芳維甲酸乙酯在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

楊輝，周遠(yuǎn)大，何海霞，孫紀(jì)紅

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶400016；2.重慶市中醫(yī)院麻醉科，重慶 400011）

芳維甲酸乙酯在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

楊輝1＊，周遠(yuǎn)大1，何海霞1，孫紀(jì)紅2#

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶400016；2.重慶市中醫(yī)院麻醉科，重慶 400011）

目的：研究芳維甲酸乙酯（RO）在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：18只Beagle犬隨機(jī)分為高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），每組6只，ig相應(yīng)劑量的RO。給藥后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0、72.0 h時(shí)于小隱靜脈采血1 mL，分離血漿，采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血漿中RO及其代謝產(chǎn)物芳維甲酸乙酸（RA）的濃度；采用DAS 2.0軟件進(jìn)行擬合，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：RO和RA在犬體內(nèi)均呈一室模型分布。RO高、中、低劑量組犬體內(nèi)的cmax分別為（1.42±0.87）、（0.54±0.09）、（0.31±0.05）μg/mL，t1/2z分別為（1.20±0.33）、（1.14±0.45）、（1.90±0.65）h，AUC0-72h分別為（3.55±0.90）、（0.87±0.50）、（0.92±0.31）μg·h/mL，CL/F分別為（11.99±4.01）、（19.87±10.79）、（12.29±7.57）L/（kg·h）；RA高、中、低劑量組犬體內(nèi)的cmax分別為（32.51±4.04）、（19.87±2.78）、（16.55±4.06）μg/mL，t1/2z分別為（7.27±4.20）、（7.17±4.20）、（10.18±4.01）h，AUC0-72h分別為（408.14±96.61）、（333.39±61.28）、（286.55±30.96）μg·h/mL，CL/F分別為（1.30±0.53）、（0.76±0.87）、（0.54±0.10）L/（kg·h）。結(jié)論：RO口服極易吸收，且消除迅速，其活性代謝產(chǎn)物RA在體內(nèi)蓄積時(shí)間較長(zhǎng)。

芳維甲酸乙酯；芳維甲酸乙酸；藥動(dòng)學(xué)；Beagle犬；反相高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the pharmacokinetic characteristics of arotinoid ethyl ester（RO）in Beagle dogs in vivo.METHODS：18 Beagle dogs were randomly divided into high-dose，medium-dose，low-dose groups（40，20，10 mg/kg），6 in each group.Rats were intragastrically administrated related doses of RO.Blood sample 1 mL was taken after 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0，60.0，72.0 h of administration，and plasma was separated.RP-HPLC was used to determine the concentrations of RO and its metabolite arotinoid acetic acid（RA）in plasma.Using DAS 2.0 software for fitting，pharmacokinetic parameters were calculated.RESULTS：Both RO and RA showed a distribution in one-compartment model in dogs in vivo.The cmaxof RO high-dose，medium-dose，low-dose groups in dogs in vivo were（0.42±0.87），（0.54±0.09），（0.31±0.05）μg/mL；t1/2zwere（1.20±0.33），（1.14±0.45），（1.90±0.65）h；AUC0-72hwere（3.55±0.90），（0.87±0.50），（0.92±0.31）μg·h/mL；and CL/F were（11.99±4.01），（19.87±10.79），（12.29±7.57）L/（kg·h）.The cmaxof RA high-dose，medium-dose，low-dose groups in dogs in vivo were（32.51±4.04），（19.87±2.78），（16.55±4.06）μg/mL；t1/2zwere（7.27±4.20），（7.17±4.20），（10.18±4.01）h；AUC0-72hwere（408.14±96.61），（333.39±61.28），（286.55±30.96）μg·h/mL；and CL/F were（1.30±0.53）、（0.76±0.87）、（0.54±0.10）L/（kg·h）.CONCLUSIONS：Orally taking RO is easy to absorb with rapid elimination.Its active metabolite RA has longer accumulation time in vivo.

KEYWORDSArotinoid ethylester；Arotinoid acetic acid；Pharmacokinetics；Beagle dog；RP-HPLC

維甲酸類藥物是天然或合成的具有維生素A活性的視黃醇衍生物，芳維甲酸乙酯（RO）是第三代維甲酸類藥物的代表。RO是一種強(qiáng)效、長(zhǎng)效誘導(dǎo)分化劑，主要用于治療嚴(yán)重的銀屑病，角化性皮膚病，風(fēng)濕性、免疫性疾病，惡性腫瘤，白血病等[1-5]。RO最早由羅氏公司在英國(guó)上市，我國(guó)于1992年進(jìn)口，國(guó)內(nèi)陸續(xù)有一些廠家仿制，2010年后，國(guó)內(nèi)不再有廠家生產(chǎn)。作為第三代維甲酸類藥物唯一的口服制劑，RO對(duì)銀屑病的治療有特效且副作用最低。鑒于此，筆者擬重新開(kāi)發(fā)RO制劑。目前，關(guān)于RO藥動(dòng)學(xué)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為闡明其體內(nèi)過(guò)程，筆者研究了RO在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。

1 材料

1.1 儀器

P200Ⅱ型高效液相色譜儀，包括UV200Ⅱ型檢測(cè)器（大連依利特科學(xué)儀器有限公司）；HP3295型積分儀（惠普上海分析儀器有限公司）；UV-265型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；TG1850-WS型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)療器械六廠）。

1.2 藥品與試劑

RO原料藥（批號(hào)：13-6298，純度99.4%）、芳維甲酸乙酸（RA）原料藥（批號(hào)：980，純度：99.6%）、維胺酯（VA，批號(hào)：980616，純度：99.7%）均由重慶華邦制藥有限公司提供；甲醇、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康合格一級(jí)Beagle犬18只，體質(zhì)量（9.0±1.0）kg，6月齡，♀♂各半，由四川養(yǎng)麝研究所提供，質(zhì)量合格證號(hào)和環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)分別為川實(shí)動(dòng)管63號(hào)、64號(hào)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用反相高效液相色譜法。色譜柱：μBondapak C18（150 mm×4.6 mm，10 μm），預(yù)柱：C18；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（90∶9∶1，V/V/V，pH 3.0）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

精密稱取RO原料藥結(jié)晶粉末，用甲醇制備成588 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，低溫保存。精密稱取RA原料藥，用甲醇制備成474 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，低溫保存。精密稱取VA，用甲醇制備成640 ng/mL的溶液，即為VA內(nèi)標(biāo)液，低溫保存。

2.3 血漿樣品處理

取空白血漿1.0 mL，加入VA內(nèi)標(biāo)液10 μL、50%冰醋酸0.4 mL，混勻，加入三氯甲烷4 mL，振搖5 min，15 000 r/min（離心半徑6 cm）離心3 min，取有機(jī)層，60℃水浴中氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專屬性 取空白血漿、空白血漿+VA內(nèi)標(biāo)液、空白血漿+VA內(nèi)標(biāo)液+RO標(biāo)準(zhǔn)貯備液+RA標(biāo)準(zhǔn)貯備液、血漿樣品（給藥后2 h）+VA內(nèi)標(biāo)液，預(yù)處理后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果表明，RO、RA、VA與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，RO、RA、VA的保留時(shí)間分別為17.78、9.41、12.56 min，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 線性回歸與定量下限考察 在空白血漿中分別加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的RO標(biāo)準(zhǔn)貯備液和RA標(biāo)準(zhǔn)貯備液，使 RO質(zhì)量濃度為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 ng/mL，RA 質(zhì)量濃度為 0.041、0.12、0.37、1.11、3.33、10.00、30.00 μg/mL的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為RO：y＝0.037 59x+9.660 0（r＝0.998 6，n＝5），RA：y＝0.107 0x+1.005 2（r＝0.999 7，n＝5）。結(jié)果表明，RO和RA檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為6.25～800、0.041～30.00 μg/mL，定量下限分別為6.25、0.041 μg/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別制備RO低、中、高質(zhì)量濃度（16.67、400、600 ng/mL）和RA低、中、高質(zhì)量濃度（0.12、16.65、22.5 μg/mL）的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析。各樣品重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度；以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，RO各質(zhì)量濃度血漿樣品的日內(nèi)RSD為3.09%～9.18%（n＝5），日間RSD為 6.41%～11.47%（n＝5），準(zhǔn)確度為 92.0%～115.0%（n＝5）；RA各質(zhì)量濃度血漿樣品的日內(nèi)RSD為2.92%～5.38%（n＝5），日間 RSD 為 5.93%～9.62%（n＝5），準(zhǔn)確度為97.40%～105.4%（n＝5）。

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 分別制備RO低、中、高質(zhì)量濃度（16.67、400、600 ng/mL）和RA低、中、高質(zhì)量濃度（0.12、16.65、22.5 μg/mL）的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為A1；另將空白血漿1.0 mL加入至相應(yīng)質(zhì)量濃度的RO、RA的標(biāo)準(zhǔn)貯備液中，使最終質(zhì)量濃度與前者相對(duì)應(yīng)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄峰面積A2；計(jì)算提取回收率（A1/A2×100%）。結(jié)果顯示，RO各質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率分別為91.86%、97.78%、94.69%（RSD＝2.00%，n＝3）；RA各質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率分別為95.50%、95.70%、94.17%（RSD＝0.63%，n＝3）。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別制備RO低、中、高質(zhì)量濃度（16.67、400、600 ng/mL）和RA低、中、高質(zhì)量濃度（0.12、16.65、22.5 μg/mL）的血漿樣品各5份，分別于 4 ℃放置24 h、室溫放置14 h、樣品預(yù)處理后室溫放置24 h、反復(fù)凍融3次、－20℃冷凍保存50 d，然后按相應(yīng)要求進(jìn)行處理，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，RO和RA低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品在4℃放置24 h的RSD分別為2.99%、9.46%、6.72%和7.04%、7.16%、9.54%；室溫放置14 h的RSD分別為8.98%、1.05%、5.96%和7.21%、5.31%、2.46%；樣品預(yù)處理后室溫放置24 h的RSD分別為9.07%、8.42%、6.15%和5.89%、6.80%、9.22%；反復(fù)凍融3次的RSD分別為7.41%、5.20%、4.06%和3.77%、3.67%、3.87%；－20℃冷凍保存50 d的RSD分別為4.82%、7.81%、9.73%和9.47%、8.37%、4.44%（n＝5）。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

將18只Beagle犬隨機(jī)分為高、中、低劑量組（40、20、10 mg/kg），每組6只，于實(shí)驗(yàn)前12 h禁食。實(shí)驗(yàn)時(shí)按各組犬體質(zhì)量計(jì)算每只犬的具體RO給藥量，然后將藥物用2號(hào)膠囊封裝為2粒，ig給藥，待8 h后再供食。給藥后 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0、72.0 h時(shí)于小隱靜脈采血1 mL，分離血漿（肝素抗凝），依法測(cè)定血漿中RO及其代謝產(chǎn)物RA的濃度，繪制藥-時(shí)曲線。各組犬體內(nèi)RO、RA的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 各組犬體內(nèi)RO、RA的藥-時(shí)曲線Fig 2 Concentration-time curves of RO and RA in dogs in vivo of each group

采用DAS 2.0軟件進(jìn)行房室模型擬合，選擇最佳藥動(dòng)學(xué)模型，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。各組犬體內(nèi)RO、RA的藥動(dòng)學(xué)房室模型擬合結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組犬體內(nèi)RO、RA的藥動(dòng)學(xué)房室模型擬合結(jié)果Tab 1 Results of pharmacokinetic compartment model fitting of RO and RAin vivo in each group

由表1可知，當(dāng)房室模型為一室模型，權(quán)重系數(shù)為1/C2時(shí)，RO和RA的AIC均最小，且R2越接近1，表明Beagle犬體內(nèi)血漿中RO和RA的血藥濃度隨時(shí)間的變化符合一室模型，權(quán)重系數(shù)1/C2擬合較佳。以此計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組犬體內(nèi)RO、RA的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果（x±s，n＝6）Tab 2 Results of pharmacokinetic compartment model fitting of RO and RA in vivo in dogs of each group（x±s，n＝6）

由表2可知，AUC0-72h、cmax與RO的給藥劑量均成正相關(guān)，符合一級(jí)藥動(dòng)學(xué)特征；V1/F結(jié)果提示RO不僅分布在血液中，也分布在組織中；CL/F和t1/2z提示RO的消除迅速。

3 討論

RO和RA都有的“反二苯乙烯”的共軛結(jié)構(gòu)使其具有相似的紫外吸收光譜，RO的最大吸收波長(zhǎng)為294 nm，RA的最大吸收波長(zhǎng)為296 nm[6]?？紤]到本實(shí)驗(yàn)條件下RO的檢測(cè)靈敏度較RA低，因此選擇294 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本研究建立了反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定RO和RA濃度，結(jié)果表明，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物的測(cè)定，相關(guān)方法學(xué)考察結(jié)果均滿足生物樣品檢測(cè)的要求[7]。

Beagle犬分別ig給予RO 40、20、10 mg/kg劑量后，RO和RA的AUC0-∞分別為（3.61±8.34）、（1.00±0.59）、（1.02±0.37）μg·h/mL和（477.91±80.05）、（337.71±64.00）、（290.83±31.46）μg·h/mL，劑量之比均為4∶2∶1，對(duì)應(yīng)的AUC0-∞之比分別為3∶1∶1和5∶3∶3，表明AUC0-∞與給藥劑量呈非線性正相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RO口服極易吸收，大約于給藥后0.5 h即在血中出現(xiàn)較高濃度，3 h左右達(dá)峰濃度，8 h左右血藥濃度已降至較低濃度或難以測(cè)出，表明RO脂溶性較高、易于吸收，能迅速分布到外周圍組織而不是高度集中在血液或循環(huán)豐富的組織器官，避免了對(duì)器官損害，符合臨床要求。此外，RO進(jìn)入體內(nèi)后，部分藥物即行分解為RA，RA于給藥后0.5 h即出現(xiàn)在血中，約8 h時(shí)達(dá)峰濃度，持續(xù)至72 h尚可測(cè)到。由于RA也具備與RO相同的防治銀屑病的作用，RA在體內(nèi)蓄積時(shí)間較長(zhǎng)，也為防治銀屑病或增強(qiáng)機(jī)體免疫提供了有利條件。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on the Pharmacokinetics of Arotinoid Ethylester in Beagle Dogs

YANG Hui1，ZHOU Yuanda1，HE Haixia1，SUN Jihong2
（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Dept.of Anesthesiology，Chongqing TCM Hospital，Chongqing 400011，China）

R961；R965

A

1001-0408（2017）25-3522-03

10.3969/j.issn.1673-5846.

2017-02-08

2017-06-01）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.18

＊主管藥師，博士。研究方向：新藥的研究開(kāi)發(fā)、醫(yī)院藥學(xué)。電話：023-89012224。E-mail：yanghui_023@126.com

#通信作者：主管護(hù)師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：023-61802573。E-mail：844406527@qq.com