姬松茸子實體多糖高速剪切提取及其抗氧化活性

劉曉慶 秦春青 孫培龍 張安強

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姬松茸子實體多糖高速剪切提取及其抗氧化活性

劉曉慶 秦春青 孫培龍 張安強*

（浙江工業(yè)大學食品科學技術系，浙江杭州 310014）

姬松茸多糖具有顯著的抗腫瘤、抗疲勞、抗突變、抗氧化等功能。為提高姬松茸多糖得率、縮短提取時間，而采用高速剪切提取技術從姬松茸子實體中提取多糖。在單因素試驗的基礎上，根據(jù)中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面分析法優(yōu)化提取工藝。最終確定最佳提取條件為液料比27 mL/g，轉速22 000 r/min，剪切時間6.60 min，此時多糖實際得率為（12.33±0.020）%，與預測值12.48%相近。并通過乙醇梯度沉淀獲得ABM40、ABM60、ABM80 3個姬松茸多糖組分，進而對其進行體外抗氧化活性測定。結果表明，3個多糖組分均表現(xiàn)出良好的ABTS自由基和DPPH自由基的清除能力，且具有一定的還原力。

姬松茸；多糖；高速剪切提取；抗氧化

姬松茸（Murill，ABM）又名巴西蘑菇，原產(chǎn)于巴西，是一種藥食兼用的珍稀食用菌，在巴西和日本常用來治療癌癥、心臟病、肥胖癥等疾病[1,2]。大量研究表明：姬松茸多糖具有顯著的抗腫瘤[3]、抗疲勞[4]、抗突變[5]、抗氧化[6]等功能。因此，提高和簡化姬松茸多糖的提取工藝對有效利用姬松茸資源至關重要。目前，提取姬松茸多糖的常用方法有熱水浸提、復合酶提取、微波或超聲波輔助提取等[7～9]，熱水浸提法雖操作簡單但耗時過長；復合酶提取雖條件溫和、雜質易除，但酶易失活且成本較高；微波或超聲波輔助提取縮短了提取時間，然而仍需數(shù)小時。高速剪切技術作為近年來發(fā)展起來的一種均質化技術，已廣泛用于天然產(chǎn)物提取、分離和改性方面[10]。它主要通過負壓、剪切、高速碰撞等各種外力作用使原料中的有效成分迅速擴散到溶劑中，在短時間內達到溶解平衡[11]。李麗等利用高速剪切技術破碎油菜蜂花粉細胞壁，使花粉破壁率達到99%以上，并提高了其黃酮提取率[12, 13]。魏鑒騰等采用高速剪切技術輔助提取滸苔多糖，剪切時間80 s，剪切3次便可使多糖得率達到17.19%[10]，大大縮短了提取時間。而高速剪切技術應用于姬松茸子實體多糖提取仍未見報道。

本文在單因素試驗的基礎上，根據(jù)中心組合試驗設計原理，利用響應面分析法優(yōu)化提取工藝，最終確定最佳提取工藝；并通過乙醇梯度沉淀獲得ABM40、ABM60、ABM80三個姬松茸多糖組分，進而對其體外抗氧化活性進行了測定。

1 實驗材料與試劑、儀器

1.1 實驗材料與試劑

姬松茸子實體由杭州百山祖生物科技有限公司提供，浙江省農業(yè)科學院蔡為明研究員鑒定；葡萄糖標準品、ABTS、DPPH，為美國Sigma公司產(chǎn)品；苯酚、濃硫酸、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、3,5-二硝基水楊酸等其他化學試劑，為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器

AL-104電子天平（METTLER TOLEDO有限公司），F(xiàn)A25型高剪切分散乳化機（上海弗魯克流體機械制造公司），V-1800PC型可見分光光度計（上海美譜達儀器公司），CR21GII型高速冷凍離心機（日本Hitachi（日立）公司），RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 姬松茸子實體多糖提取

姬松茸子實體經(jīng)95%乙醇脫脂干燥后，粉粹，并以水為溶劑，在一定液料比和轉速下高速剪切提取。提取液以10 000 r/min速率離心10 min，棄去沉淀收集上清液。上清液旋轉蒸發(fā)濃縮至體積為原體積的1/10后即得粗多糖濃縮液。濃縮液經(jīng)Sevag法除去蛋白（重復6次）后向其加入95%乙醇使乙醇濃度分別達到40%、60%、80%，各組分離心所得沉淀命名為ABM40、ABM60、ABM80；加水復溶，揮干殘留的乙醇后冷凍干燥可得3個組分的多糖粗提物。

2.2 姬松茸子實體多糖高速剪切提取條件優(yōu)化

（1）單因素試驗。對液料比（10、15、20、25、30 mL/g）、轉速（13 000、16 000、19 000、22 000、25 000 r/min）、剪切時間（1、2、4、6、8 min）進行單因素試驗，分別考察這3個因素對姬松茸子實體多糖得率的影響并初步確定各因素的取值范圍。

（2）響應面實驗。在單因素試驗基礎上，用Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，進行3因素3水平的實驗設計，獲取最優(yōu)提取工藝條件。

（3）姬松茸子實體多糖含量的測定。用苯酚硫酸法[14]和DNS法[15]分別測定姬松茸子實體粗多糖的總糖含量和還原糖含量，按式（1）計算即得姬松茸子實體的多糖含量。

多糖含量 = 總糖含量-還原糖含量（1）

（4）姬松茸子實體多糖得率的計算：

得率（%）=（2）

2.3 姬松茸子實體粗多糖（ABM40、ABM60、ABM80）的體外抗氧化活性實驗

（1）ABTS 自由基清除能力[16]。取8 mL 7 mmol/L ABTS與141 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，在4 ℃下避光反應12～16 h，用pH=7.4的磷酸緩沖液將ABTS自由基溶液稀釋至OD=0.7±0.02備用。

各取1 mL不同濃度的粗多糖溶液于試管中，各加入3 mL ABTS自由基溶液，在30 ℃下，避光反應5 min，于734 nm處測定吸光值。以蒸餾水為參比溶液，Vc作為陽性對照組。

ABTS自由基清除率（%）=

式（3）中：A0為空白對照組的吸光值；Ai為樣品測定管的吸光值；Aj為樣品本底管的吸光值。

（2）DPPH自由基清除能力[17]。各取3 mL不同濃度的粗多糖溶液于試管中，加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，密封混勻，在25 ℃條件下恒溫避光反應1 h，并在517 nm處測定吸光值。以甲醇溶液為參比溶液，Vc作為陽性對照組。

DPPH羥基自由基清除率（%）=

式（4）中：A0為空白對照組的吸光值；Ai為樣品測定管的吸光值；Aj為樣品本底管的吸光值。

（3）還原力的測定[18]。各取2.5 mL不同濃度的粗多糖溶液于試管中，加入2.5 mL磷酸緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L）和2.5 mL 1 %的鐵氰化鉀溶液，振蕩均勻， 50 ℃反應20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應。室溫離心（8 000 r/min，10 min）后，取上清液2 mL于試管中，加入2 mL 蒸餾水和0.4 mL 0.1%氯化鐵溶液，搖勻后反應10 min 在700 nm處測定吸光值。以蒸餾水為參比溶液，Vc作為陽性對照組。

還原力=Ai－A0（5）

式（5）中：A0為空白對照組的吸光值；Ai為樣品測定管的吸光值。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

（1）不同液料比的多糖得率。取10 g 姬松茸子實體粉末，按不同液料比（10、15、20、25、30 mL/g）加入蒸餾水，在25 000 r/min的轉速下室溫剪切提取6 min，提取液經(jīng)離心（10 000 r/min，10 min）后取上清液測其多糖含量。由圖1可知，多糖的得率隨液料比的增大而大幅度提高，但當液料比大于25 mL/g時，得率趨于穩(wěn)定。因此，選用液料比20、25、30 mL/g為響應面實驗中料液比的因素水平。

（3）不同剪切時間的多糖得率。取10 g 姬松茸子實體粉末，按液料比為20 mL/g加入蒸餾水，在25 000 r/min轉速下，以不同的剪切時間（1、2、4、6、8 min）進行提取，提取液經(jīng)離心（10 000 r/min，10 min）后取上清液測其多糖含量。由圖3可知，當剪切時間小于4 min時，得率隨剪切時間的增加而增加，大于6 min 后其得率基本不變，說明繼續(xù)延長剪切時間對提高多糖得率無明顯作用。因此選用剪切時間4、6、8 min 進一步進行響應面實驗。

圖1 不同料液比對多糖得率的影響

圖2 轉速對多糖得率的影響

圖3 剪切時間對多糖得率的影響

3.2 響應面分析實驗結果與分析

（1）分析因素的選取及分析方案。根據(jù)單因素實驗結果，運用Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，采用表1所示的因素水平進行響應面實驗設計。以A、B、C為自變量，姬松茸多糖的得率為響應值Y，實驗方案和結果如表2所示；一共17組實驗，其中10 ~ 14 為中心試驗，其他為析因試驗。

（2）回歸方程的建立及顯著性檢驗。對實驗結果進行多元回歸擬合后得到一個二次多項回歸方程：

Y=12.38+0.14A+0.29B+0.13C+0.080AB+0.098AC-0.025BC-0.23A2-0.49B2-0.27C2

回歸方程的方差分析見表3。方差分析可用來評估預測模型的準確性，各項系數(shù)的顯著性可由F值和P值檢驗，P值越小越顯著[19]。回歸模型的F=89.54（P <0.0001），說明模型極顯著；失擬項F=0.68（P=0.6082>0.05）以及R2=0.9914，R2adj=0.9803，更進一步說明此數(shù)學模型可以用來預測高速剪切提取姬松茸多糖的實驗結果及最優(yōu)提取條件。

表1 響應面分析實驗因素水平

表2 響應面設計方案及實驗結果

由表3可知，液料比、轉速、剪切時間的一次項均達到極顯著水平（P<0.001）。此外液料比和轉速，液料比和剪切時間的交互作用也達到顯著水平（P<0.05）。由F值可得出，各因素對姬松茸多糖的得率影響次序為轉速>液料比>剪切時間。

（3）響應面分析。圖4～6為各交互因素的等高線圖和響應面圖，反映了各因素的交互作用

與類似，當和分別等于零時，式(12)中的P、Lv和Mv分別為0，可得其交點軸線T-Map的3維空間域邊界方程分別為：

對響應值的影響。等高線圖的形狀可用來判斷因素間交互作用是否顯著，橢圓形表示因素間交互作用顯著，而圓形則反之[20]。從圖4a、圖5a可以看出AB、AC因素間交互作用顯著，而圖6a中的BC因素間交互作用不顯著。

表3 回歸方程各項方差分析

注： ***表示p<0.001水平顯著，**表示0.001

（4）最佳工藝條件的確定。由Design Expert 8.0 軟件可得提取姬松茸多糖的最佳工藝條件為液料比27.12 mL/g，轉速22 959.37 r/min，剪切時間6.59 min，此時多糖得率為12.48%?？紤]實際情況及操作的可行性，確定最佳提取條件為液料比27 mL/g、轉速22 000 r/min、剪切時間6.60 min。在此條件下，重復3次驗證實驗，得實際多糖得率為（12.33±0.020）%，與預測值12.48%相近。說明該模型可靠，可預測實際的實驗結果。

3.3 體外抗氧化活性實驗結果與分析

（1）ABTS 自由基清除能力。ABTS自由基清除法目前已被廣泛應用于生物樣品的總抗氧化能力的測定。ABTS經(jīng)氧化可生成相對穩(wěn)定的藍綠色ABTS自由基水溶液，若與抗氧化劑反應可使其溶液褪色，溶液顏色褪色越明顯，說明該物質的抗氧化能力越強[21]。姬松茸子實體粗多糖ABM40、ABM60、ABM80 的ABTS 自由基清除能力如圖7所示：在一定濃度范圍內，ABM40、ABM60、ABM80的ABTS 自由基清除能力均與其濃度呈正相關關系；ABTS 自由基清除能力由大到小的順序為Vc>ABM80>ABM60>ABM40；當濃度大于1.5 mg/mL時，3個組分的ABTS 自由基清除率接近100%，說明姬松茸子實體粗多糖具有較好的ABTS 自由基清除能力。

（2）DPPH自由基清除能力。DPPH自由基是一個以氮為中心的脂溶性自由基，在電子供體即抗氧化劑的存在下，穩(wěn)定的DPPH自由基由紫色轉化為黃色[22，23]。由圖8可知，當樣品濃度小于1.2 mg/mL時，DPPH自由基清除能力大小順序為Vc>ABM80>ABM60>ABM40；而當濃度大于1.5 mg/mL，DPPH自由基清除能力大小順序改變?yōu)閂c>ABM40>ABM60>ABM80，并且ABM40組分在濃度為1.8 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達到86.24 %。

（3）還原力的測定。抗氧化劑能夠通過自身的還原作用給出電子使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性；還原力越大，抗氧化能力就越強，因此可根據(jù)Fe3+還原為Fe2+的多少來間接評價樣品的抗氧化能力[24]。圖9顯示3個組分的還原力均具有濃度依賴性，其隨樣品濃度的增加而增強，ABM80組分的還原力最強，ABM60，ABM40為最弱。

圖7 ABTS 自由基清除能力

圖8 DPPH自由基清除能力

圖9 還原力

4 結 論

本研究將高速剪切技術首次應用于姬松茸子實體多糖的提取，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化提取工藝，最終確定最佳提取條件為液料比27 mL/g、轉速22 000 r/min、剪切時間6.60 min。在此條件下，多糖實際得率為（12.33±0.020）%，與預測值12.48 %相近。此方法與傳統(tǒng)提取方法——熱水浸提相比，不僅提高了多糖的得率，大大縮短了提取時間，而且還可在常溫水環(huán)境中提取，減少能耗。通過乙醇梯度沉淀獲得ABM40、ABM60、ABM80 3個姬松茸多糖組分，體外抗氧化活性實驗結果表明：3個多糖組分均表現(xiàn)出良好的ABTS自由基、DPPH自由基清除能力，且具有一定的還原力。本研究以期為將姬松茸多糖工業(yè)化生產(chǎn)應用于保健食品提供一定的理論基礎。

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Optimization of polysaccharides extraction fromMurill by high-speed shear technique and their antioxidant activities

Liu Xiaoqing Qin Chunqing Sun Peilong Zhang Anqiang*

( Department of Food Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China )

Polysaccharides fromMurill have remarkable functions, such as antitumor, antifatigue, antimutagen, antioxidant and so on. In order to improve the extraction yield and shorten the extraction time, HSDE (High-Speed Shear Dispersing Emulsifier) is used to extract polysaccharides fromMurill. The extraction parameters were optimized by using a three-variable-three-level Box-Behnken design and a response surface methodology (RSM) based on the single-factor experiments. The optimum conditions were predicted as follows: ratio of water to raw material 27 mL/g; rotate speed 22000 r/min; extraction time 6.60 min, and the highest extraction yield reached 12.33±0.020% under these conditions, which was in good agreement with the predicted value 12.48 %. In addition, three fractions (ABM40, ABM 60 and ABM80) were obtained by the ethanol precipitation method and showed appreciable antioxidant potential on ABTS radical scavenging activity, DPPH radical scavenging capacity and a certain reducing power.

Murill; polysaccharides; high-speed shearing; antioxidant

S646

A

2095-0934（2017）02-113-07

國家自然基金項目“姬松茸α-葡聚糖綴合物高持水性特征內在分子機制研究”（31671813）

劉曉慶（1992-），女，研究生

張安強，男，副教授。E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn