橙皮素對異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心衰的保護作用

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

橙皮素對異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心衰的保護作用

曹靜1，呂吉元1，張明升2，師銳贊2，馮巧愛3

目的觀察橙皮素對大劑量異丙基腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)大鼠心衰的保護作用，并探討其機制。方法將SD大鼠隨機分為正常(C)組、橙皮素對照(H)組、異丙基腎上腺素(I)組和橙皮素治療+I(T)組，I組和T組接受皮下注射大劑量ISO(150 mg/kg)，2周后行超聲心動圖檢測。確定造模成功后，H組及T組給予橙皮素(100 mg/kg)灌胃，I組給予等量的溶劑乙醇，連續(xù)給藥10 d后測定各組大鼠心臟功能包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分數(shù)(EF)、左室縮短分數(shù)(FS)變化及血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(TAOC)的變化，觀察各組大鼠心肌的病理變化。結(jié)果與C組比較，I組LVEDD變化不大，LVESD值增大、EF、FS降低，氧化應(yīng)激指標中MDA值升高，SOD、TAOC降低，各指標差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與I組比較，T組大鼠LVEDD無明顯變化，LVESD降低，EF、FS升高，血清MDA值降低，SOD、TAOC升高，各指標差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。H組各指標較C組無明顯變化。結(jié)論橙皮素可能通過減輕氧化應(yīng)激，降低MDA，升高SOD、TAOC，從而改善心衰大鼠的心臟功能。

心衰；橙皮素；異丙基腎上腺素；氧化應(yīng)激；大鼠

Abstract:ObjectiveTo explore the protective effects and possible mechanisms of hesperetin against isoproterenol (ISO)-induced heart failure (HF) in rats.MethodsForty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups：control group(group C)， hesperetin group (group H)， isoproterenol group (group I)and H+I group (group T). Rats in group I and group T were subcutaneously injected with ISO (150 mg/kg) once a day for 2 consecutive days.The model was successfully established in heart failure was determined by echocardiography after 2 weeks. Hesperetin was administered at the dosage of 100 mg/kg， po by gavage for a period of 10 days in group H and group T. Cardiac function of all rats including left ventricular end-diastolic diameter (LVEDD)， left ventricular end-systolic dimension (LVESD)， left ventricular ejection fractions (EF)， left ventricular fractional shortening (FS) was assessed by echocardiography. Collecting serum of all rats， malondialdehyde (MDA)，superoxide dismutase (SOD)， total antioxidant capacity (TAOC) were detected by thiobarbiturieacid colorimetry， WST-1 method and colorimetry method respectively.ResultsThere was not obvious changes of cardiac function in group C and group H. ISO inhibited the cardiac function of rats significantly including LVESD， EF， as well as FS， compared to group C(P<0.05). LVESD was increased while EF and FS were decreased. The level of MDA in group I was significantly higher (P<0.05) while the levels of SOD and TAOC were significantly lower than group C (P<0.05). Hesperetin attenuated the effect of heart failure induced by ISO. Cardiac function of rats including LVESD， EF，as well as FS was improved in group T compared to group I (P<0.05).LVESD was declined， EF and FS were ascended. The level of MDA was significantly lower，the levels of SOD，TAOC in group T were significantly higher than that in group I (P<0.05).ConclusionHesperetin can attenuate ISO-induced heart failure in rats. Its possible mechanisms may be associated with regulating oxidative stress.

Keywords：heart failure；hesperetin；isoproterenol；oxidative stress；rat

目前我國心臟疾病發(fā)病率和死亡率仍呈增高趨勢，發(fā)病人群趨于年輕化，增加了社會經(jīng)濟負擔(dān)，降低了人群平均壽命。各種心血管疾病的終末階段即進展成為心衰，治療效果差，死亡率高[1]。盡管目前癥狀性心衰的治療有大量重要的進展，心衰死亡以及心衰相關(guān)的花費仍然在持續(xù)增加[2]。由于我國人口老齡化加速和包括糖尿病以及高血壓等疾病患病率的增加，未來十年，心衰發(fā)病率仍會增加。活性氧信號在維持細胞生存和功能過程中發(fā)揮正常生理信號分子的作用，調(diào)節(jié)心血管信號的正常傳導(dǎo)[3]，多項證據(jù)表明，氧化應(yīng)激參與了心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，過度的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)多種心血管疾病和狀態(tài)，最終引發(fā)心衰。橙皮素(5，7，3-三羥基-4 甲氧雙氫黃酮)是普遍存在于柑橘類水果的生物黃酮素[4- 5]。

橙皮素具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、抗高血壓和抗致動脈粥樣硬化效應(yīng)[6- 7]。在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中，橙皮素通過抗氧化作用，降低DNA損失，減輕凋亡保護心臟[8]。橙皮素通過抑制心肌肥厚及纖維化，減輕氧化應(yīng)激和心肌細胞凋亡改善壓力超負荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)，可能為心室重構(gòu)和心衰的治療提供新思路[9]。異丙基腎上腺素是一種合成的兒茶酚胺，屬于非選擇性的β腎上腺素受體激動劑。研究發(fā)現(xiàn)異丙基腎上腺素以劑量依賴的方式迅速引起左室功能的下降[10]，皮下注射大劑量異丙基腎上腺素可誘導(dǎo)在體動物心衰[11- 12]。本研究采用大劑量異丙基腎上腺素皮下注射模擬大鼠心衰模型，探索橙皮素對異丙基腎上腺素誘導(dǎo)致心衰的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawler(SD)大鼠(3～4)月齡，體重(200～220) g 40只，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號SCXK晉2009-0001)。常規(guī)飼料喂食，自由飲水。所有用于研究的動物遵照國家實驗室動物健康管理與使用指南；所有動物操作都經(jīng)過校級倫理委員會審批通過。

1.2 試劑與儀器 橙皮素、異丙基腎上腺素粉末購自Sigma公司；微量丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化物能力(TAOC)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。主要設(shè)備為超聲心動儀，型號為VEVO高分辨率小動物超聲儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 40只大鼠隨機分為4組，每組10只。正常(C組)、橙皮素對照(H組)、異丙基腎上腺素(I組)、橙皮素治療(T組)。依照文獻方法建立由異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心衰模型[11]，異丙基腎上腺素150 mg/kg，皮下注射，24 h后重復(fù)注射一次。心衰診斷標準為超聲心動圖檢查示左室短軸縮短率(FS)≤30%[13]。給藥兩周后行超聲心動圖檢查，20只大鼠中除2只外，均達到心衰標準，提示造模成功。18只大鼠進一步隨機安排接受橙皮素治療(T)或服用等量溶劑乙醇(I)組；橙皮素治療組根據(jù)文獻以乙醇溶解，采用100 mg/kg劑量灌胃，連續(xù)10 d[14]。

1.3.2 各組大鼠超聲心動圖檢測心功能指標 實驗結(jié)束，各組存活大鼠行經(jīng)胸超聲心動圖檢測。經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉SD大鼠，麻妥，固定大鼠后左前胸備皮，應(yīng)用超聲心動儀及頻率為8 MHz的線陣探頭行超聲檢測，測量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室射血分數(shù)(EF)及左室短軸縮短率(FS)。測定值為三個心動周期的平均值。

1.3.3 各組大鼠血清中MDA，SOD，TAOC的檢測 超聲檢測結(jié)束后，于大鼠腹主動脈取血，經(jīng)4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清，采用硫代巴比妥酸TBA法測定丙二醛、水溶性四唑鹽WST-1法測定超氧化物歧化酶、比色法測定總抗氧化能力。所有檢測重復(fù)3次，操作步驟嚴格按試劑盒說明進行。

1.3.4 各組心臟組織病理學(xué)改變 取左心室心肌組織用10%甲醛固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋。各組石蠟包埋的心臟組織切成5 μm切片，放置于清蛋白覆蓋的玻璃載片上，干燥過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇再水化，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察心肌病理結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠超聲心動圖結(jié)果比較 異丙基腎上腺素組大鼠LVEDD變化不明顯，LVESD較正常組增大(P<0.05)；EF、FS較正常組降低(P<0.05)。橙皮素治療組大鼠LVESD較模型組降低(P<0.05)；EF、FS較異丙基腎上腺素組增高(P<0.05)。橙皮素對照組各指標與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖1、2。

C H I T

注：C為正常組，H為橙皮素對照組，I為異丙基腎上腺素組，T為橙皮素治療組。與C組相比，*P<0.05；與I組相比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)比較 與正常組相比，異丙基腎上腺素組大鼠血清MDA明顯高于正常組，SOD、TAOC顯著低于正常組(P<0.05)。詳見表1。異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化系統(tǒng)受損，抗氧化能力明顯下降。橙皮素治療組MDA明顯低于異丙基腎上腺素組(P<0.05)，SOD、TAOC顯著高于異丙基腎上腺素組(P<0.05)，提示橙皮素具有抗氧化作用，減輕了異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。橙皮素對照組各氧化應(yīng)激指標與正常組比較無明顯差異。詳見表1。

2.3 各組心臟標本病理學(xué)改變 肉眼可見正常組及橙皮素對照組大鼠心臟顏色紅潤，異丙基腎上腺素組大鼠心臟顏色發(fā)暗，局灶發(fā)白；光鏡下正常組及橙皮素對照組大鼠心臟可見心肌細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，異丙基腎上腺素組見局部心肌細胞結(jié)構(gòu)紊亂，細胞變性，灶性壞死，組織間隙不規(guī)則增寬，間質(zhì)水腫，橙皮素治療組上述病理改變較異丙基腎上腺素組減輕。詳見圖3。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD、TAOC的比較(±s)

注：C為正常組，H為橙皮素對照組，I為異丙基腎上腺素組，T為橙皮素治療組。

3 討 論

目前，心衰已經(jīng)成為全球主要的健康和經(jīng)濟負擔(dān)，盡管現(xiàn)代的藥物治療和植入裝置治療，心衰仍有很高的死亡率[15]。心衰是一個復(fù)雜的臨床綜合征，產(chǎn)生的機制復(fù)雜，探討其發(fā)病機制，探索具有心肌保護作用的藥物是目前研究的熱點。橙皮素在對抗各種應(yīng)激引起的細胞及機體損傷中發(fā)揮多種不同的生物活性[6-7]。研究表明，橙皮素對應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡及心臟損傷有保護作用[16- 17]，但確切的機制仍不清楚。

心肌收縮性減弱是心衰發(fā)生的基礎(chǔ)，引起心肌收縮性減弱的發(fā)生機制之一是心肌細胞數(shù)量減少，心肌細胞數(shù)量減少主要見于兩種形式即：心肌細胞壞死和心肌細胞凋亡。異丙基腎上腺素可引起心肌缺血甚至心肌梗死，導(dǎo)致心肌細胞壞死；同時異丙腎上腺素可引起氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[18]，最終導(dǎo)致心衰的發(fā)生。大劑量異丙基腎上腺素皮下注射后，引起大鼠心臟左室收縮功能下降，收縮末內(nèi)徑增加，射血分數(shù)下降，心臟功能受損，與文獻報道一致[11]。

心肌氧化應(yīng)激引起心肌細胞結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙，促進心衰的發(fā)生[19]。β腎上腺素受體激動劑通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體死亡通路的活化，刺激心肌細胞凋亡[20- 21]。本研究結(jié)果顯示，異丙基腎上腺素作用后大鼠血清MDA上升，提示機體促氧化水平上升，而SOD、TAOC降低，提示抗氧化水平下降，機體存在氧化應(yīng)激；橙皮素治療組大鼠血清MDA下降，SOD、TAOC上升，提示橙皮素減輕異丙基腎上腺素引起的氧化應(yīng)激，改善異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟功能障礙，與文獻報道一致[17]。

橙皮素對異丙基腎上腺素引起的大鼠心臟功能受損有明顯的改善作用，降低左室收縮末期內(nèi)徑，提高了射血分數(shù)及縮短分數(shù)，減輕心衰；其可能的原因是橙皮素減輕氧化應(yīng)激，減輕心肌細胞凋亡，最終減輕了異丙基腎上腺素對心臟功能的損害。本研究結(jié)果為心衰治療及心衰藥物研發(fā)提供了新思路和作用靶點。該結(jié)果初步探討了橙皮素治療心衰中的臨床療效，由于樣本量較小，需擴大樣本量及增加檢測指標進一步探討其保護作用及具體的機制。

[1] Kannel WB. Epidemiology and prevention of cardiac failure：framingham study insights[J].Eur Heart J，1987，8F： 23-26.

[2] McMurray JJ，Adamopoulos S，Anker SD，et al.ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012： The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology.Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC[J].Eur J Heart Fail，2012，14(8)： 803-869.

[3] Schmitz U，Thommes K，Beier I，et al.Angiotensin Ⅱ-induced stimulation of p21-activated kinase and c-Jun NH2-terminal kinase is mediated by Rac1 and Nck[J].J Biol Chem，2001，276(25)： 22003-22010.

[4] Xiao L，Pimentel DR，Wang J，et al.Role of reactive oxygen species and NAD(P)H oxidase in alpha(1)-adrenoceptor signaling in adult rat cardiac myocytes[J].Am J Physiol Cell Physiol，2002，282(4)： C926-934.

[5] Li JM，Gall NP，Grieve DJ，et al.Activation of NADPH oxidase during progression of cardiac hypertrophy to failure[J].Hypertension，2002，40(4)： 477-484.

[6] Galati EM，Trovato A，Kirjavainen S，et al.Biological effects of hesperidin，a Citrus flavonoid(Note Ⅲ)： antihypertensive and diuretic activity in rat[J].Farmaco，1996，51(3)： 219-221.

[7] Garg A，Garg S，Zaneveld LJ，et al.Chemistry and pharmacology of the Citrus bioflavonoid hesperidin[J].Phytother Res，2001，15(8)： 655-669.

[8] Trivedi PP，Kushwaha S，Tripathi DN，et al.Cardioprotective effects of hesperetin against doxorubicin-induced oxidative stress and DNA damage in rat[J].Cardiovasc Toxicol，2011，11(3)： 215-225.

[9] Deng W，Jiang D，F(xiàn)ang Y，et al.Hesperetin protects against cardiac remodelling induced by pressure overload in mice[J].J Mol Histol，2013，44(5)： 575-585.

[10] Beznak M.Hemodynamics during the acute phase of myocardial damage caused by isoproterenol[J].Can J Biochem Physiol，1962，40： 25-30.

[11] Grimm D，Elsner D，Schunkert H，et al.Development of heart failure following isoproterenol administration in the rat： role of the renin-angiotensin system[J].Cardiovasc Res，1998，37(1)： 91-100.

[12] Teerlink JR，Pfeffer JM，Pfeffer MA.Progressive ventricular remodeling in response to diffuse isoproterenol-induced myocardial necrosis in rats[J].Circ Res，1994，75(1)： 105-113.

[13] Xu K，George I，Klotz S，et al.Erythropoietin derivate improves left ventricular systolic performance and attenuates left ventricular remodeling in rats with myocardial infarct-induced heart failure[J].J Cardiovasc Pharmacol，2010，56(5)： 506-512.

[14] Kumar M，Dahiya V，Kasala ER，et al.The renoprotective activity of hesperetin in cisplatin induced nephrotoxicity in rats： Molecular and biochemical evidence[J].Biomed Pharmacother，2017，89： 1207-1215.

[15] Sundaram V，F(xiàn)ang JC.Gastrointestinal and liver issues in heart failure[J].Circulation，2016，133(17)： 1696-1703.

[16] Yang Z，Liu Y，Deng W，et al.Hesperetin attenuates mitochondria-dependent apoptosis in lipopolysaccharide-induced H9C2 cardiomyocytes[J].Mol Med Rep，2014，9(5)： 1941-1946.

[17] Agrawal YO，Sharma PK，Shrivastava B，et al.Hesperidin blunts streptozotocin-isoproternol induced myocardial toxicity in rats by altering of PPAR-gamma receptor[J].Chem Biol Interact，2014，219： 211-220.

[18] Lai L，Yan L，Gao S，Hu CL，et al.Type 5 adenylyl cyclase increases oxidative stress by transcriptional regulation of manganese superoxide dismutase via the SIRT1/FoxO3a pathway[J].Circulation，2013，127(16)： 1692-1701.

[19] Redout EM，Wagner MJ，Zuidwijk MJ，et al.Right-ventricular failure is associated with increased mitochondrial complex II activity and production of reactive oxygen species[J].Cardiovasc Res，2007，75(4)： 770-781.

[20] Remondino A，Kwon SH，Communal C，et al.Beta-adrenergic receptor-stimulated apoptosis in cardiac myocytes is mediated by reactive oxygen species/c-Jun NH2-terminal kinase-dependent activation of the mitochondrial pathway[J].Circ Res，2003，92(2)： 136-138.

[21] Ito M，Adachi T，Pimentel DR，et al.Statins inhibit beta-adrenergic receptor-stimulated apoptosis in adult rat ventricular myocytes via a Rac1-dependent mechanism[J].Circulation，2004，110(4)： 412-418.

Cardioprotective Effects of Hesperetin Against ISO-induced Heart Failure in Rats

Cao Jing， Lv Jiyuan， Zhang Mingsheng， Shi Ruizan， Feng Qiaoai

The First Hospital， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， Shanxi， China Corresponding Author： Lü Jiyuan

R285.5 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.006

1672-1349(2017)18-2241-04

2017-05-21)

(本文編輯 王雅潔)

山西省國際科技合作基金(No.2012081046)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)；3.山西博愛醫(yī)院

呂吉元，E-mail：13834691242@163.com

信息：曹靜，呂吉元，張明升，等.橙皮素對異丙基腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心衰的保護作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(18)：2241-2244.