新疆褐牛CD46基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備

木哈買提江·鐵格斯，張慧敏，杜潤慈，加爾肯，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，冉多良，劉建華

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

新疆褐牛CD46基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備

木哈買提江·鐵格斯1，張慧敏，杜潤慈，加爾肯，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，冉多良，劉建華*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

旨在克隆并表達(dá)新疆褐牛CD46基因，制備其多克隆抗體，為進(jìn)一步研究牛CD46分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。采用RT-PCR方法從新疆褐牛脾臟中擴(kuò)增CD46基因全長，進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將CD46部分序列亞克隆于pET-28a(+)和pVAX1載體中。將陽性重組質(zhì)粒pET-28a-△CD46轉(zhuǎn)化于E.coliRosetta-gamiB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)截短CD46蛋白。用切膠純化的His-△CD46融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體；采用ELISA測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)；取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pVAX1-△CD46轉(zhuǎn)入BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞)細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物以制備的多克隆抗體為一抗，采用Western blot法檢測(cè)該多克隆抗體的特異性。CD46基因的測(cè)序結(jié)果表明，部分基因蛋白表達(dá)、純化條帶大小與預(yù)期一致；制備的抗牛CD46多克隆抗體效價(jià)高于1∶128 000，并具有良好的特異性。

新疆褐牛；CD46；表達(dá)；融合蛋白；多克隆抗體

CD46又稱為膜輔助蛋白(membrane cofactor protein，MCP)，是一類表達(dá)于所有有核細(xì)胞的Ⅰ型跨膜糖蛋白。CD46主要由4個(gè)串聯(lián)的能夠結(jié)合C3b和C4b的補(bǔ)體控制蛋白模式(CCP1-CCP4)，1個(gè)富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基的O糖基化結(jié)構(gòu)域(STP)，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端細(xì)胞漿尾構(gòu)成[1]。CD46的主要功能是作為一種輔助因子，促進(jìn)蛋白酶因子Ⅰ介導(dǎo)的C3b和C4b降解，并增強(qiáng)C3轉(zhuǎn)化酶的活性(尤其是替代途徑的C3轉(zhuǎn)化酶)，被認(rèn)為是補(bǔ)體旁路激活途徑最有效的抑制因子。因此，CD46通過抑制C3分子激活的聯(lián)級(jí)反應(yīng)，調(diào)節(jié)補(bǔ)體的功能，保護(hù)宿主自身的正常細(xì)胞免遭補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解破環(huán)[2]。此外，CD46還是許多病毒、細(xì)菌等病原體的受體，可以通過胞外結(jié)構(gòu)域與這些病原體特異性結(jié)合激發(fā)某些生物學(xué)或免疫學(xué)效應(yīng)。有研究顯示，麻疹病毒、第6型人皰疹病毒與CD46的相互作用能夠抑制巨噬細(xì)胞IL-12的分泌(IL-12是一種Th分化及NK、T細(xì)胞活化必須的細(xì)胞因子)，并且下調(diào)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的信使分子NO的合成[3]。Price J D等[4]研究表明，鏈球菌與CD46的相互作用能夠誘導(dǎo)人CD4+T細(xì)胞分泌大量免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化。Li K等[5]研究顯示，大腸埃希菌能夠通過C3b與CD46的結(jié)合感染人的腎小管上皮細(xì)胞引發(fā)腎盂腎炎。Maurer K等[6]和Krey T等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抗CD46單抗和CD46分子封閉均能有效抑制BVDV感染細(xì)胞，說明CD46是BVDV的細(xì)胞膜受體。隨后的研究進(jìn)一步顯示，BVDV特異性地吸附CD46能夠通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以pH依賴方式啟動(dòng)病毒粒子的細(xì)胞穿入，引起病毒感染[8]。CD46無論是對(duì)正常細(xì)胞功能的維持還是在病原的入侵過程中都起到了至關(guān)重要的作用。

表達(dá)CD46并制備其多克隆抗體對(duì)于基因的功能研究將起重要作用，免疫組化、蛋白質(zhì)相互作用的確定及阻斷病原體感染細(xì)胞等許多工作的開展也都需要有特異的抗體作為輔助[9]。本試驗(yàn)首次從新疆褐牛脾臟中成功擴(kuò)增CD46基因全長，進(jìn)行序列測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)截短的CD46蛋白，利用純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究牛CD46分子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、動(dòng)物組織和試驗(yàn)用動(dòng)物E.coliDH5α、E.coliRosetta-gamiB(DE3)、原核表達(dá)載體pET-28a (+)、真核表達(dá)載體pVAX1、pGM-T、BHK-21細(xì)胞，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；新疆褐牛脾臟組織采自烏魯木齊華凌畜牧屠宰場；2只體重均為1.8 kg～2.5 kg的新西蘭大白兔由新疆維爾自治區(qū)疾病防控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq酶、dNTP、T4 DNA連接酶、DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000、DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000、DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 15 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；cDNA第1鏈合成試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Trizol、LipofectamineTM 2000，Invitrogen公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均，Sigma公司產(chǎn)品；OPTI-MEM、DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素小提質(zhì)粒試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)用6孔板均，NUNC公司產(chǎn)品；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP antibody，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 新疆褐牛CD46基因的擴(kuò)增和TA克隆 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中牛CD46基因序列(登錄號(hào)NM-001242561.1)，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，序列見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

取脾臟組織于液氮中磨碎，采用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，經(jīng)cDNA第1條鏈合成試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，P1/P2為特異性引物，PCR擴(kuò)增CD46基因。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因，連接于pGM-T，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落搖菌并鑒定，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pGM-T-CD46。

表1 引物和序列

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-△CD46與真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-△CD46的構(gòu)建 分別采用DNA Man、Blast、SignalP、TMHMM和Protean軟件對(duì)CD46基因的測(cè)序結(jié)果及其編碼蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、抗原性進(jìn)行分析。選擇CD46基因編碼蛋白抗原性較高的胞質(zhì)區(qū)為擴(kuò)增區(qū)域，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物P3/P4、P5/P6，序列見表2，預(yù)期大小為756 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

分別以質(zhì)粒pGM-T-CD46為模板，P3/P4、P5/P6為特異性引物，擴(kuò)增目的基因部分片段△CD46，用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。雙酶切PCR產(chǎn)物及空載體pET-28a(+)和pVAX1，回收純化。分別取酶切載體、目的片段于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素或氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落并鑒定，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pET-28a-△CD46和pVAX1-△CD46。

表2 引物和序列

1.2.3 His-△CD46融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取陽性重組質(zhì)粒pET-28a-△CD46，轉(zhuǎn)化E.coliRosetta-gamiB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)融合蛋白His-△CD46表達(dá)；采用SDS-PAGE切膠純化方法純化融合蛋白，經(jīng)Brand Ford 蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4 兔抗His-△CD46融合蛋白多克隆抗體的制備 取融合蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化完全后背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，劑量為1 mg/只。以后每間隔2周以弗氏不完全佐劑與融合蛋白完全乳化后進(jìn)行再次免疫。四免后7 d心臟采血，分離血清保存待檢。

1.2.5 抗體效價(jià)測(cè)定 以純化的His-△CD46融合蛋白為包被抗原，4 ℃過夜包被ELISA板(0.2 μg/孔)，PBST洗滌3次(5 min/次，下同)后用50 g/L的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次，以兔抗His-△CD46融合蛋白多克隆抗體為一抗(1∶1 000～1∶128 000)，37 ℃孵育1 h ，PBST洗滌3次，加入Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP antibody(1∶8 000)，37 ℃孵育1 h ，PBST洗滌3次后加入TMB顯色底物，顯色10 min后加入終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。當(dāng)試驗(yàn)組OD值大于或等于2 倍陰性對(duì)照組(免疫前血清)時(shí)判為陽性，以陽性血清最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為該抗體的效價(jià)。

1.2.6 抗體特異性檢測(cè) 取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pVAX1-△CD46和空載體pVAX1分別轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞，48 h后制備細(xì)胞總蛋白，以制備的兔抗His-△CD46融合蛋白多克隆抗體為一抗，Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP antibody為二抗，采用Western blot法檢測(cè)該多克隆抗體的特異性。

2 結(jié)果

2.1 CD46基因的擴(kuò)增和TA克隆

以新疆褐牛脾細(xì)胞總RNA為模板，用特異性引物P1/P2進(jìn)行CD46基因的RT- PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGM-T-CD46。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳可觀察到1條約1 257 bp大小的清晰條帶，與預(yù)期大小相符；pGM-T-CD46的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后得到兩條分別為1 257 bp、3 000 bp的清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果符合(圖1)；測(cè)序結(jié)果顯示，陽性質(zhì)粒中目的基因序列與參考序列同源性為100%。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000；1.pGM-T-CD46的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；2.pGM-T空載體；3.CD46基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1.Enzyme digestion products of recombinant plasmid pGM-T-CD46 byBamHⅠ/XhoⅠ；2.Empty plasmid pGM-T；3.RT-PCR product of CD46

圖1重組質(zhì)粒pGM-T-CD46鑒定結(jié)果

Fig.1 Identification of recombinant plasmid pGM-T-CD46

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-△CD46和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-△CD46的構(gòu)建

2.2.1 CD46基因生物信息學(xué)分析 采用ORF Finder對(duì)CD46基因全序列分析發(fā)現(xiàn)，1 bp～1 257 bp是個(gè)大的開放閱讀框。用Protean軟件對(duì)CD46基因全序列(1257 bp)分析顯示,155-233 aa親水性較強(qiáng)，易體外表達(dá)。1-25、89-118、389-400、406-419 aa抗原性較強(qiáng)，易形成潛在的抗原表位；CD46分子表面可及性較好，該蛋白能被抗體結(jié)合的可能性高。使用TMHMM軟件預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)，該蛋白的1-365 aa位于細(xì)胞膜外，366-388 aa之間形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，389-418 aa位于細(xì)胞膜內(nèi)。用Signalp軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白具有信號(hào)肽序列，最可能的剪切點(diǎn)位于42-43 aa之間。2.2.2 原核表達(dá)載體pET-28a-△CD46與真核表達(dá)載體pVAX1-△CD46的鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒pVAX1-△CD46(圖2A)和pET-28a-△CD46(圖2B)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后得到與預(yù)期結(jié)果符合的清晰條帶，分別為756、3 000、5 200 bp。測(cè)序結(jié)果顯示，陽性重組質(zhì)粒中目的基因序列與原始序列同源性為100%，說明成功構(gòu)建了CD46基因原核及真核表達(dá)載體。

2.3 His-△CD46融合蛋白的表達(dá)檢測(cè)及純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-△CD46轉(zhuǎn)化至受體菌E.coliRosetta-gamiB(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS- PAGE分析，在37℃，IPTG 濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)3 h，目的基因得到高效表達(dá)，目的蛋白主要以包涵體形式存在，其相對(duì)分子質(zhì)量約為35 ku(圖3A)，與預(yù)期大小吻合。利用SDS-PAGE電泳切膠純化方法獲得了高純度目的蛋白(圖3B)，其濃度為10.6 mg/mL，可用作免疫抗原。

A.M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；M2.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000；1.pVAX1-△CD46 PCR產(chǎn)物；2.pVAX1-△CD46雙酶切產(chǎn)物(BamHⅠ/XhoⅠ)；3.pVAX1-△CD46

B.M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 15 000；M2.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.pET-28a-△CD46雙酶切產(chǎn)物(BamHⅠ/XhoⅠ)；2.pET-28a空載體；3.pET-28a-△CD46 PCR產(chǎn)物

A.M1.DNA Marker DL 2 000；M2.DNA Marker DL 5 000；1.PCR product of pVAX1-△CD46；2.Enzyme digestion products of pVAX1-△CD46 byBamHⅠ/XhoⅠ；3.pVAX1-△CD46

B.M1.DNA Marker DL 15 000；M2.DNA Marker DL 2 000；1.Enzyme digestion products of pET-28a-△CD46 byBamHⅠ/XhoⅠ；2.Empty plasmid pET-28a；3.PCR product of pET-28a-△CD46

圖2重組質(zhì)粒pET-28a-△CD46和pVAX1-△CD46的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果

Fig.2 PCR and enzyme digestion identification of pET-28a-△CD46 and pVAX1-△CD46 recombinant plasmids

A. M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.菌體裂解后包涵體；2.菌體裂解后上清

B. M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)重組菌總蛋白；2.融合蛋白純化產(chǎn)物

A. M.Protein molecular weight Marker；1. Inclusions after cracking bacteria；2.Supernatant after cracking bacteria

B. M.Protein molecular weight Marker；1.The induced proteins of recombinant bacteria；2.Purified products of fusion proteins

圖3 His-△CD46融合蛋白純化結(jié)果

Fig.3 Purification results of fusion protein His-△CD46

2.4 抗體效價(jià)檢測(cè)

以純化的His-△CD46融合蛋白為包被抗原，采用4免后7 d的兔血清為一抗，倍比稀釋，間接ELISA 法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果制備的CD46抗體效價(jià)高于1∶128 000。

2.5 多克隆抗體特異性分析

取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pVAX1-△CD46和空載體pVAX1分別轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，在35 ku左右處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)，空白對(duì)照組未出現(xiàn)任何條帶，表明制備的抗CD46多克隆抗體能識(shí)別真核表達(dá)的CD46蛋白。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pVAX1-△CD46轉(zhuǎn)染組；2.pVAX1空載體轉(zhuǎn)染組

M.Protein molecular weight Marker；1.Transfection group with pVAX1-△CD46；2.Transfection group with pVAX1

圖4多克隆抗體的Western blot鑒定

Fig.4 Identification of polyclonal antibodies by Western blot

3 討論

抗血清為含有某一類具有特異免疫功能的抗體分子的血清，一般為動(dòng)物被人工注射某類抗原后制備的動(dòng)物血清，高效價(jià)的抗血清用于各種研究工作[10]。免疫血清的質(zhì)量直接影響試驗(yàn)的特異性和敏感性。免疫產(chǎn)生抗體的特異性很大方面取決于所使用的免疫原的抗原性和純度[11]。因此，本研究在選擇表達(dá)區(qū)域時(shí)，分別采用DNA Man、BLAST、SignalP、TMHMM和Protean軟件對(duì)CD46基因的測(cè)序結(jié)果及其編碼蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、抗原性進(jìn)行分析。選擇CD46基因編碼蛋白抗原性較高的胞質(zhì)區(qū)為擴(kuò)增區(qū)域，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-△CD46和真核表達(dá)載體pVAX1-△CD46。

蛋白的表達(dá)受到許多因素的制約與影響，本研究采用pET載體系列的pET-28a作為表達(dá)載體，該載體利用大腸埃希菌的T7噬菌體為啟動(dòng)子[12]，可對(duì)各種目的基因進(jìn)行高效率表達(dá)，同時(shí)載體含有6×組氨酸標(biāo)簽，簡化了表達(dá)蛋白的純化步驟。本研究采用pET-28a載體進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，最終獲得了成功。

為了獲得重組蛋白的高特異性抗體,必須先予抗原純化。不同的重組蛋白需要采用不同的純化方式，通常要用到凝膠過濾，離子交換和親和層析等純化方法[13]。本研究表達(dá)的His-△CD46融合蛋白在試驗(yàn)設(shè)計(jì)之初擬采用His親和層析純化，但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)純化的融合蛋白并未達(dá)到預(yù)期的純度且純化步驟煩瑣費(fèi)時(shí)，往往一次所能純化的蛋白量很有限，為獲得所需蛋白用量需多次反復(fù)進(jìn)行。切膠免疫的應(yīng)用則提供了便利，分離的蛋白不僅純度高而且凝膠在研磨后可以起到類似于免疫佐劑樣的作用。陳鴻軍等[14]研究證實(shí)用，切膠純化重組蛋白免疫接種動(dòng)物能滿足制備單克隆抗體的要求。本研究用該法獲得高純度融合蛋白后免疫家兔制備抗血清，間接ELISA 測(cè)定多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示抗體效價(jià)高于1∶12 8000，試驗(yàn)結(jié)果再次證明切膠免疫可以制備出高效價(jià)的抗血清。

特異性檢測(cè)在制備多克隆抗體中是必不可少的[15]，本研究采取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pVAX1-△CD46轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行目的蛋白真核表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物以制備的兔抗His-△CD46融合蛋白多克隆抗體為一抗，采用Western blot檢測(cè)該多克隆抗體的特異性，結(jié)果表明制備的抗牛CD46陽性血清能識(shí)別真核表達(dá)的目的蛋白，具有較好的特異性。

綜上所述，本研究首次擴(kuò)增到牛CD46基因，在對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)分析的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建真核和原核表達(dá)質(zhì)粒，并用誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白免疫接種新西蘭大白兔制備了抗牛CD46的多克隆抗體，為今后牛CD46生物學(xué)功能的研究積累了數(shù)據(jù)與材料。

[1] Liszewski M K,Atkinson J P.Complement regulator CD46:genetic variants and disease associations[J].Human Genomics，2015，9(1)：7．

[2] Cardone J,Le F G,Kemper C，et al．CD46 in innate and adaptive immunity:an update[J]．Clin Exp Immunol，2011，164(3)：301-311．

[3] Yamamoto H,Fara A F,Dasgupta P，et al．CD46:the ‘multitasker’ of complement proteins[J]．Int J Biochem Cell B，2013，45(12)：2808-2820．

[4] Price J D,Schaumburg J，Sandin C，et al．Induction of a regulatory phenotype in human CD4+T cells by streptococcal M protein[J]．J Immunol，2005，175(2)：677-684．

[5] Li K,Zhou W,Hong Y，et al．Synergy between type 1 fimbriae expression and C3 opsonisation increases internalisat ion ofE.coliby human tubular epithelial cells[J]．BMC Microbiol，2009(9)：64．

[6] Maurer K,Krey T,Moennig V，et al．CD46 is a cellular receptor for bovine viral diarrhea virus[J]．J Virol，2004，78(4)：1792-1799．

[7] Krey T,Himmelreich A,Heimann M，et al．Function of bovine CD46 as a cellular receptor for bovine viral diarrhea virus is determined by complement control protein 1[J]．J Virol，2006，80(8)：3912-3922．

[8] Lecot S,Belouzard S,Dubuisson J，et al．Bovine viral diarrhea virus entry is dependent on clathrin-medi- ated endocytosis [J]．J Virol，2005，79(16)：10826-10829．

[9] Kotani O,Iwatayoshikawa N,Suzuki T，et al．Establishment of a panel of in-house polyclonal antibodies for the diagnosis of enterovirus infections[J]．Neuropathology，2014，35(2)：107-121．

[10] 張淑莉,李 妮,張 琪．兔抗傷寒桿菌免疫血清在免疫學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015(18)：2661-2663．

[11] 鐘運(yùn)華．SmD1蛋白表達(dá)與免疫原性研究及其抗體檢測(cè)初步應(yīng)用[D]．廣東廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2014．

[12] Studier F W．Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system [J]．J Mol Biol，1991，219(1)：37-44．

[13] 宗 超．重組人胰島素樣生長因子-1在大腸桿菌中的高效表達(dá)和分離純化[D]．浙江杭州：浙江大學(xué)，2013．

[14] 陳鴻軍,宋翠萍,秦愛建,等．MDV-1 VP22羧基端在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)[J]．中國病毒學(xué)，2006，21(2)：169-172．

[15] 張 迪,張 瑜,陳丹陽,等．OGT多克隆抗體的制備及特異性分析[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016(3)：414-418．

Abstract:This study aimed to clone and express the CD46 gene from Xinjiang brown cattle and prepare its polyclonal antibody．In this experiment，CD46 gene was amplified from spleen of Xinjiang brown cattle by RT-PCR technique，and after conducting bioinformatics analysis some of this gene fragments were cloned into pVAX1 and pET-28a expression vectors．In order to express target protein，pET28a-△CD46 was transformed intoE.coliRosetta．His-△CD46 expression was induced by IPTG，and then the yield of expressed protein was used to prepare polyclonal antibody in New Zealand white rabbit．Then ELISA method was applied to determine the produced polyclonal antibody titer against bovine CD46．Meanwhile，the recombinant expression plasmid pVAX1-△CD46 was transfected into BHK-21 cells，and then the expressed products were detected via the polyclonal antibody．Results from DNA sequencing of the CD46 full-length gene and size of proteins from CD46 gene fragments was consistent with our expectations．Data from ELISA indicated that titer of the polyclonal antibody was higher than 1∶128 0000，and the antibody also had a good specificity,which was confirmed by Western blot．By this experiment，the His-△CD46 protein was successfully expressed，and a specific polyclonal antibody against bovine CD46 prepared，which provided scientific and material basis for further study on biological function of bovine CD46 gene.

Keywords:Xinjiang brown cattle; CD46; expression; fusion protein; polyclonal antibody

ProkaryoticExpressionofXinjiangBrownCattleCD46GeneandPolyclonalAntibodyPreparationMuhametjan T，

ZHANG Hui-min，DU Run-ci，Jarhin，SU Zhan-qiang，RAN Duo-liang，LIU Jian-hua

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi，Xinjiang，830052,China)

S823.89

A

1007-5038(2017)08-0033-06

2016-12-01

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013211A030)

木哈買提江·鐵格斯(1988-)，男，新疆阿勒泰人，碩士，主要從事分子病毒學(xué)研究。*