主成分分析超高壓對(duì)桑椹飲料香氣成分的影響

吳夢(mèng)，李希，馬永昆，2，*，肖露露，Tchabo William，Kwaw Emmanuel

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鎮(zhèn)江市果圣源食品科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江212000）

主成分分析超高壓對(duì)桑椹飲料香氣成分的影響

吳夢(mèng)1，李希1，馬永昆1，2，*，肖露露1，Tchabo William1，Kwaw Emmanuel1

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鎮(zhèn)江市果圣源食品科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江212000）

采用頂空固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）對(duì)不同超高壓處理的桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分進(jìn)行測(cè)定，并結(jié)合主成分分析法對(duì)香氣成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在未經(jīng)高壓處理以及7種不同高壓處理?xiàng)l件的桑椹發(fā)酵飲料中共檢出47種香氣成分，主要是醇類、酯類、酸類、醛類等，其特征香氣成分為異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、苯甲醛、2-丁酮、乙酸等，賦予飲料果香、水果甜香、植物花香等特有香氣。通過(guò)主成分分析法分析得出，前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.30%，可代表原數(shù)據(jù)信息，并將桑椹飲料分為4類，揭示未經(jīng)高壓處理組與高壓處理組以及不同高壓處理組間在香氣種類及含量中存在的差異。

桑椹飲料；超高壓；頂空固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；香氣成分；主成分分析

Abstract：Principal component analysis was used to investigate the effect of high pressure on the volatile compounds of mulberry beverage.The aroma components were determined using solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometer technique（SPME-GC-MS）.The results showed that 47 aroma components were detected in mulberry fermented beverages without high pressure treatment and 7 different high pressure treatment conditions，predominantly alcohols，esters，acids and aldehydes.The characteristic aroma components of mulberry beverage were isoamyl alcohol，phenylethyl alcohol，ethyl acetate，ethyl propionate，ethyl butyrate，ethyl 2-methyl butyrate，isoamyl acetate，ethyl hexanoate，benzaldehyde，2-butanone and acetic acid，which gave fruity，sweet fruit，plant flowers note to the beverage.Principal component analysis revealed that the third first components could explain 85.30%of the total variance，which could represent the original data.The mulberry beverages were clustered into four groups，thus revealed the difference in aroma type and content among the pressurized beverages and that of the non-pressurized beverages.

Key words：mulberry beverage；high pressure processing；headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer；aroma components；principal component analysis

香氣品質(zhì)是評(píng)價(jià)發(fā)酵果蔬飲料類產(chǎn)品的關(guān)鍵指標(biāo)之一，熱殺菌易產(chǎn)生煮熟味，影響發(fā)酵飲料的風(fēng)味，因此熱敏性果蔬飲料的殺菌方式及香氣改善成為目前業(yè)內(nèi)較為關(guān)注的熱點(diǎn)。超高壓（high pressure processing，HPP）殺菌技術(shù)作為新型的殺菌技術(shù)之一，主要通過(guò)較高的靜壓力（100 MPa～1 000 MPa）引起的食品原料內(nèi)部的生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、淀粉類及酶類）活性發(fā)生改變殺死微生物菌類[1-3]，超高壓殺菌技術(shù)能夠在達(dá)到商業(yè)無(wú)菌要求的同時(shí)，保留食品原有的風(fēng)味及品質(zhì)，對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞較小，因此目前是非熱加工技術(shù)中研究最多、產(chǎn)業(yè)化程度最高的一種加工方法[4]。

目前評(píng)價(jià)香氣主要采用感官評(píng)價(jià)法來(lái)判斷，但由于評(píng)價(jià)人員極易受主觀性因素及環(huán)境影響而不能對(duì)產(chǎn)品做出客觀評(píng)價(jià)[5]。主成分分析法是一種通過(guò)降維把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，主要是簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)和揭示變量間的關(guān)系，目前已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品的品種判別、品質(zhì)探究、工藝判別等方面。如William[6]利用主成分分析法分析不同物理催陳方式對(duì)桑椹酒香氣成分的影響，于懷龍[7]采用主成分分析法分析香氣成分來(lái)區(qū)分不同品種的桑椹。

本文通過(guò)頂空固相微萃?。⊿PME）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）檢測(cè)高壓處理前后的桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分，并結(jié)合主成分分析法分析超高壓處理對(duì)桑椹發(fā)酵飲料香氣品質(zhì)的影響以及存在的差異，旨在為發(fā)酵飲料香氣品質(zhì)的評(píng)價(jià)提供一種思路，以及為應(yīng)用超高壓技術(shù)改善桑椹發(fā)酵飲料香氣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

桑椹：鎮(zhèn)江江心洲；植物乳桿菌ZR01：江蘇大學(xué)食品與生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏；Lalvin 71B活性干酵母：法國(guó)Lallemand公司；正丙醇（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱：上?！憧茖W(xué)儀器有限公司；滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；TE124S-電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；手動(dòng)式塑料薄膜封口機(jī)：浙江省永嘉水電機(jī)械廠；超高壓食品處理裝置（3L/800MPa）：包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；Agilent6890/5973型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣器、15 mL樣品瓶（帶膠墊）、950/30μmDVB/CAR/PDMS萃取纖維頭：美國(guó)Su pelco公司；PC-420型電熱磁力攪拌器：美國(guó)Corning公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑椹發(fā)酵飲料制備

桑椹打漿，加入0.35%的果膠酶，于40℃水浴中酶解1.5 h，冷卻后添加120 mg/L的偏重亞硫酸鉀，接種5.8%活化后的71B酵母菌在27℃下發(fā)酵7.5 h，再接種活化后的0.25%的植物乳桿菌ZR01在36℃下發(fā)酵22.5 h，離心過(guò)濾后超高壓處理。

1.2.2 桑椹發(fā)酵飲料的超高壓處理

取桑椹發(fā)酵飲料樣品裝入高壓袋中，封口后冰水浴存放備用。通過(guò)對(duì)預(yù)試驗(yàn)確定處理?xiàng)l件選擇為300、400、500 MPa，保壓時(shí)間為 15 min，編號(hào)分別為 D300/15、D400/15、D500/15；壓力條件 400 MPa，保壓時(shí)間為 10、15、20、25 min，編號(hào)分別為 D400/10、D400/15、D400/20、D400/25；未處理樣品編號(hào)為D0。超高壓設(shè)備升壓速率為每分鐘100 MPa，瞬時(shí)解壓，保壓過(guò)程壓強(qiáng)變化很小，壓強(qiáng)差不超過(guò)10 MPa，腔內(nèi)介質(zhì)油的溫度為20℃～22℃。樣品處理完后置于4℃冰箱冷藏并在24 h內(nèi)檢測(cè)。

1.2.3 SPME萃取方法

取5 mL樣品和0.1 μL的內(nèi)標(biāo)物正丙醇放置于15 mL頂空瓶中，添加1.0 gNaCl，放入攪拌子后于40℃恒溫水浴中預(yù)熱，磁力攪拌速度為600 r/min，預(yù)熱10 min后將萃取纖維頭插入樣品瓶的頂空，與液面保持1.0 cm的距離，萃取30 min。

1.2.4 GC-MS參數(shù)條件[8]

色譜條件：DB-WAX 柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），250℃溫度下將萃取頭老化1 h后備用。將富集香氣后的萃取頭在進(jìn)樣口（250℃）解析5 min，載氣為流量1.0 mL/min的高純度He，不分流。升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0℃保持2 min后以5℃/min的升溫速率升至100℃保持2 min，再以6℃/min升溫速率升至160℃保持3 min，再以10℃/min升溫速率升至220℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：5973型四極桿質(zhì)譜儀，接口溫度250℃，電子轟擊（EI）離子源，電子能量為70 eV；電子倍增器電壓為1 353 V；離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；質(zhì)量掃描范圍為33 amu～450 amu。

1.2.5 揮發(fā)性香氣成分的定性和定量方法

定性分析：數(shù)據(jù)收集采取譜庫(kù)檢索法，用HP化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST98庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，成分先由譜庫(kù)初步鑒定，當(dāng)匹配度大于800的物質(zhì)予以確認(rèn)，再結(jié)合參考文獻(xiàn)進(jìn)行定性[9]。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法定量，以正丙醇為內(nèi)標(biāo)，濃度 0.02 μg/mL，計(jì)算公式為：

式中：C為待測(cè)組分的濃度，μg/mL；A為待測(cè)組分的峰面積，%；Ci為內(nèi)標(biāo)物的濃度，μg/mL；Ai為內(nèi)標(biāo)物的峰面積，%。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行主成分分析，采用origin 2015軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超高壓處理?xiàng)l件下桑椹發(fā)酵飲料的香氣分析不同超高壓條件處理前后的香氣成分及含量見(jiàn)

表1，不同超高壓處理?xiàng)l件下不同種類的香氣含量如圖1所示。

表1 不同壓強(qiáng)處理桑椹發(fā)酵飲料香氣成分及含量Table 1 Aroma compounds of mulberry fermented beverages treated by different pressures

果酒的香氣是評(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，其來(lái)源于果香、發(fā)酵香、陳釀香，除了原料本身自帶的果香外，香氣物質(zhì)主要是由微生物作用于蛋白質(zhì)、糖類、脂肪及其他物質(zhì)產(chǎn)生的[10]。由表1可知，桑椹發(fā)酵飲料的主體香氣由酯類、醇類、酸類、酮類和醛類等物質(zhì)組成，超高壓處理前后醇類、酯類和醛類等香氣物質(zhì)的種類有所改變。未處理桑椹發(fā)酵飲料共鑒定出37種香氣物質(zhì)，經(jīng)過(guò)超高壓處理的桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分均在40種以上，伴隨著香氣物質(zhì)的生成和消失。

續(xù)表1 不同壓強(qiáng)處理桑椹發(fā)酵飲料香氣成分及含量Continue table 1 Aroma compounds of mulberry fermented beverages treated by different pressures

圖1 不同種類香氣成分的含量Fig.1 The content of aroma components in different species

由表1和圖1可知，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)總酯的含量先增加后減少，大部分酯類物質(zhì)的含量在15 min高壓處理后達(dá)到最大值，如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、正己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯和乳酸異戊酯等。超高壓處理后醇類物質(zhì)均低于未處理組，原因可能是一方面醇酸的酯化反應(yīng)，另一方面是由于超高壓有利于增加醇-水締合程度[11]；隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，總酯和總?cè)┖烤尸F(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，且保壓15 min時(shí)含量最高；酸類物質(zhì)的總含量減少，使飲料口感更加柔和。經(jīng)不同高壓處理桑椹發(fā)酵飲料中的酯類物質(zhì)的含量均有所增加，其中400 MPa處理?xiàng)l件增加最多；隨著處理壓力的升高醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)的含量均有所減少，可能是超高壓作用過(guò)程中，腔內(nèi)溫度隨著壓強(qiáng)的升高而增加，從而促進(jìn)了醇類與酸類物質(zhì)的酯化反應(yīng)[12]。300MPa和400 MPa處理后的醛類物質(zhì)的含量均高于未處理組，這可能是由于高壓破壞了糖苷鍵，使醛類物質(zhì)得到了釋放[13]。醇酸酯化反應(yīng)增加酯類香氣物質(zhì)，增強(qiáng)了桑椹發(fā)酵飲料的果香和甜香，使得香氣更加馥郁芬芳。

2.2 桑椹發(fā)酵飲料特征香氣成分的初步篩選

Grosch[14]認(rèn)為食品中已鑒定的成分中真正對(duì)食品香氣有貢獻(xiàn)的成分不足5%。實(shí)際上，食品的香氣只有幾種主要的揮發(fā)成分構(gòu)成及特征香氣成分，它們對(duì)食品的整體香氣起著至關(guān)重要的作用和影響。根據(jù)Guadagni[15]香氣值理論，食品中香氣濃度高而閾值低的成分很可能是食品的特征香氣或主體香氣成分，一種呈香物質(zhì)在食品香氣中起作用的強(qiáng)度可用香氣濃度與香氣閾值的比值即香氣強(qiáng)度或香氣值（FU）表示。一般FU＜1時(shí)，該香氣成分可能不會(huì)引起嗅覺(jué)器官的感覺(jué)，F(xiàn)U＞1時(shí)，這種香氣可能對(duì)食品香氣的貢獻(xiàn)和影響較大。因此，本文根據(jù)FU＞1的香氣成分列為特征香氣成分，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，桑椹發(fā)酵飲料的特征香氣成分有異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、苯甲醛、2-丁酮、乙酸等，賦予了飲料果香、水果甜香、植物花香等特有的香氣。袁小單[19]研究桑椹酒香氣成分時(shí)認(rèn)為桑椹酒的特征香氣為異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙醛、壬醛等，這與本研究結(jié)果部分香氣是相同的。與Luchai Butkhup等[20]的研究桑椹酒主體香氣部分相同。由于本研究采用乳酸菌和酵母菌雙菌種發(fā)酵，因此與桑椹酒的香氣成分存在一定的差異，且桑椹品種也會(huì)造成主體香氣的不同。

表2 桑椹發(fā)酵飲料特征香氣成分的閾值、香氣值及香氣描述Table 2 Odor thresholds，aroma values and odor description of characteristic aroma components in mulberry fermented beverages

2.3 不同超高壓處理桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分主成分分析

本研究以桑椹飲料的香氣成分作為研究對(duì)象，采用主成分分析法對(duì)不同超高壓處理?xiàng)l件下的桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分進(jìn)行分析，其特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率見(jiàn)表3，主成分的載荷矩陣和特征向量見(jiàn)表4。

表3 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution of principal components

表4 主成分的載荷矩陣和特征向量Table 4 Loading matrix and eigenvectors of principal components

續(xù)表4 主成分的載荷矩陣和特征向量Continue table 4 Loading matrix and eigenvectors of principal components

由表3和表4可知，前3種主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85%，即可代表原數(shù)據(jù)信息。第一主成分貢獻(xiàn)率為48.66%，反映的指標(biāo)有乙酸異丁酯、乙酸乙酯、茴香醛、乙酸仲丁酯、苯甲醛、2-丁酮、乙酸甲酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸乙酯、異丁醇、異丁酸乙酯、正己酸乙酯、苯甲醇、丁酸乙酯、琥珀酸二乙酯、苯甲酸乙酯、乳酸異戊酯、異戊醇、丙酸乙酯等。第二主成分貢獻(xiàn)率為25.20%，反映的指標(biāo)有正己醇、乙酸丙酯、壬醛、2-乙基己醇、丁酸、乳酸乙酯、乙酸苯甲酯、異戊酸乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯等。第三主成分貢獻(xiàn)率為11.44%，反映的指標(biāo)有正己酸、甲酸辛酯、2，4-二叔丁基苯酚、2-乙基己醇等。

由前3個(gè)主成分的得分作散點(diǎn)圖如圖2。

圖2 不同超高壓處理桑椹飲料香氣主成分得分散點(diǎn)圖Fig.2 Scores scatter plots of aroma components in mulberry fermented beverage treated by different pressures

由圖2可知，不同超高壓處理?xiàng)l件下桑椹發(fā)酵飲料的香氣被分為4類，第一類為D400/10和D400/15條件下的桑椹發(fā)酵飲料，第二類為D400/20和D400/25條件下桑椹發(fā)酵飲料，第三類為D300/15和D500/15處理的桑椹發(fā)酵飲料，而未經(jīng)超高壓處理的桑椹發(fā)酵飲料D0為第四類。超高壓處理組與未被超高壓處理組均沒(méi)有被歸為一類，由此可知，超高壓處理對(duì)桑椹發(fā)酵飲料的香氣存在一定的影響，不同超高壓處理時(shí)間和不同高壓均會(huì)對(duì)桑椹發(fā)酵飲料的香氣起到不同的作用。

以不同超高壓處理?xiàng)l件桑椹發(fā)酵飲料香氣成分的前3個(gè)主成分載荷作圖，結(jié)果如圖3。

圖3 不同超高壓處理桑椹飲料香氣主成分載荷散點(diǎn)圖Fig.3 Loading scatter plots of aroma components in mulberry fermented beverage treated by different pressures

由圖2、圖3可知，第一類超高壓處理的桑椹發(fā)酵飲料D400/10和D400/15位于PC2、PC3的負(fù)半軸和PC1的正半軸，第一類與其他高壓處理桑椹飲料香氣差異主要在第一類具有較高含量的A6（正己醇）、A10（紫羅蘭醇）、B8（丁酸乙酯）、B9（2-甲基丁酸乙酯）、B10（異戊酸乙酯）、B13（乳酸乙酯）、B14（辛酸乙酯）、B18（琥珀酸二乙酯）、B19（苯甲酸乙酯）、B20（乙酸苯甲酯）、B22（鄰苯二甲酸二乙酯）、C1（壬醛）、E1（2，4-二叔丁基苯酚）、F4（正己酸）等香氣成分。第二類位于PC1、PC2和PC3的負(fù)半軸，包括D400/20和D400/25條件下桑椹發(fā)酵飲料，能反映第二類與其他高壓處理桑椹飲料差異的香氣成分為A5（甲基乙酰甲醇）、A7（2-乙基己醇）、A14（苯乙醇）。第三類D300/15和D500/15處理的桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分主要集中在PC1和PC3的正半軸PC2的負(fù)半軸，其特點(diǎn)是其高含量的A11（庚乙二烯乙二醇），B1（乙酸甲酯）表示，B6（乙酸仲丁酯）和F3（2-甲基己酸）以及含量適中的B2（乙酸乙酯）B5（乙酸丙酯）、B7（乙酸異丁酯）、B11（乙酸異戊酯）、C3（茴香醛）。未經(jīng)超高壓處理的桑椹發(fā)酵飲料D0作為第四類其香氣成分主要位于PC1、PC2和PC3的正半軸，能反映第四類與其他高壓處理桑椹飲料差異的香氣成分為高含量的 A1（乙醇）、A2（仲丁醇）、A3（異丁醇）、A4（異戊醇）、B3（丙酸乙酯）以及較高含量的B12（正己酸乙酯）和D1（2-丁酮）。因此，不同香氣成分對(duì)不同超高壓處理的桑椹飲料的香氣貢獻(xiàn)不同，進(jìn)而使其與其他類別的桑椹發(fā)酵飲料區(qū)分開(kāi)。

3 結(jié)論

本研究采用SPME-GC-MS測(cè)定不同超高壓處理桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分，根據(jù)Guadagni香氣值理論篩選出桑椹發(fā)酵飲料的特征香氣成分有異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、苯甲醛、2-丁酮、乙酸等，賦予了飲料果香、水果甜香、植物花香等特有的香氣。通過(guò)主成分分析法對(duì)不同超高壓處理?xiàng)l件下的桑椹發(fā)酵飲料的香氣成分進(jìn)行分析，未超高壓處理及不同高壓處理?xiàng)l件下的桑椹發(fā)酵飲料的香氣被分為4類，表明超高壓處理對(duì)桑椹發(fā)酵飲料的香氣存在一定的影響，且不同保壓時(shí)間和不同高壓處理均會(huì)對(duì)桑椹發(fā)酵飲料的香氣起到不同的作用，其香氣成分的種類和含量間存在一定的差異。

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Effect of High Pressure Processing on Aroma Compounds in Mulberry Beverage Analyzed by Principal Component

WU Meng1，LI Xi1，MA Yong-kun1，2，*，XIAO Lu-lu1，Tchabo William1，Kwaw Emmanuel1
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2.Zhenjiang Guoshengyuan Food Technology Co.，Ltd.，Zhenjiang 212000，Jiangsu，China）

2017-03-25

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.025

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

吳夢(mèng)（1994—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品發(fā)酵及食品風(fēng)味研究。

*通信作者：馬永昆（1963—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品風(fēng)味化學(xué)、食品發(fā)酵工程及食品非熱力加工研究。