廣陳皮提取物的HPLC指紋圖譜研究

張利，黃敏，王婷，余楚純，李立群，葉金玉，劉梅森

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東深圳518109）

廣陳皮提取物的HPLC指紋圖譜研究

張利，黃敏，王婷，余楚純，李立群，葉金玉，劉梅森*

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東深圳518109）

建立廣陳皮提取物的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，為陳皮提取物原料的質(zhì)量控制提供依據(jù)。采用HPLC法分析測定13批廣陳皮樣品。色譜柱：EclipseXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：甲醇-2.0%乙酸水溶液梯度洗脫；檢測波長：283 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；上樣量：10 μL。建立廣陳皮提取物的指紋圖譜，確定出11個共有峰，廣陳皮樣品的相似度在0.967～0.974之間。

廣陳皮；橙皮苷；高效液相色譜；指紋圖譜

Abstract：To establish a method of fingerprint analysis on Citri reticulatae pericarpium extract by high performance liquid chromatography（HPLC），and provide the basis for the quality control of Citri reticulatae pericarpium extract raw materials.Using HPLC analysis method to determine the 13 batches of samples Citri reticulatae pericarpium.HPLC with Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）chromatographic column was used.The mobile phase was methanol-2.0%acetic acid at gradient elution；the detection wavelength was at 283 nm with column temperature at 25℃；flow rate was at 1.0 mL/min；sample quantity was 10 μL.The establishment of a citri reticulatae pericarpium extract fingerprint，determine the 11 common peaks，the similarity of Citri reticulatae pericarpium samples was between 0.967 to 0.974.

Key words：Citri reticulataepericarpium；hesperidin；high performance liquid chromatography（HPLC）；fingerprint

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，陳皮藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”[1]。陳皮主要含揮發(fā)油及以橙皮苷為主的黃酮類成分等，一般通過測定橙皮苷的含量作為評價陳皮的質(zhì)量指標?！吨袊幍洹分幸詥我恢笜顺煞帧绕ぼ諄砗饬筷惼さ馁|(zhì)量，但其它地區(qū)陳皮中橙皮苷的含量往往比廣陳皮高，表明這一單一指標無法說明廣陳皮的特色。研究顯示，建立廣陳皮指紋圖譜可綜合評價廣陳皮原料的質(zhì)量[2-5]。由于我公司植物固體飲料產(chǎn)品對陳皮提取物的需求量大，陳皮原料的質(zhì)量必將影響最終產(chǎn)品的品質(zhì)。因此本研究對廣東省江門市新會地區(qū)不同來源、不同貯藏年限的廣陳皮進行高效液相色譜研究，建立廣陳皮甲醇提取物的特征指紋圖譜，為廣陳皮提取物原料的質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MJ-176NR榨汁攪拌機：松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HS6150超聲清洗機：北京康林科技有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 試藥

橙皮苷標準品（批號：110712）：廣州藥檢所；13批廣陳皮藥材：廣東省江門市新會區(qū)新寶堂陳皮有限公司，具體品種及貯藏年限見表1；甲醇為色譜純；冰乙酸為優(yōu)級純。

表1 廣陳皮樣品品種及貯藏年限Table 1 Varieties and storage life ofCitri reticulataepericarpium sample

2 方法與結(jié)果

2.1 樣液的制備

取廣陳皮原料置于60℃恒溫干燥箱中干燥4 h，粉碎，過80目篩。準確稱取廣陳皮粉末0.5 g置于50 mL具塞比色管中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲提取45 min，用甲醇補足損失的重量，過濾，取濾液再用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷標準品，加甲醇配制成濃度為0.2 mg/mL的橙皮苷標準溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：EclipseXDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-2.0%乙酸水溶液（B），梯度洗脫條件：0～20 min（20%A～40%A），20 min～35 min（40%A～70%A），35 min～55 min（70%A～100%A），55 min～60 min（100%A），60 min～65 min（100%A～20%A）；檢測波長：283 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；上樣量：10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取同一批次的廣陳皮甲醇提取液，連續(xù)進行5次HPLC檢測得到相應的色譜圖，通過中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行分析。結(jié)果表明，5個圖譜主要色譜峰保留時間的相對標準偏差（RSD）在0.13%～0.30%之間，峰面積的RSD值在3.0%以內(nèi)，5次連續(xù)進樣所得液相色譜圖中主要峰的保留時間與峰面積的精密度較高，證明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復性試驗

取同一批次的廣陳皮原料各5份，按照“2.1”方法制備甲醇提取液后進行HPLC檢測得到相應的色譜圖，通過中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行分析。結(jié)果表明，5個圖譜主要色譜峰保留時間的RSD值在0.12%～0.28%之間，峰面積的RSD值在3.0%以內(nèi)，試驗所得液相色譜圖中主要峰的保留時間與峰面積的精密度較高，證明本方法測定的重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的廣陳皮甲醇提取液，分別于制備后0、4、8、12、24 h 進行 HPLC 檢測得到相應的色譜圖，通過中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進行分析。結(jié)果表明，5個圖譜主要色譜峰保留時間的RSD值在0.10%～0.30%之間，峰面積的RSD值在3.0%以內(nèi)，試驗所得液相色譜圖中主要峰的保留時間與峰面積的精密度較高，證明在24 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及評價

2.5.1 不同品種、不同貯藏年限廣陳皮指紋圖譜的建立

取對照品溶液和制備的廣陳皮提取物樣液，按上述色譜條件進行分析測定，得到各批樣品的色譜圖。將色譜圖積分處理后以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件進行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)過設(shè)參照譜、自動匹配、生成對照圖譜等步驟，采用中位數(shù)法得到S1～S13指紋圖譜。13批廣陳皮樣品的指紋圖譜見圖1，圖中R為系統(tǒng)生成的對照圖譜。

13批廣陳皮樣品的共有峰有12個，但第1個峰的保留時間為1.454 min，此峰為溶劑峰，因此13批樣品共計標出11個共有峰，以1、8、11號峰為三強峰，具有明顯的指紋圖譜特征性。由對照品溶液的色譜圖對比可知，保留時間為20.592 min的1號色譜峰為橙皮苷峰，且峰面積最大，以此為參照峰，計算其余共有峰的相對保留時間及相對峰面積，具體數(shù)據(jù)見表2和表3，13批陳皮樣品共有峰的指紋圖譜匹配結(jié)果見表4。

由共有峰的指紋圖譜匹配結(jié)果可知，11個共有峰相對保留時間的RSD＜0.30%，表明13批廣陳皮樣品提取物共有峰的出峰時間基本一致。但由于陳皮品種的不同，各樣品在色譜峰數(shù)量上存在一定的差異，第2至5批陳皮品種為青皮和微紅皮，其色譜峰數(shù)量明顯少于大紅皮品種。13批廣陳皮樣品的共有峰在峰面積的精密度上普遍存在較大差異，這表明由于陳皮原料的品種、產(chǎn)地以及貯藏年限的不同，陳皮提取物中相同化學成分的含量有著較大差異性。

圖1 廣陳皮指紋圖譜Fig.1 Fingerprint ofCitri reticulataepericarpium

表2 13批廣陳皮樣品共有峰的相對保留時間Table 2 13 batches ofCitri reticulataepericarpium relative retention time of common peak

表3 13批廣陳皮樣品共有峰的相對峰面積Table 3 13 batches ofCitri reticulataepericarpium samples common peak relative peak area

表4 13批廣陳皮樣品共有峰的指紋圖譜匹配結(jié)果Table 4 13 batches ofCitri reticulataepericarpium samples common peak of fingerprint matching results

2.5.2 指紋圖譜相似度評價

由“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件對色譜圖進行自動匹配后，進行圖譜的相似度計算，結(jié)果見表5。

表5 13批廣陳皮樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果Table 5 13 batches ofCitri reticulataepericarpium samples of fingerprint similarity analysis results

13批廣陳皮樣品指紋圖譜的相似度較高，相似度在0.967～0.974之間，表明利用指紋圖譜相似度可以較好地評價陳皮原料的質(zhì)量。

3 討論

廣陳皮所含成分較復雜，各成分的極性差別也較大，若采用等度洗脫，改變流動相的組成或比例只能得到較少的色譜峰，且洗脫時間長，色譜峰分離度差。而采用梯度洗脫，廣陳皮樣品中不同極性組分均獲得了適度保留，能較全面地反映樣品信息[6]。試驗考察了甲醇-2%乙酸水溶液、甲醇-6%冰乙酸水溶液、乙腈-1%乙酸水溶液等流動相體系，以甲醇-2%乙酸水溶液系統(tǒng)洗脫得到的色譜峰數(shù)量最多，且分離較好，故選用該系統(tǒng)。

用不同的檢測波長檢測（283 nm和330 nm）及二極管陣列檢測器分析，橙皮苷峰在283 nm波長下有最大吸收，283 nm波長下的色譜峰多于330 nm，且色譜峰響應值大，基線較平穩(wěn)，因此選擇283 nm作為廣陳皮指紋圖譜的檢測波長。

采用高效液相色譜法對各批廣陳皮樣品進行了研究，各批次樣品的色譜圖雖然存在一定的差異，但均具有相同的色譜特征峰。該方法每批次均能獲得眾多的色譜峰，分離效率高，且對于不同來源的廣陳皮樣品，各色譜峰的保留時間相對穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜穩(wěn)定、可靠。

分析比較了不同品種、不同貯藏年限的13批廣陳皮樣品的色譜圖，共標出11個共有峰，各共有峰的保留時間匹配較好，保留時間的RSD＜0.30%。但因品種及貯藏年限的差異，各樣品在色譜峰總量上存在一定的差異，此外共有峰在峰面積的精密度上普遍存在較大差異，表明廣陳皮中相同化學成分的含量有著較大差異性。13批廣陳皮樣品指紋圖譜的相似度在0.967～0.974之間，可利用該指紋圖譜來評價陳皮原料的質(zhì)量，從而建立廣陳皮提取物的質(zhì)量控制標準，保證最終產(chǎn)品質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:191

[2]楊洋,蔣林,鄭國棟,等.道地藥材廣陳皮的HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材,2011,34(2):191-195

[3]黃月純,魏剛.廣陳皮HPLC指紋圖譜的建立及在藥材鑒定中的應用研究[J].中草藥,2008,39(2):275-277

[4]陳永剛,林勵.柑橘屬常用中藥黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究與比較[J].中國中藥雜志,2011,36(19):2660-2665

[5]胡靈.玉環(huán)柚柚皮中黃酮類化合物提取、分離及指紋圖譜的研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學,2011:39-50

[6]封宇飛,張宏武,鄒忠梅,等.陳皮飲片高效液相指紋圖譜研究[J].中國藥業(yè),2012,21(24):28-31

HPLC Fingerprint of Citri reticulatae Pericarpium Extract

ZHANG Li，HUANG Min，WANG Ting，YU Chu-chun，LI Li-qun，YE Jin-yu，LIU Mei-sen*
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

2016-12-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.027

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金（CXZZ201406251 61734122）

張利（1983—），女(漢），碩士研究生，研究方向：食品、保健食品的研究與開發(fā)。

*通信作者：劉梅森（1968—），男（漢），教授級高級工程師，博士，研究方向：天然植物提取物的研究開發(fā)。