/BL6J mice

2.1.2 細胞表面抗原標志鑒定

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，分離出的細胞高表達CD29，未表達CD34。說明分離出的細胞表面抗原標志符合脂肪干細胞的表面標志特征。

(a) CD29直方圖

(b) CD34直方圖

(c) CD29散點圖

(d) CD34散點圖

圖2 細胞表面抗原標志鑒定

Fig.2 Identification of cell surface marker

2.2 脂肪酸濃度的篩選

應(yīng)用MTT法確定合適的脂肪酸作用濃度，結(jié)果如圖3所示，在20、40、60 μmol/L的油酸濃度作用下，各濃度組間吸光度沒有顯著差異(P>0.05)，但在80 μmol/L，吸光度有顯著下降(P<0.01)；在相同濃度的硬脂酸作用下，各濃度組間吸光度有顯著差異(P<0.01)。實驗結(jié)果表明，油酸在20、40、60 μmol/L下，對分化期間的細胞沒有毒性作用；相同濃度的硬脂酸對分化細胞的有毒性作用，并且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖3 油酸和硬脂酸對細胞活力的影響Fig.3 Effects of oleic acid and stearic acid on cell viabilities

2.3 油酸濃度對脂肪干細胞成脂分化的影響

在細胞分化的過程中，用不同濃度(20、40、60 μmol/L) 的油酸分別作用細胞3 d，應(yīng)用油紅O染色觀察細胞的成脂分化情況，結(jié)果如圖4所示。與未分化的細胞相比，處于分化階段的細胞胞體變大，開始變圓，胞質(zhì)中開始出現(xiàn)明顯的脂滴。經(jīng)過油酸處理后，胞質(zhì)中的脂滴顯著多于未經(jīng)油酸處理的細胞。隨著油酸濃度的增加，胞質(zhì)中脂滴的含量也隨之增加。油紅O染色結(jié)果表明，油酸能夠顯著促進細胞胞漿中脂質(zhì)的積累，促進細胞成脂分化。

2.4 油酸對胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分數(shù)的影響

以甘油三酯占細胞總蛋白的質(zhì)量摩爾濃度對細胞成脂分化程度進行定量。如圖5所示，與油紅O染色的結(jié)果相似，經(jīng)過油酸處理后的細胞胞質(zhì)內(nèi)甘油三酯含量顯著提高，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。與未處理組相比，油酸處理3 d后，20、40、60 μmol/L 濃度下的細胞胞漿內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分數(shù)分別提高了95.9%、294.7%和341.2%。實驗結(jié)果進一步表明，油酸能夠顯著促進脂肪干細胞體外成脂分化，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖5 油酸濃度對細胞中甘油三酯質(zhì)量分數(shù)的影響

Fig.5 Effect of oleic acid concentration on TG accumulation during cell differentiation

3 結(jié) 論

本實驗通過原代培養(yǎng)，獲得了可以穩(wěn)定傳代的脂肪干細胞，并在成脂分化期間用不同濃度的油酸處理脂肪干細胞，通過油紅O染色和胞內(nèi)甘油三酯測定法分析發(fā)現(xiàn)油酸可以在體外顯著地促進脂肪干細胞成脂分化，并且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，提示大量攝入油酸可能與肥胖有關(guān)。

脂肪細胞分化是一個由眾多轉(zhuǎn)錄因子參與的過程[14-17]。其中過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ) 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，具有很強的脂肪細胞專一性，若被激活，則會發(fā)生強烈的成脂分化作用[18]。有文獻證實，棕櫚油酸可以以通過激活PPARγ來促進3T3-L1前脂肪細胞成脂分化[19]。此外，一些脂肪酸可以作為信號分子對Wnt/β-catenin[20]和Notch[21]等與成脂分化相關(guān)的細胞信號通路進行調(diào)控來發(fā)揮相應(yīng)的作用。因此，油酸是否能夠通過激活PPARγ和調(diào)控上述相關(guān)信號通路來促進脂肪干細胞成脂分化有待進一步研究。

[1] 王鏡巖,朱勝庚,徐長法.生物化學(xué)[M].3版.北京:高等教育出版社,2002.

[2] ORTEGA L, GARCIA-ANGUITA A, RIESTRA P, et al. Plasma non-esterified fatty acid levels in children and their relationship with sex steroids[J]. Steroids, 2014, 88: 15-18.

[3] 曲伸,陸灝.肥胖分類的重新思考與基于代謝的個體化診斷[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2015(8):655-658.

[4] KNITTLE J L, TIMMERS K, GINSBERG-FELLNER F, et al. The growth of adipose tissue in children and adolescents. Cross-sectional and longitudinal studies of adipose cell number and size[J]. Journal of Clinical Investigation, 1979, 63(2): 239-246.

[5] ZUK P A, ZHU M, MIZUNO H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies[J]. Tissue Engineering, 2001, 7(2): 211-228.

[6] ZUK P A. The adipose-derived stem cell: looking back and looking ahead[J]. Molecular Biology of the Cell, 2010, 21(11): 1783-1787.

[7] 魏永生,鄭敏燕,耿薇,等.常用動、植物食用油中脂肪酸組成的分析[J].食品科學(xué),2012(16):188-193.

[8] TERES S, BARCELO-COBLIJN G, BENET M, et al. Oleic acid content is responsible for the reduction in blood pressure induced by olive oil[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(37): 13811-13816.

[9] COVAS M. Olive oil and the cardiovascular system[J]. Pharmacological Research, 2007, 55(3): 175-186.

[10] BUETTNER R, PARHOFER K G, WOENCKHAUS M, et al. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and molecular effects of different fat types[J]. Journal of Molecular Endocrinology, 2006, 36(3): 485-501.

[11] ZUK P A, ZHU M, ASHJIAN P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. Molecular Biology of the Cell, 2002, 13(12): 4279-4295.

[12] LI G, YAO W, JIANG H. Short-chain fatty acids enhance adipocyte differentiation in the stromal vascular fraction of porcine adipose tissue[J]. Journal of Nutrition, 2014, 144(12): 1887-1895.

[13] BROWN J M, HALVORSEN Y D, LEA-CURRIE Y R, et al. Trans-10, cis-12, but not cis-9, trans-11, conjugated linoleic acid attenuates lipogenesis in primary cultures of stromal vascular cells from human adipose tissue[J]. Journal of Nutrition, 2001, 131(9): 2316-2321.

[14] PRINS J B, O'RAHILLY S. Regulation of adipose cell number in man[J]. Clinical Science, 1997, 92(1): 3-11.

[15] UMEK R M, FRIEDMAN A D, MCKNIGHT S L. CCAAT-enhancer binding protein: a component of a differentiation switch[J]. Science, 1991, 251(4991): 288-292.

[16] AILHAUD G. Early adipocyte differentiation[J]. Biochemical Society Transactions, 1996, 24(2): 400-402.

[17] BRUN R P, KIM J B, HU E, et al. Adipocyte differentiation: a transcriptional regulatory cascade[J]. Current Opinion in Cell Biology, 1996, 8(6): 826-832.

[18] HALLENBORG P, PETERSEN R K, FEDDERSEN S, et al. PPARγ ligand production is tightly linked to clonal expansion during initiation of adipocyte differentiation[J]. Journal of Lipid Research, 2014, 55(12): 2491-2500.

[19] BOLSONI-LOPES A, FESTUCCIA W T, FARIAS T S M, et al. Palmitoleic acid (n-7) increases white adipocyte lipolysis and lipase content in a PPAR -dependent manner[J]. AJP: Endocrinology and Metabolism, 2013, 305(9): E1093-E1102.

[20] CHRISTODOULIDES C, LAGATHU C, SETHI J K, et al. Adipogenesis and WNT signalling[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism, 2009, 20(1): 16-24.

[21] BI P, SHAN T, LIU W, et al. Inhibition of notch signaling promotes browning of white adipose tissue and ameliorates obesity[J]. Nature Medicine, 2014, 20(8): 911-918.

EffectofoleicacidonadipogenicdifferentiationofC57/BL6Jmiceadipose-derivedstemcellsinvitro

ZHANG Jingwei1, YAO Yingjun2, LIANG Yuan1, WANG Han2, WANG Jihui2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

TS201.4

A

1674-1404(2017)05-0333-05

2016-03-21.

國家自然科學(xué)基金項目(31371764, 31370554)；遼寧省自然科學(xué)基金項目(2014026016).

張靖偉(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：王 晗(1972-)，女，副教授.

張靖偉,姚英俊,梁媛,王晗,王際輝.油酸對C57/BL6J小鼠脂肪干細胞體外成脂分化的影響[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,36(5):333-337.

ZHANG Jingwei, YAO Yingjun, LIANG Yuan, WANG Han, WANG Jihui. Effect of oleic acid on adipogenic differentiation of C57/BL6J mice adipose-derived stem cellsinvitro[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 333-337.