過敏性鼻炎合并哮喘患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP及IL-18R的表達(dá)*

王 玲，胡雅琳，楊蕊銘，王君靈，張慧云，何韶衡#

1)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心 遼寧錦州 121001 2)蘇州市相城人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 江蘇蘇州 215100

過敏性鼻炎合并哮喘患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP及IL-18R的表達(dá)*

王 玲1)，胡雅琳1)，楊蕊銘1)，王君靈1)，張慧云1，2)#，何韶衡1)#

1)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心 遼寧錦州 121001 2)蘇州市相城人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 江蘇蘇州 215100

過敏性鼻炎合并哮喘；嗜酸性粒細(xì)胞；IL-18；IL-18BP；IL-18R

目的：檢測過敏性鼻炎合并哮喘(AR+AS)患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá)。方法采集13例AR+AS患者和14名健康人(正常對照組)外周靜脈血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測靜息狀態(tài)下和過敏原(大籽蒿花粉、塵螨和梧桐花粉過敏原粗提液)刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例及平均熒光強(qiáng)度(MFI)，分析其相關(guān)性。結(jié)果與正常對照組相比，靜息狀態(tài)下AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+和IL-18BP+細(xì)胞比例分別升高了5.821倍(P=0.001)和44.1%(P=0.048)，IL-18+細(xì)胞MFI增強(qiáng)了29.1%(P=0.001)，IL-18BP+細(xì)胞MFI降低了32.3%(P<0.001)，而IL-18R+細(xì)胞比例及MFI無明顯變化(P>0.05)。過敏原刺激對AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18、IL-18BP及IL-18R的表達(dá)無影響(P>0.05)。AR+AS患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+和IL-18BP+細(xì)胞比例呈中度相關(guān)(r=0.622，P<0.001)。結(jié)論嗜酸性粒細(xì)胞源的IL-18和IL-18BP可能在AR+AS中起重要作用。

支氣管哮喘和過敏性鼻炎均為呼吸道常見的過敏性疾病，二者常常同時存在并相互影響，嚴(yán)重威脅人類健康。嗜酸性粒細(xì)胞是終末分化的粒細(xì)胞，在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，肺組織嗜酸性粒細(xì)胞募集可直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、器官功能障礙和組織重塑。此外，也有嗜酸性粒細(xì)胞參與鼻炎發(fā)病機(jī)制的報(bào)道[4]，提示嗜酸性粒細(xì)胞在哮喘和鼻炎中起重要作用。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18是IL-1超家族的成員[5]。研究[6]報(bào)道，IL-18可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)效趨化因子IL-8進(jìn)而誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的發(fā)生；致死性哮喘患者的肺部高表達(dá)IL-18和IL-18受體(IL-18R)[7]；兒童哮喘患者血清IL-18水平顯著升高[8]；過敏性鼻炎患者血漿IL-18水平升高[1]。IL-18結(jié)合蛋白(IL-18 binding protein，IL-18BP)是IL-18的內(nèi)源性拮抗劑，可抑制IL-18與其受體結(jié)合[9]。目前尚未開展過敏原對AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞IL-18、IL-18R和IL-18BP表達(dá)影響的相關(guān)研究。作者觀察了過敏性鼻炎合并哮喘(AR+AS)患者靜息狀態(tài)下和過敏原刺激后外周血嗜酸性粒細(xì)胞IL-18、IL-18R和IL-18BP表達(dá)的變化，為以后探討二者在AR+AS中的作用提供方向。

1 材料與方法

1.1材料主要試劑：PE/Cy7-CD14、PerCP-CD16、Zombie Aqua Fixable Viability Kit、BV510-驢抗兔IgG抗體、FcR阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液、布雷非德菌素A(BFA)購自Biolegend(USA)，PE-IL-18、APC-IL-18R購自R&D Systems(USA)，兔抗人IL-18BP購自Abcam(UK)，大籽蒿花粉、塵螨和梧桐花粉過敏原粗提液購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司(中國)，PBS購自Solarbio(USA)，Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購自BD Biosciences Pharmigen(USA)，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)過敏原購自ALK-ABELLO(Denmark)，其他常用化學(xué)試劑均為分析純。主要儀器：低溫高速離心機(jī)(Thermo Scientific, USA)，水浴鍋(精宏,中國)，F(xiàn)ACSVerse流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, USA)。

1.2研究對象和樣本采集13例AR+AS患者，其中女11例，男2例，中位年齡51 (9～61)歲，發(fā)病中位年齡38(3～55)歲，中位病史3(0.2～30.0) a；大籽蒿花粉過敏原粗提液陽性9例，塵螨過敏原粗提液陽性10例，梧桐花粉過敏原粗提液陽性5例。正常對照為體檢健康者14人，男3人，女11人，中位年齡26(23～29)歲。研究獲得了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，每位志愿者均簽訂了知情同意書。2組研究對象均進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)。AR的診斷符合2015年美國耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會專家組發(fā)布的臨床實(shí)踐指南[10]，AS的診斷符合2015年全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma, GINA)診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者至少2周前停止服用抗過敏藥物，至少1個月內(nèi)無呼吸道感染的癥狀。每位研究對象均采集10 mL外周靜脈血，加入到含EDTA抗凝劑的采血管中，用于以下試驗(yàn)。

1.3血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群IL-18、IL-18BP和IL-18R的檢測全血分別加入BFA、大籽蒿花粉、塵螨和梧桐花粉過敏原粗提液(終質(zhì)量濃度為1.0 mg/L)，37 ℃水浴振蕩孵育1 h；1 400 r/min離心后棄上清液，加入死細(xì)胞去除染料和FcR阻斷劑，混勻后，避光孵育15 min，加入抗CD14、CD16和IL-18R抗體，避光孵育15 min后裂解紅細(xì)胞，離心后用固定/透膜液固定細(xì)胞，然后加入抗IL-18和抗IL-18BP抗體孵育，透膜洗液清洗后加入BV510-驢抗兔IgG抗體，最后上流式細(xì)胞儀檢測IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例及平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 13.0 分析數(shù)據(jù)。用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)分析靜息狀態(tài)和不同過敏原刺激后2組研究對象血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞的比例和MFI的差異，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者用Mann-WhitneyU進(jìn)一步比較。用秩相關(guān)系數(shù)分析AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+和IL-18R+細(xì)胞比例之間的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+及IL-18R+細(xì)胞比例的比較結(jié)果見表1～3。與正常對照組比較，AR+AS患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞比例升高了約5.821倍，IL-18BP+細(xì)胞的比例升高約44.1%，IL-18R+細(xì)胞比例無明顯變化。而過敏原刺激不影響AR+AS患者和正常對照組血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群IL-18+、IL-18BP+及IL-18R+細(xì)胞比例。

表1 2組靜息狀態(tài)和過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞的比例 %

*:與正常對照組靜息狀態(tài)相比，P=0.001。

表2 2組靜息狀態(tài)和過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18BP+細(xì)胞的比例 %

*:與正常對照組靜息狀態(tài)相比，P=0.048。

表3 2組靜息狀態(tài)和過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18R+細(xì)胞的比例 %

*:與正常對照組靜息狀態(tài)相比，P>0.05。

2.2 2組嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+、IL-18BP+及IL-18R+細(xì)胞MFI比較結(jié)果見表4～6。與正常對照組比較，AR+AS患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞的MFI升高了約29.1%，IL-18BP+細(xì)胞的MFI降低了約32.3%，而IL-18R+細(xì)胞的MFI無明顯變化。此外，大籽蒿花粉、塵螨和梧桐花粉過敏原粗提液均可誘導(dǎo)正常對照組IL-18BP+細(xì)胞的MFI降低。

表4 2組靜息狀態(tài)和過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞的MFI

*:與正常對照組靜息狀態(tài)相比，P=0.001。

表5 2組靜息狀態(tài)和過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18BP+細(xì)胞的MFI

*:與正常對照組靜息狀態(tài)相比，P<0.001。

表6 2組靜息狀態(tài)和過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18R+細(xì)胞的MFI

*:與正常對照組靜息狀態(tài)相比，P>0.05。

2.3AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞群富集群中IL-18+細(xì)胞比例和IL-18BP+細(xì)胞比例的關(guān)系靜息狀態(tài)下，AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18BP+和IL-18+細(xì)胞比例呈中度相關(guān)，r=0.662，P<0.001。

3 討論

AR+AS是一種累及上下呼吸道的氣道炎癥性疾病。有研究[1]報(bào)道過敏性鼻炎患者血漿IL-18水平升高，此外哮喘患者血漿IL-18水平升高[11]，結(jié)合研究中AR+AS患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+陽性細(xì)胞的比例升高，提示氣道炎癥性疾病患者血漿IL-18水平的升高可能與嗜酸性粒細(xì)胞有關(guān)。IL-18作為一種炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)效趨化因子IL-8[6]進(jìn)而誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的發(fā)生[12]；高水平的IL-18可上調(diào)特異性IgE生成，并可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等的分泌；IL-18水平與過敏性疾病的嚴(yán)重程度高度相關(guān)[13-14]。

IL-18通過與細(xì)胞表面的IL-18R相互作用在機(jī)體防御及致病過程發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究[15]報(bào)道兒童哮喘患者肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞增多并伴有IL-18R表達(dá)增加。有研究[16]發(fā)現(xiàn)OVA致敏鼠腹腔注射IL-18可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞表達(dá)IL-18R。然而，該研究發(fā)現(xiàn)與正常對照相比，AR+AS患者血液嗜酸性粒細(xì)胞IL-18+陽性細(xì)胞的比例雖升高，但嗜酸性粒細(xì)胞IL-18R+陽性細(xì)胞的比例與正常對照組相比，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示嗜酸性粒細(xì)胞分泌的IL-18可能通過組織的肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞表面的IL-18R在AR+AS中起重要作用，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

IL-18BP是IL-18的內(nèi)源性拮抗劑[9]，可與IL-18結(jié)合而降低自身的生物學(xué)活性。該研究發(fā)現(xiàn)AR+AS患者血液IL-18BP+嗜酸性粒細(xì)胞的比例較正常對照組升高，但遠(yuǎn)低于IL-18的升高水平；同時AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+細(xì)胞MFI增強(qiáng)，IL-18BP+細(xì)胞MFI降低，提示IL-18和IL-18BP表達(dá)之間的不平衡可能誘導(dǎo)AR+AS，進(jìn)而為AR+AS的治療提供了新思路。此外，研究還發(fā)現(xiàn)AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中IL-18+陽性細(xì)胞比例和IL-18BP+陽性細(xì)胞比例中度相關(guān)(r=0.662)，提示高水平的IL-18可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞合成IL-18BP。

綜上所述，嗜酸性粒細(xì)胞源的IL-18和IL-18BP可能在AR+AS中起重要作用。

[1] LUCAS CD,DORWARD DA,SHARMA S,et al.Wogonin induces eosinophil apoptosis and attenuates allergic airway inflammation[J].Am J Respir Crit Care Med,2015,191(6):626

[2] GANGWAR RS,FRIEDMAN S,SEAF M.Mast cells and eosinophils in allergy: Close friends or just neighbors[J].Eur J Pharmacol,2016,778:77

[3] FULKERSON PC,ROTHENBERG ME.Targeting eosinophils in allergy, inflammation and beyond[J].Nat Rev Drug Discov,2013,12(2):117

[4] EL-SHAZLY AE,RONCARATI P,LEJEUNE M,et al.Tyrosine kinase inhibition is an important factor for gene expression of CRTH2 in human eosinophils and lymphocytes: A novel mechanism for explaining eosinophils recruitment by the neuro-immune axis in allergic rhinitis[J].Int Immunopharmacol,2017,45：180

[5] KAWAYAMA T,OKAMOTO M,IMAOKA H,et al.Interleukin-18 in pulmonary inflammatory diseases[J].J Interferon Cytokine Res,2012,32(10):443

[6] WANG W,TANAKA T,OKAMURA H,et al.Interleukin-18 enhances the production of interleukin-8 by eosinophils[J].Eur J Immunol,2001,31(4):1010

[7] XU D,CHAN WL,LEUNG BP,et al.Selective expression and functions of interleukin 18 receptor on T helper (Th) type 1 but not Th2 cells[J].J Exp Med,1998,188(8):1485

[8] SIMS JE,SMITH DE.The IL-1 family: regulators of immunity[J].Nat Rev Immunol,2010,10(2):89

[9] SAWADA M,KAWAYAMA T,IMAOKA H,et al.IL-18 induces airway hyperresponsiveness and pulmonary inflammation via CD4+T cell and IL-13[J].PLoS One,2013,8(1):e54623

[10]SEIDMAN MD,GURGEL RK,LIN SY,et al.Clinical practice guideline: allergic rhinitis executive summary[J].Otolaryngol Head Neck Surg,2015,152(2):197

[11]BLOM L,POULSEN LK.IL-1 family members IL-18 and IL-33 upregulate the inflammatory potential of differentiated human Th1 and Th2 cultures[J].J Immunol,2012,189(9):4331

[12]PORTER LM,COWBURN AS,FARAHI N,et al.Hypoxia causes IL-8 secretion, Charcot Leyden crystal formation, and suppression of corticosteroid-induced apoptosis in human eosinophils[J].Clin Exp Allergy,2017,47(6):770

[13]DINARELLO CA,NOVICK D,KIM S,et al.Interleukin-18 and IL-18 binding protein[J].Front Immunol,2013,4:289

[14]SANDERS NL,MISHRA A.Role of interleukin-18 in the pathophysiology of allergic diseases[J].Cytokine Growth Factor Rev,2016,32:31

[15]WANG J,ZHANG H,ZHENG W,et al.Correlation of IL-18 with tryptase in atopic asthma and induction of mast cell accumulation by IL-18[J].Mediators Inflamm,2016,2016:4743176

[16]VERHAEGHE B,GEVAERT P,HOLTAPPELS G,et al.Up-regulation of IL-18 in allergic rhinitis[J].Allergy,2002,57(9):825

(2017-04-09收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Expressions of IL-18， IL-18BP and IL-18R in blood eosinophil-enriched populations from patients with allergic rhinitis complicated with asthma

WANGLing1),HUYalin1),YANGRuiming1),WANGJunling1),ZHANGHuiyun1,2),HEShaoheng1)

1)AllergyandClinicalImmunologyResearchCenter,theFirstAffiliatedHospital,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001 2)CentralLaboratory,SuzhouXiangchengPeople'sHospital,Suzhou,Jiangsu215100

allergic rhinitis complicated with asthma;eosinophil;IL-18;IL-18BP;IL-18R

Aim: To investigate expressions of IL-18, IL-18BP and IL-18R in blood eosinophil-enriched populations from patients with allergic rhinitis complicated with asthma(AR+AS) as well as the correlation among them. Methods: Blood samples were collected from 13 AR+AS patients and 14 healthy controls. Proportions and MFI of IL-18+, IL-18BP+and IL-18R+cells in blood eosinophil-enriched populations from 2 groups were detected by flow cytometry. Results: Compared with healthy controls, proportions of IL-18+and IL-18BP+cells in eosinophil-enriched populations from AR+AS patients were increased by 5.821 folds(P=0.001) and 44.1%(P=0.048) when cultured with medium only, MFI of IL-18+cells in eosinophil-enriched populations from AR+AS patients was increased by 29.1%(P=0.001), and MFI of IL-18BP+cells was decreased by 32.3%(P<0.001); while the proportion and MFI of IL-18R+cells did not change significantly(P>0.05). Proportions of IL-18+and IL-18BP+eosinophils were correlated moderately(r=0.622,P<0.001) in eosinophil-enriched populations from AR+AS patients. Conclusion: IL-18+and IL-18BP+eosinophils are likely to play a key role in AR+AS.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.020

R392.8

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81471592;81472016

#通信作者：張慧云，女，1971年5月生，博士，教授，研究方法：過敏性疾病，E-mail：zhanghuiyun2003@126.com；何韶衡，男，1957年4月生，博士，教育部長江學(xué)者，研究方向：過敏性疾病，E-mail：shoahenghe@hotmail.com