白葉茶鮮葉制益生茶的急性、慢性毒性試驗(yàn)研究

孫凱，黎順庚，王光光，范文桐，王玲，卞建春*

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；

2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.江蘇溧陽(yáng)市天目湖龍?chǎng)翁厣r(nóng)機(jī)專業(yè)合作社，江蘇溧陽(yáng) 213334）

白葉茶鮮葉制益生茶的急性、慢性毒性試驗(yàn)研究

孫凱1，2，黎順庚3，王光光1，2，范文桐1，2，王玲1，2，卞建春1，2*

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；

2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；3.江蘇溧陽(yáng)市天目湖龍?chǎng)翁厣r(nóng)機(jī)專業(yè)合作社，江蘇溧陽(yáng) 213334）

為了探明白葉茶鮮葉制益生茶作為保健茶的毒理學(xué)安全性，以不同濃度的益生茶為原料，對(duì)SD大鼠同時(shí)進(jìn)行急性和慢性毒性試驗(yàn)。急性毒性試驗(yàn)，清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組每天以5 mL/kg·BW濃度5%益生茶液灌胃，對(duì)照組灌服等量生理鹽水，試驗(yàn)期為14 d，觀察相關(guān)生理體征變化。慢性毒性試驗(yàn)，清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和益生茶高、中、低劑量組共四組，益生茶對(duì)應(yīng)各組自由飲用濃度分別為3%、2%和1%的茶液，對(duì)照組自由飲用蒸餾水，試驗(yàn)期6周，試驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)各組大鼠血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)及臟器系數(shù)變化。經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)中，益生茶對(duì)SD大鼠的食物利用率和生理體征無(wú)顯著影響（P〉0.05）。慢性毒性試驗(yàn)中，益生茶各劑量組SD大鼠的體重、血液學(xué)、血液生化學(xué)指標(biāo)值及各臟器的臟/體比值與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異（P〉0.05）。益生茶各組大鼠主要臟器在外觀形態(tài)和組織學(xué)上均無(wú)異常變化。在本試驗(yàn)條件下，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)和病理變化，表明白葉茶鮮葉制益生茶對(duì)雄性大鼠基本無(wú)毒。

白葉茶鮮葉；益生茶；SD大鼠；急性毒性；慢性毒性

Abstract：In order to explore the toxicological safety of probiotic tea made from fresh albino tea leaves as raw materials for health care tea，the acute and chronic toxicity tests were carried out on SD rats with different concentrations of probiotic tea.In the acute toxicity test，clean SD rats were randomly divided into the control group and the experimental group.The test group was fed with 5% （wt%）probiotics 5 mL/kg·BW per day，and the control group was fed with the same amount of normal saline.After 14 days trial period，the changes related to physiological signs were observed.In the chronic toxicity test，the SD rats were randomly divided into the control group and other three groups with high， middle and low doses of probiotics tea.The concentration of probiotics tea drink in the high，medium and low dose groups was 3%，2%and 1%，respectively.The control group was free to drink distilled water.

Keywords：Fresh albino tea leaves； Probiotic tea； SD rat； Acute toxicity； Chronic toxicityAfter 6 weeks trial period， the hematology， blood biochemical indicators and changes in the organ coefficient were detected.Results： In the oral acute toxicity test， probiotic tea had no effect on the food utilization and physical signs of SD rats（P〉 0.05）.In the chronic toxicity test， the body weight， hematology， blood biochemical indexes and the ratio of viscera to body of SD rats in each dose group were not significantly different from those in the control group （P〉 0.05）.There were no abnormal changes in the appearance and histology of the rat's main organs in each group.Under the experimental conditions，no obvious toxic reaction and pathological changes were observed.And the results showed that probiotic tea made from fresh albino tea leaves was almost nontoxic to male rats.

采用白葉1號(hào)茶鮮葉為原料而制備的龍?chǎng)我嫔瑁ㄒ韵潞?jiǎn)稱益生茶），是在傳統(tǒng)茶生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，通過現(xiàn)代分子標(biāo)靶、益生菌分離、高通量分子篩選等高科技技術(shù)，將益生菌與優(yōu)良白葉茶鮮葉有機(jī)嫁接，經(jīng)特殊工藝深度發(fā)酵，精制而成。黑茶在減肥降脂[1-3]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[4]、抗氧化[5]等方面具有卓越功效。黑茶種類眾多、歷史悠久，隨著市場(chǎng)對(duì)黑茶的需求不斷升溫，黑茶的飲用安全性問題也有必要引起足夠的重視。據(jù)報(bào)道，各種黑茶的常規(guī)成分咖啡堿、茶多酚等都有明確的生物學(xué)毒性[6-8]。劉勤晉等[9]對(duì)普洱茶急性毒性進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，認(rèn)為茶葉中過高濃度的咖啡堿和茶多酚可導(dǎo)致小鼠死亡，科學(xué)的飲茶法是飲茶健身的必然要求。目前，還沒有關(guān)于白葉茶鮮葉制益生茶的毒性研究的報(bào)道，為了證明白葉茶鮮葉制益生茶飲用的安全性，本試驗(yàn)以龍?chǎng)我嫔铻椴牧?，進(jìn)行了白葉茶鮮葉制益生茶的急性、慢性毒性試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

清潔級(jí) SD大鼠：雄性，體重80～100 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)SCXK（蘇）2013-0011）提供。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫22±2℃，相對(duì)濕度60±10%，自然光照，自由飲水和采食。

白葉茶鮮葉制益生茶：市售一級(jí)龍?chǎng)我嫔琛?/p>

電子天平（Sartorius，Germany）、全自動(dòng)生化分析儀（AU480，Beckman Coulter USA）、血常規(guī)分析儀（DC-2800-VET，邁瑞）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶湯配制

參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，按5 g∶100 mL比例用蒸餾水配制相關(guān)茶湯 （相當(dāng)于體重60 kg的成人每天飲用5 g的益生茶），85℃以上水溫浸泡30 min后紗布過濾，即得灌胃劑量，作為急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)最高劑量。同時(shí)稱取10 g、20 g和30 g益生茶分別加入蒸餾水1000 mL，85℃以上水溫浸泡30 min后紗布過濾得1%、2%與3%茶水，作為慢性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組劑量。

1.2.2 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

清潔級(jí)SD大鼠12只，適應(yīng)飼喂2周后隨機(jī)分成2組，每組6只。試驗(yàn)組大鼠均按5 mL/kg·BW 每日1次經(jīng)口灌胃5 g∶100 mL[9]的益生茶湯，對(duì)照組灌服等量生理鹽水。灌胃前12 h禁食，不禁水。試驗(yàn)期14 d，每天觀察動(dòng)物的進(jìn)食、活動(dòng)、毛發(fā)、糞便等行為學(xué)活動(dòng)情況，記錄每日攝食量。每周稱重1次，并依據(jù)5 mL/kg·BW的5%益生茶湯灌胃劑量調(diào)整體重變化大鼠的灌胃量。記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況和死亡動(dòng)物分布。動(dòng)物死亡后及時(shí)進(jìn)行尸檢，若肉眼觀察異常時(shí)則進(jìn)行病理檢查。

1.2.3 慢性毒性試驗(yàn)

SD大鼠24只，適應(yīng)飼喂2周后，稱起始體重為250.4±6.5 g，參照農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法（GB 15670-1995）[11]將大鼠隨機(jī)分成 4組，每組6只，設(shè)置蒸餾水空白對(duì)照組、1%茶水組、2%茶水組、3%茶水組（組別編號(hào)依次為1～4），各劑量組茶水試制方法同急性試驗(yàn)組，采用自由飲用法給予受試物。試驗(yàn)期為6周，每周稱重1次。實(shí)驗(yàn)期末禁食12 h，摘眼球取血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化檢查。檢測(cè)的血液學(xué)指標(biāo)包括白細(xì)胞數(shù)目（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)目（Lymph）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、平均紅細(xì)胞（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、單核細(xì)胞數(shù)目（Mon）；檢測(cè)的血液生化指標(biāo)包括血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、總膽紅素（T-BIL）、肌酸激酶（CK）等。 將大鼠用斷頭法處死，解剖大鼠后肉眼檢查各器官情況，取心、肝、脾、肺、腎稱重，并計(jì)算各臟器系數(shù)。

周二的班級(jí)群，既是班級(jí)工作的“吐槽大會(huì)”，又是表?yè)P(yáng)大會(huì)，在各方的批評(píng)和表?yè)P(yáng)中，形成班級(jí)的治班錦囊。有一次，幾位家長(zhǎng)反映英語(yǔ)課堂紀(jì)律差。事后我了解到，原來那段時(shí)間學(xué)校的助教沒安排過來，英語(yǔ)老師又是外教，加上學(xué)生多、自控力差，班級(jí)紀(jì)律便較差。在群里說明問題后，峻熙媽媽主動(dòng)提出來學(xué)校擔(dān)任助教工作，因?yàn)樗⒄Z(yǔ)過了八級(jí)，還當(dāng)過老師，應(yīng)該能勝任。于是，我向?qū)W校申請(qǐng)，那段時(shí)間就由我們班家長(zhǎng)暫擔(dān)助教工作。后來，英語(yǔ)課堂紀(jì)律果真有了極大改善，家長(zhǎng)們紛紛點(diǎn)贊，希望自己也能進(jìn)課堂。在吐槽和表?yè)P(yáng)中，我們共同為孩子的成長(zhǎng)護(hù)航。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式給出，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One Way ANOVA），選擇多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法統(tǒng)計(jì)；若方差不齊，則選用非參數(shù)分析。P〈0.05表明差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

2.1.1 一般臨床觀察結(jié)果

經(jīng)過14 d的觀察，全部動(dòng)物活動(dòng)良好，無(wú)任何中毒癥狀，無(wú)死亡，說明雄性大鼠經(jīng)口灌服益生茶的 LD50〉5 g ∶100 mL。

2.1.2 對(duì)大鼠攝食量的影響

試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組大鼠采食量正常，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P〉0.05），如表1所示。結(jié)果表明益生茶對(duì)雄性大鼠攝食量無(wú)明顯影響。

表1 益生茶對(duì)大鼠攝食量影響Table 1 Effects of Probiotic tea on food intake in rats

2.1.3 對(duì)大鼠體重的影響

試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組大鼠體重的正常，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P〉0.05），如表2所示。結(jié)果表明益生茶對(duì)雄性大鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

表2 益生茶對(duì)大鼠體重的影響Table 2 Effects of Probiotic tea on body weight in rats

2.1.4 解剖觀察主要臟器

試驗(yàn)結(jié)束斷頭法處死大鼠后解剖，肉眼觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠均未發(fā)現(xiàn)臟器出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等異常改變。試驗(yàn)未對(duì)大鼠血液生化、臟器、病理學(xué)組織開展進(jìn)一步研究。

2.2 慢性毒性試驗(yàn)

2.2.1 一般指標(biāo)

益生茶各劑量組及空白組大鼠在6周試驗(yàn)期內(nèi)活動(dòng)、飲食、大便和皮毛光澤等情況未見異常癥狀。處死動(dòng)物，剖取各組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，首先做肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)臟器外形、體積、色澤均屬正常，無(wú)充血、腫脹和壞死等異常表現(xiàn)。

2.2.2 對(duì)大鼠體重的影響

益生茶對(duì)大鼠體重的影響見表3。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組大鼠體重增長(zhǎng)正常，體重變化無(wú)明顯差異（P〉0.05），表明大鼠長(zhǎng)期飲用益生茶對(duì)雄性大鼠食物利用率無(wú)影響。

2.2.3 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

益生茶對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響見表4。與對(duì)照組相比，飲用益生茶高中低劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器系數(shù)均無(wú)明顯差異（P〉0.05），表明大鼠長(zhǎng)期飲用白茶鮮葉制益生茶對(duì)雄性大鼠主要臟器重量無(wú)明顯影響。

表3 制益生茶對(duì)大鼠體重的影響Table 3 Effects of Probiotic tea on body weight in rats

表4 益生茶對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響Table 4 Effects of Probiotic tea on organ coefficient in rats

2.2.4 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

益生茶對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響結(jié)果見表5。與對(duì)照組相比，自由飲用益生茶高、中、低劑量組大鼠血液的白細(xì)胞數(shù)目 （WBC），淋巴細(xì)胞數(shù)目（Lymph），紅細(xì)胞總數(shù)（RBC），血紅蛋白（HGB），平均紅細(xì)胞壓積（MCV），平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC），單核細(xì)胞數(shù)目（Mon）等指標(biāo)均無(wú)顯著差異（P〉0.05），表明益生茶對(duì)雄性大鼠血液學(xué)指標(biāo)無(wú)明顯影響。

表5 益生茶對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Table 5 Effects of probiotic tea on hematological indicators in rats

2.2.5 對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

益生茶對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響結(jié)果見表6。與對(duì)照組比較，自由飲用益生茶湯高、中、低劑量組大鼠血液的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、總膽紅素（TBIL）、肌酸激酶（CK）的檢查結(jié)果均無(wú)顯著差異（P〉0.05），揭示益生茶對(duì)雄性大鼠肝、腎功能無(wú)明顯影響。

表6 益生茶對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響Table 6 Effects of Probiotic tea on blood biochemical indexes in rats

3 討論

試驗(yàn)以白葉茶鮮葉制益生茶為受試物進(jìn)行了急性經(jīng)口灌胃和慢性毒性試驗(yàn)，以期了解短時(shí)間和較長(zhǎng)時(shí)間白葉茶鮮葉制益生茶所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和發(fā)揮毒性作用的靶器官。從急性毒性試驗(yàn)來看，大鼠經(jīng)口灌胃5 mL/kg·BW的5%益生茶湯14 d后未觀察到大鼠有明顯中毒體征，體重增長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P〉0.05），無(wú)動(dòng)物死亡，試驗(yàn)結(jié)束解剖動(dòng)物，肉眼觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組主要臟器的體積、顏色、質(zhì)地未出現(xiàn)異常，故未進(jìn)一步進(jìn)行病理檢查。通過急性毒性試驗(yàn)可以看出益生茶基本無(wú)急性毒性，因此飲用正規(guī)渠道的益生茶具有很高的安全性，但是飲用任何物質(zhì)超過一定范圍都可能致死，大鼠經(jīng)口灌服蒸餾水的LD50為 469±51 mL/kg[12]，因此科學(xué)地飲用益生茶才是飲茶健身的必然要求。

從慢性毒性試驗(yàn)來看，經(jīng)過6周大鼠連續(xù)自由飲用益生茶湯后，解剖觀察大鼠主要臟器未見異常，且作為顯示受試物靶器官重要指標(biāo)的臟器系數(shù)[13-14]與對(duì)照組相比也無(wú)顯著性差異，血常規(guī)和生化檢查與蒸餾水對(duì)照相比均無(wú)明顯差異 （P〉0.05），說明益生茶對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、肝腎功能、器官組織均無(wú)明顯毒性。綜上所述，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)顯示白葉茶鮮葉制益生茶無(wú)急性毒副作用，慢性毒性實(shí)驗(yàn)顯示白葉茶鮮葉制益生茶長(zhǎng)期使用是安全的。白葉茶鮮葉制益生茶對(duì)大鼠基本無(wú)毒性，作為保健性飲品的開發(fā)利用是安全的。后續(xù)將對(duì)白葉茶鮮葉制益生茶的保健功效進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期了解白葉茶鮮葉制益生茶在抗氧化、減肥降脂方面的功效。

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浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室是經(jīng)浙江省科學(xué)技術(shù)廳、浙江省財(cái)政廳和浙江省發(fā)展和改革委員會(huì)聯(lián)合發(fā)文（浙科發(fā)條【2013】165號(hào)）批準(zhǔn)建設(shè)的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，掛靠單位為中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院。實(shí)驗(yàn)室2013年7月正式批復(fù)建設(shè)，2016年1月順利通過驗(yàn)收。2014～2016浙江省科技廳組織的績(jī)效評(píng)價(jià)中，結(jié)果為優(yōu)秀。

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室針對(duì)茶葉資源生態(tài)高值利用和跨界含茶終端產(chǎn)品開發(fā)不足的問題，重點(diǎn)圍繞以下幾個(gè)方向的科技創(chuàng)新和成果孵化工作：（1）茶資源功能活性物質(zhì)制備與改性技術(shù)研究；（2）功能性終端茶制品開發(fā)與品控技術(shù)研究；（3）茶資源高效利用關(guān)鍵設(shè)備開發(fā)與應(yīng)用技術(shù)研究；（4）終端產(chǎn)品功能、安全評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)化研究。

聯(lián)系人：周春江 電話：0571-86040643,15868115470

Acute and Chronic Toxicity Test of Probiotic Tea Produced by Fresh Albino Tea Leaves

SUN Kai1，2， LI Shun-geng3， WANG Guang-guang1，2， FAN Wen-tong1，2， WANG Ling1，2，BIAN Jian-chun1，2*
（ 1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2.Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou 225009， China；3.Jiangsu Liyang Tianmuhu Longxin Featured Agricultural Cooperatives， Liyang 213334， China ）

TS272.5+5；R994.4

A

2095-0306（2017）02-0011-05

2017-04-03

江蘇省溧陽(yáng)市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃-現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（LB2015005）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

孫凱（1993-），男，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝病與中毒病研究。

*

jcbian@yzu.edu.cn