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    HPLC測(cè)定玉米中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A

    2017-10-11 08:06:32鄭睿行周子焱傅曉林成棟沈堅(jiān)
    食品研究與開發(fā) 2017年19期
    關(guān)鍵詞:赤霉烯酮乙腈

    鄭睿行,周子焱,傅曉,林成棟,沈堅(jiān)

    (寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,浙江寧波315000)

    HPLC測(cè)定玉米中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A

    鄭睿行,周子焱,傅曉,林成棟,沈堅(jiān)*

    (寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,浙江寧波315000)

    建立玉米中玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)的超高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品用乙腈/水(90∶10,體積比)振蕩提取,過濾后過真菌毒素凈化柱,取上清液氮?dú)獯蹈?,用流?dòng)相溶解殘?jiān)?,過0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣瓶,采用高效液相色譜檢測(cè)法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析。在ZORBAX SB-C18反相柱上分離后,ZEN以甲醇/水(60∶40,體積比)作為流動(dòng)相,OTA以乙腈/水/乙酸(43∶56∶1,體積比)為流動(dòng)相,熒光檢測(cè)器檢測(cè)。ZEN的線性范圍為0.5 μg/mL~6.0 μg/mL,相關(guān)系數(shù)大于0.99;OTA的線性范圍為0.05 μg/mL~0.8 μg/mL,相關(guān)系數(shù)大于0.99。3個(gè)不同水平的加標(biāo)平均回收率為86.4%~114.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%。ZEN和OTA的檢測(cè)限分別為5.0 μg/kg和1.0 μg/kg。應(yīng)用該方法對(duì)收集的不同玉米樣品進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)ZEN和OTA污染較嚴(yán)重,超標(biāo)率均為71.4%。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),能夠用于玉米樣品中真菌毒素的測(cè)定。

    玉米;玉米赤霉烯酮;赭曲霉毒素A;超高效液相色譜檢測(cè)

    Abstract:Determination method of zearalenone(ZEN)and ochratoxin A(OTA)in corn by high-performance liquid chromatography (HPLC)was established.Acetonitrile/water(90 ∶10,volume ratio)for the extraction solvent extracted zearalenone and ochratoxin A in corn,clean-up column purification;then the supernatant was dried by nitrogen,with the mobile phase to dissolve the residue,through the 0.22 μm organic filter to the inlet,HPLC detection.Methanol/water(60∶40,volume ratio)was used as mobile phase for ZEN,and acetonitrile/water/acetic acid(43 ∶56 ∶1,volume ratio)for OTA.The linearity range of ZEN and OTA were 0.5 μg/mL-6.0 μg/mL and 0.05 μg/mL-0.8 μg/mL,respectively,with correlation coefficient>0.99.Recovery experiments were conducted by adding standard into the corn sample,with recoveries of 86.4%-114.1%,relative standard deviation of less than10%.The detection limit of ZEN and OTA were 5.0 μg/kg and 1.0 μg/kg,respectively.Different corn samples were found to be highly contaminated by ZEN and OTA using the method,with 71.4%of excessive rate.The method is simple and fast,good reproducibility,suitable for ZEN and OTA detection in the actual application.

    Key words:corn;zearalenone;ochratoxin A;high performance liquid chromatography(HPLC)

    玉米是我國(guó)重要的糧食作物和工業(yè)原料,經(jīng)常用作食品配料和飼料原料。由于環(huán)境、氣候和儲(chǔ)藏因素的影響,玉米極易污染霉菌,在適宜的溫度、水分和濕度條件下,這些霉菌會(huì)產(chǎn)生真菌毒素,其中玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是比較常見的兩種真菌毒素[1]。ZEN主要是由鐮刀菌屬(Fusarium)的菌株產(chǎn)生的類雌激素化合物,可對(duì)人和動(dòng)物造成多種毒性作用。而由于ZEN的雌激素作用,生殖系統(tǒng)是其主要的靶器官[2]。研究表明ZEN對(duì)雌性和雄性的生殖力都會(huì)造成損傷,其中豬對(duì)ZEN最為敏感,食用ZEN污染的飼料可導(dǎo)致母豬外陰及乳腺腫脹,甚至引發(fā)陰道和直腸脫落[3]。OTA主要是由赭曲霉和青霉屬產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物,在農(nóng)產(chǎn)品中廣泛存在。OTA可對(duì)很多動(dòng)物物種造成毒性,其中腎臟是主要的靶器官。研究表明OTA可以導(dǎo)致腎病和人類巴爾干地方性腎病[4]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將OTA列為可能的人類致癌物。

    ZEN和OTA污染的玉米被人和動(dòng)物食用后,會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的健康造成極大地危脅,因此建立高效而準(zhǔn)確檢測(cè)玉米中ZEN和OTA的方法十分重要。目前ZEN和OTA的檢測(cè)方法主要包括免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法等[5-7]。但是免疫法、薄層色譜法的準(zhǔn)確度不夠高,而質(zhì)譜法對(duì)儀器和操作要求較高,因此目前高效液相色譜法是最常用的檢測(cè)方法。所用的樣品前處理技術(shù)包括液-液萃取和固相萃取,前者操作繁瑣且需要使用大量的有機(jī)溶劑,后者常用到免疫親和柱。但是免疫親和柱操作繁瑣且價(jià)格昂貴。本文通過固液萃取法同時(shí)提取玉米中的ZEN和OTA,選用真菌毒素凈化柱分離雜質(zhì),對(duì)國(guó)標(biāo)中的前處理方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化,高效液相色譜進(jìn)行分離檢測(cè),實(shí)現(xiàn)玉米中ZEN和OTA的快速檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 材料和試劑

    ZEN和OTA污染玉米:河南洛陽(yáng);ZEN、OTA標(biāo)品(純度≥98.0%):上海百靈威公司;甲醇、乙腈(色譜純):美國(guó)Fisher Scientific公司;氮?dú)猓航K無錫新南氣體有限公司;其它分析純?cè)噭┚?gòu)自上海百靈威公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Agilent HPLC 1260高效液相色譜儀:美國(guó)安捷倫科技有限公司;MD200-1氮?dú)獯蹈蓛x:杭州奧盛儀器有限公司;Simplicity UV超純水制備系統(tǒng):法國(guó)Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

    準(zhǔn)確稱取適量的ZEN和OTA標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇和乙腈配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-20℃冰箱中避光保存。使用前用甲醇/水(60∶40,體積比)將ZEN 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成 0.5、1、2、4、6 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液,用乙腈/水/乙酸(43∶56∶1,體積比)將 OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。上述標(biāo)準(zhǔn)工作液置于4℃冰箱中待HPLC分析。

    1.3.2 玉米樣品的前處理

    取一定量的玉米籽粒磨粉并過30目篩,然后稱量25 g玉米粉于150 mL具塞錐形瓶中。向錐形瓶中加入100 mL乙腈/水(90∶10,體積比)溶液,在搖床上振蕩45 min(30℃,200 r/min)。將提取液過濾得到上清液,取4 mL上清液通過凈化柱(PuriToxSR M160),收集2 mL流出液于5 mL聚乙烯離心管中;另外取4mL上清液通過赭曲霉毒素A專用凈化柱(PuriToxSR O130 Ochratoxin Column),收集2 mL流出液于5 mL聚乙烯離心管中。將上述液體于55℃下氮?dú)獯蹈珊?,分別用流動(dòng)相復(fù)溶,漩渦振蕩器振蕩40 s,過0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣瓶中,等待HPLC分析。

    1.3.3 液相色譜條件

    色譜柱:ZORBAXSB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30℃;ZEN 流動(dòng)相:甲醇/水(60∶40,體積比);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)274 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 440 nm;OTA 流動(dòng)相:乙腈/水/乙酸(43 ∶56 ∶1,體積比);流速:0.9 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)333 nm,發(fā)射波長(zhǎng)477 nm。

    1.3.4 定性和定量

    根據(jù)國(guó)標(biāo)采用外標(biāo)法定量,保留時(shí)間定性,樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間必須與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰一致,同時(shí)向污染玉米中加標(biāo),通過比較目標(biāo)峰的變化加以驗(yàn)證。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 提取溶劑的確定

    ZEN和OTA都易溶于甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等極性溶劑。考慮到丙酮和乙酸乙酯毒性較大,通常采用甲醇和乙腈作為提取溶劑。根據(jù)國(guó)標(biāo),ZEN采用乙腈/水(90∶10,體積比)作為提取溶劑,而OTA采用甲醇/水(80∶20,體積比)作為提取溶劑,考慮到分別提取過程繁瑣,所以采用一種提取劑同時(shí)提取兩種目標(biāo)化合物。相比甲醇,乙腈更能減少蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸和酶類的溶解性,避免它們對(duì)目標(biāo)物的干擾,因此選用乙腈/水(90∶10,體積比)作為兩者的共同提取溶劑,同時(shí)為了考察乙腈/水對(duì)于OTA的提取效果,本試驗(yàn)分別用乙腈/水(90∶10,體積比)和甲醇/水(80∶20,體積比)提取玉米中的OTA,見圖1和圖2。

    圖1 提取溶劑為乙腈∶水(90∶10,體積比)時(shí)OTA的峰面積Fig.1 The peak area of OTA by extraction of acetonitrile/water(90 ∶10,volume ratio)

    圖2 提取溶劑為甲醇∶水(80∶20,體積比)時(shí)OTA的峰面積Fig.2 The peak area of OTA by extraction of methanol/water(80 ∶20,volume ratio)

    結(jié)果表明,當(dāng)分別采用兩種提取劑時(shí),OTA的峰面積沒有顯著差異,乙腈/水(90∶10,體積比)對(duì)OTA同樣具有較好的提取效果。因此,本試驗(yàn)確定乙腈/水(90∶10,體積比)為樣品提取溶劑。

    2.2 分離小柱的選擇

    在不同過柱條件下ZEN和OTA的回收率見圖3。

    圖3 不同過柱條件下ZEN和OTA的回收率Fig.3 The recoveries of ZEN and OTA by different columns

    向玉米粉中添加30 μg/kg的ZEN和10 μg/kg的OTA,按照1.3.2描述的方法進(jìn)行前處理,除過柱條件不同外,其他步驟均相同。其中免疫親和柱的步驟參照GB/T 5009.209-2008《谷物中玉米赤霉烯酮的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[8]和GB/T 23502-2009《食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定》[9]。結(jié)果表明,當(dāng)使用凈化柱時(shí),玉米粉中ZEN和OTA的回收率最高,對(duì)于ZEN,過免疫親和柱和不過柱子回收率沒有顯著差異,而對(duì)于OTA,不過柱子回收率偏低,且雜峰較多。本試驗(yàn)所用凈化柱對(duì)玉米樣品中真菌毒素的提取回收率比免疫親和柱回收率要高,其對(duì)ZEN和OTA的回收率均在90%~95%;另外其操作步驟更為簡(jiǎn)便,凈化前也不需進(jìn)行活化、淋洗和洗脫等操作只需直接上樣,有效地減少了有機(jī)溶劑的使用和浪費(fèi)。

    2.3 樣品定性

    ZEN、OTA標(biāo)品加標(biāo)后的色譜圖見圖4和圖5。

    圖4 玉米樣品中ZEN的定性Fig.4 The qualitative determination of ZEN in corn

    圖5 玉米樣品中OTA的定性Fig.5 The qualitative determination of OTA in corn

    ZEN和OTA的定性采用保留時(shí)間,當(dāng)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間一致時(shí)認(rèn)為是目標(biāo)化合物的色譜峰。本研究采用加標(biāo)法對(duì)該定性方法進(jìn)行確認(rèn),防止其他化合物的干擾。結(jié)果表明,污染玉米和污染玉米加標(biāo)后均在與標(biāo)品的保留時(shí)間一致處出現(xiàn)了色譜峰,且加標(biāo)玉米的色譜峰峰高明顯大于污染玉米的色譜峰。這表明采用保留時(shí)間定性能夠確定目標(biāo)化合物的存在。

    2.4 線性關(guān)系、檢出限和回收率

    測(cè)定1.3.1中系列標(biāo)準(zhǔn)液,得到ZEN和OTA的外標(biāo)工作曲線見表1。

    如表1 所示,ZEN 在 0.5 μg/mL~6 μg/mL,OTA 在0.05 μg/mL~0.8 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。方法的檢出限以加標(biāo)樣品色譜峰S/N≥3確定,結(jié)果見表2。

    表1ZEN和OTA的線性曲線Table 1 The standard curve of ZEN and OTA

    表2 玉米中ZEN和OTA的加標(biāo)回收率Table 2 The recoveries of ZEN and OTA

    精確稱取25 g玉米粉,分別加入ZEN和OTA標(biāo)準(zhǔn)液,使ZEN和OTA在玉米粉中的濃度分別為30、60、120 μg/kg和 2.5、5、10 μg/kg。按照優(yōu)化的條件進(jìn)行處理和測(cè)定,外標(biāo)法定量。從表2可以看出,2種目標(biāo)化合物在各自的3個(gè)加標(biāo)水平下回收率為86.4%~114.1%,RSD小于10%,符合國(guó)際上對(duì)于食品污染物殘留檢測(cè)的要求。

    2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

    收集不同品種的玉米,按照1.3.2優(yōu)化方法測(cè)定,結(jié)果如表3所示。

    表3 不同玉米樣品中ZEN和OTA含量Table 3 Determination of ZEN and OTA in corn samples

    數(shù)據(jù)表明,7個(gè)玉米樣品中ZEN的陽(yáng)性檢出率為85.7%,超標(biāo)率 71.4%(≤60 μg/kg)[10];OTA 陽(yáng)性檢出率和超標(biāo)率均為 71.4%(≤5 μg/kg)[10]。百奧明公司調(diào)查了2009年~2011年全球7049份農(nóng)產(chǎn)品中的真菌毒素含量,其中ZEN和OTA的陽(yáng)性率分別為45%和28%[11]。李榮濤等[12]利用單克隆抗體生物免疫技術(shù)測(cè)定了48份小麥樣本和33份玉米樣本,發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮的檢出率為 100%,含量為 18 μg/kg~730 μg/kg。相比這些結(jié)果,本研究中玉米樣品中ZEN和OTA污染較嚴(yán)重,這主要是由于取樣不同造成的。本試驗(yàn)所采集的樣品主要用于后期真菌毒素脫毒研究,因此一般會(huì)采集污染較嚴(yán)重玉米。

    3 結(jié)論

    本文建立玉米中ZEN和OTA的超高效液相色譜檢測(cè)方法。該方法對(duì)國(guó)標(biāo)中的方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化,在所測(cè)定的范圍內(nèi),該方法的線性良好,回收率高,重現(xiàn)性好,符合玉米樣品中痕量污染物檢測(cè)的要求。本方法代替了免疫親和柱的使用,減少了有機(jī)試劑的使用,使操作更加簡(jiǎn)單。另外對(duì)收集的玉米樣品進(jìn)行測(cè)定,ZEN和OTA污染較嚴(yán)重,因此應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)糧食中真菌毒素的檢測(cè)和監(jiān)管工作。

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    Determination of Zearalenone and Ochratoxin A in Corn by Means of HPLC

    ZHENG Rui-hang,ZHOU Zi-yan,F(xiàn)U Xiao,LIN Cheng-dong,SHEN Jian*
    (Ningbo Institute for Food Control,Ningbo 315000,Zhejiang,China)

    2017-01-19

    10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.030

    鄭睿行(1982—),男(漢),高級(jí)工程師,碩士研究生,研究方向:食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)。

    *通信作者:沈堅(jiān)(1966—),男(漢),高級(jí)工程師,本科,研究方向:食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)。

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