COPD大鼠原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白的檢測(cè)*

蔣 明 ，王昌明，韓旭惠，楊 丹，馬禮兵，陳 峰，呂 倩

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 廣西桂林 541001

COPD大鼠原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白的檢測(cè)*

蔣 明 ，王昌明#，韓旭惠，楊 丹，馬禮兵，陳 峰，呂 倩

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 廣西桂林 541001

慢性阻塞性肺疾病；Toll樣受體4；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；大鼠

目的：探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠遠(yuǎn)端原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的分泌情況及其與Toll樣受體4 (TLR4)信號(hào)通路的相關(guān)性。方法通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)建立大鼠COPD模型，分離培養(yǎng)、鑒定原代大鼠PASMCs，以LPS誘導(dǎo)PASMCs，然后分組(對(duì)照組、LPS組、TAK-242組，LPS+TAK-242組)培養(yǎng)細(xì)胞，用Western blot法檢測(cè)各組PASMCs中TLR4的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液MCP-1、TGF-β1的濃度，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果LPS組較對(duì)照組PASMCs中TLR4的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1的含量升高(P<0.05)；TAK-242組PASMCs中TLR4的表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，上清液中MCP-1、TGF-β1與TLR4無(wú)相關(guān)性。結(jié)論LPS可誘導(dǎo)大鼠原代PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1，同時(shí)上調(diào)TLR4表達(dá)水平。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要的病理特征為血管炎癥反應(yīng)和血管重塑。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)是肺血管重塑的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究[1-3]表明，當(dāng)受到有害因素刺激時(shí)，PASMCs表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，合成、分泌炎癥因子及基質(zhì)蛋白的活性增加，募集炎癥細(xì)胞聚集和炎癥級(jí)聯(lián)放大，并促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移，促進(jìn)肺血管重塑。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)是一種趨化性細(xì)胞因子，可趨化激活巨噬細(xì)胞，參與介導(dǎo)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)屬于TGF-β家族，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的活性多肽類(lèi)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等多種病理、生理過(guò)程有重要調(diào)節(jié)作用[5]。有研究[6]報(bào)道，與正常人比較，急性加重期和緩解期COPD患者血清MCP-1、TGF-β1的水平明顯升高。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR，可被肽聚糖及脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)等激活來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[7]。作者通過(guò)建立COPD大鼠模型，分離培養(yǎng)大鼠原代PASMCs，探究COPD大鼠PASMCs合成、分泌MCP-1、TGF-β1的水平同TLR4信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF級(jí)Wistar大鼠24只，雌雄各半，體重(200±20)g，6～8周齡，購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠在室溫、安靜和避強(qiáng)光環(huán)境中自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXKG 2014-0001。LPS(美國(guó) Sigma 公司)，翻蓋紅色金牌黃果樹(shù)香煙(貴陽(yáng)卷煙廠出品，焦油量15 mg，煙氣煙堿量1.2 mg)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，TLR4鼠單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、β-actin小鼠單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，ELISA 試劑盒(美國(guó) BENDER 公司)，自制91 cm×42 cm×62 cm有機(jī)玻璃艙，倒置相差顯微鏡(日本 Olympus)，美國(guó)Bio-Rad公司蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀、450型全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.2動(dòng)物模型的建立Wistar大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，模型組于實(shí)驗(yàn)第1、14天經(jīng)氣道內(nèi)注入LPS，每次200 μg/只，予自制有機(jī)玻璃艙內(nèi)煙熏1 h/d，共8周，艙內(nèi)有小孔可與外界空氣相通，保持艙內(nèi)氣壓與外界相等，艙內(nèi)放置適量無(wú)水氯化鈣吸收水分、保持干燥。對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)第1、14天經(jīng)氣道注入等量生理鹽水，其他不做任何處理，與模型組大鼠在同等條件下飼養(yǎng)8周。

1.3大鼠遠(yuǎn)端原代PASMCs分離、培養(yǎng)及鑒定采用酶消化法結(jié)合組織塊貼壁法。Wistar 大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡大鼠5 min，開(kāi)胸取心肺，取肺動(dòng)脈3級(jí)以下分支，分離血管中膜，Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化15～20 min，離心、吸出消化酶，加入含體積分?jǐn)?shù)25%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置 37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 d左右可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周?chē)瘸觯?0 d左右細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)培養(yǎng)瓶的90%以上時(shí)即消化傳代，選用第3～6代(達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)細(xì)胞用于該實(shí)驗(yàn)。PASMCs細(xì)胞爬片行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。

1.4PASMCs中TLR4蛋白含量的Westernblot檢測(cè)用LPS、TAK-242干預(yù)細(xì)胞后按如下方法進(jìn)行分組(每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔)：對(duì)照組不做任何處理；LPS組加入LPS(終質(zhì)量濃度為1 mg/L)，TAK-242組(終濃度為1 μmol/L)、LPS+TAK-242組(LPS終質(zhì)量濃度為1 mg/L，TAK-242終濃度為1 μmol/L)培養(yǎng)24 h。提取PASMCs總蛋白，測(cè)定總蛋白濃度，計(jì)算上樣量后上樣，使每孔蛋白總量一致，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳約120 min；轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜用封閉液封閉2 h，加入TLR4單抗(按11 000稀釋)4 ℃過(guò)夜，TBST漂洗膜3次， 10 min/次；二抗山羊抗鼠IgG(按15 000稀釋)室溫孵育2 h，最后發(fā)光，所得圖像用Imag J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1水平的ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)、分組和樣本量同1.4。采用450型 ELISA 酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定光密度值，利用 Revelation Spectra MR軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)本的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到標(biāo)本的MCP-1、TGF-β1濃度。具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較各組PASMCs中TLR4蛋白含量和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠COPD建模的HE染色判斷及PASMCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定見(jiàn)圖1(箭頭所標(biāo)處為肺動(dòng)脈)。對(duì)照組肺組織(圖1A)肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肺組織(圖1B)肺泡壁斷裂、肺泡融合肺大泡形成，肺動(dòng)脈平滑肌層明顯增厚，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，符合COPD大鼠肺組織病理改變。Α-SM-actin 免疫組織化學(xué)染色，光鏡下見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)大部分肌動(dòng)蛋白染成棕黃色，呈現(xiàn)與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的絲狀物，證實(shí)為 PASMCs(圖1C)。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 圖1 大鼠COPD建模的HE染色判斷及PASMCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定(×200)

2.2各組PASMCs中TLR4蛋白含量的比較見(jiàn)圖2及表1。LPS組細(xì)胞TLR4表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；TAK-242組細(xì)胞TLR4的表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.05)；TAK-242組細(xì)胞較LPS組中TLR4的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

A：對(duì)照組；B：LPS組；C：TAK-242組；D：LPS+TAK-242組。 圖2 各組PASMCs中TLR4的表達(dá)

組別TLR4對(duì)照組0.917±0.019LPS組2.912±0.079TAK-242組0.623±0.006LPS+TAK-242組1.899±0.003

FLPS=43 461.403，F(xiàn)TAK-242=19 213.336，F(xiàn)交互=16 174.815;P均<0.001。

2.3各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1水平的比較見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1水平變化比較(n=6)

2.4MCP-1、TGF-β1表達(dá)水平與TLR4含量相關(guān)性分析COPD大鼠PASMCs上清液中MCP-1、TGF-β1表達(dá)水平與TLR4含量無(wú)關(guān)(rP=0.471和0.352，P>0.05)。

3 討論

COPD是一種以氣流受限為特征的肺部疾病，主要表現(xiàn)為加速下降的肺功能，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，并帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的疾病[8-9]。血管炎癥反應(yīng)和肺血管重塑是其主要病理特征。

TLRs是一類(lèi)天然的免疫受體，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR，屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，可被病原微生物、肽聚糖(PGN)、LPS等激活，產(chǎn)生趨化因子、黏附分子、急性期蛋白及細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。氣道注入LPS和被動(dòng)吸煙可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路引起肺損傷繼而引發(fā)COPD，而TLR4在這一過(guò)程中起到重要作用[10]。該實(shí)驗(yàn)采用氣道內(nèi)注入LPS及香煙煙霧暴露方法建立COPD大鼠模型。COPD患者氣道炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)主要為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[11]。MCP-1是一種重要的趨化因子，與巨噬細(xì)胞的激活和趨化明顯相關(guān)[12]。TGF-β1能夠刺激成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)并抑制其降解，致使氣道管壁增厚進(jìn)而引發(fā)氣道重塑，導(dǎo)致肺功能的進(jìn)行性損害[13]。MCP-1和TGF-β1在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，與正常人比較，COPD患者急性加重期和緩解期MCP-1、TGF-β1的水平明顯升高[6]。有研究[14]證實(shí)，在血管平滑肌細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路可介導(dǎo)MCP-1的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離培養(yǎng)原代PASMCs，LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞上清液中合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平也明顯升高用。為進(jìn)一步探究PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平與TLR4之間的關(guān)系，以TLR4特異性抑制劑TAK-242干預(yù)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可明顯下調(diào)TLR4的表達(dá)，但細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1、TGF-β1的水平并不隨之降低。有研究[15]報(bào)道，COPD患者急性加重期組織因子(tissue factor，TF)和MCP-1、TGF-β1的水平明顯高于正常人，且TF與MCP-1、TGF-β1之間有明顯正相關(guān)性。由此推測(cè)大鼠原代PASMCs合成分泌MCP-1、TGF-β1的水平除了受TLR4的影響外可能還有其他信號(hào)途徑的參與，但其具體機(jī)制目前仍不十分清楚，作者將在接下來(lái)的研究中做進(jìn)一步的探討。

[1] NAZARI-JAHANTIGH M,WEI Y,SCHOBER A.The role of microRNAs in arterial remodelling[J].Thromb Haemost,2012,107(4):611

[2] 李滿祥，盧家美.肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制及干預(yù)的研究進(jìn)展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014,35(3)：285

[3] YI B,CUI J,NING JN,et al.Over-expression of PKGIα inhibits hypoxia-induced proliferation, Akt activation, and phenotype modulation of human PASMCs: the role of phenotype modulation of PASMCs in pulmonary vascular remodeling[J].Gene,2012,492(2):354

[4] 張群,王競(jìng)秋.大鼠急性炎髓損傷后MCP-1及BDNF表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].甘肅醫(yī)藥,2013,32(3):184

[5] 袁晟.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 對(duì)牙種植體骨結(jié)合的影響[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2012,25(2):212

[6] 黃愛(ài)霞.單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1、組織因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在慢性阻塞性肺疾病中的意義[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2015,15(1):70

[7] PACE E,GIARRATANO A,FERRARO M,et al. TLR4 upregulation underpins airway neutrophilia in smokers with chronic obstructive pulmonary disease and acute respiratory failure[J].Hum Immunol,2011,72(1):54

[8] ZHONG N,WANG C,YAO W,et al.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China: a large, population-based survey[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(8):753

[9] FANG X,WANG X,BAI C.COPD in China: the burden and importance of proper management[J].Chest,2011,139(4):920

[10] MENG Y, YU CH, LI T, et al.Expression and significance of Toll-like receptor-4 in rats lung established by passive smoking or associated with intratracheal instillation of lipopolysaccharide[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2013,93(28):2230

[11]VALIPOUR A,SCHREDER M,WOLZT M,et al.Circulating vascular endothelial growth factor and systemic inflammatory markers in patients with stable and exacerbated chronic obstructive pulmonary disease[J].Clin Sci (Lond),2008,115(7):225

[12]KO FW,LAU CY,LEUNG TF,et al.Exhaled breath condensate levels of 8-isoprostane, growth related oncogene alpha and monocyte chemoattractant protein-1 in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respir Med,2006,100(4):630

[13] WU L,CHAU J,YOUNG RP,et al.Transforming growth factor-beta1 genotype and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease[J].Thorax,2004,59(2):126

[14]徐斌,張延斌,張春華,等.TLR4/NF-κB信號(hào)通路ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞分泌MCP-1中的作用[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2013,22(3):215

[15] WANG Y, ZHENG Y, ZHAI YL, et al. Comparative analysis of MCP-1 and TF in elderly patients with acute exacerbations of COPD and its clinical significance[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2015,19(2):215

(2016-11-27收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Detection of MCP-1,TGF-β1 and TLR4 protein in primary pulmonary artery smooth muscle cells of COPD rats

JIANGMing,WANGChangming,HANXuhui,YANGDan,MALibing,CHENFeng,LYUQian

DepartmentofRespiratoryMedicine,GuilinMedicalUniversityAffiliatedHospital,Guilin,Guangxi541001

chronic obstructive pulmonary disease;Toll like receptor-4;monocyte chemoattractant protein 1;transforming growth factor β1;rat

Aim: To probe into the secretion of monocyte chemoattractant protein 1(MCP-1),transforming growth factor β1(TGF-β1) in primary pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs) of chronic obstructive pulmonary disease(COPD) rats and the correlation with toll-like receptor 4(TLR4) signaling pathways. Methods: The COPD rat model was established, and the PASMCs were separated, induced by LPS, and then divided into control group,LPS group,TAK-242 group,and LPS+TAK-242 group. The expression of TLR4 in PASMCs of each group was detected by Western blot, and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid were determined by ELISA, and at last a correlation analysis was conducted.Results: In contrast with the control group, the expression of TLR4 in PASMCs of the LPS group was inecreased(P<0.05) and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid were increased(P<0.05). The expression of TLR4 in PASMCs of the TAK-242 group was down-regulated(P<0.05) and the concentrations of MCP-1 and TGF-β1 in cell culture fluid showed no correlation with the expression of TLR4.Conclusion: LPS can induce PASMCs of rats to synthesize and secrete MCP-1 and TGF-β1, and the TLR4 is up-expressed at the same time.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.031

R563.3

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81360010；廣西省衛(wèi)生廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 S201603

#通信作者，男，1963年11月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：慢性阻塞性肺疾病，E-mail：wcm@glmc.edu.cn