河南省維生素D受體基因rs2222570和rs731236位點多態(tài)性與結(jié)核病的易感性*

石 潔，朱巖昆，鄭丹薇，馬曉光，王少華，李 輝，邢 進(jìn)，吳彩霞

河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016

河南省維生素D受體基因rs2222570和rs731236位點多態(tài)性與結(jié)核病的易感性*

石 潔，朱巖昆，鄭丹薇，馬曉光，王少華，李 輝，邢 進(jìn)#，吳彩霞

河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016

結(jié)核??；維生素D受體基因；單核苷酸多態(tài)性；多因子降維法

目的：探討河南省人群維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性和結(jié)核病易感性之間關(guān)系。方法采用病例對照研究方法，病例組納入260個結(jié)核病患者，并以年齡和性別相匹配納入260名健康人作為對照組。采用PCR-SSCP法對VDR基因位點多態(tài)性進(jìn)行分析。應(yīng)用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，SHEsis在線分析2個位點單倍體型和結(jié)核病發(fā)病的關(guān)聯(lián)，MDR軟件3.0.2分析基因和環(huán)境交互作用對結(jié)核病發(fā)病的影響。結(jié)果VDR基因rs2222570位點多態(tài)性與結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，野生型C/C降低了結(jié)核病發(fā)病50%的風(fēng)險(校正OR=0.501，95%CI：0.343～0.709)，并且該位點等位基因C在對照組中高于病例組(校正OR=0.632, 95%CI: 0.493～0.868)；而VDR基因的rs731236位點突變基因型C/C增加結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(校正OR=2.001, 95%CI: 1.838～2.191)。VDR基因單倍體型CT、TT和TC與結(jié)核病發(fā)病相關(guān)[CT：OR(95%CI)=0.673(0.521～0.847)，P<0.001；TT：OR(95%CI)=1.332(1.043～1.711)，P=0.032；TC：OR(95%CI)=6.561(2.366～18.143)，P<0.001]。MDR結(jié)果表明VDR 基因rs2222570和rs731236位點多態(tài)性、吸煙、結(jié)核病患者密切接觸史4個因素交互作用增加了結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險[OR(95%CI)=7.619(2.201～26.354)，P<0.001]。結(jié)論VDR基因多態(tài)性與結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，且VDR 基因rs2222570和rs731236位點多態(tài)性、吸煙、結(jié)核病患者密切接觸史存在交互作用。

中國作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，每年有100萬人發(fā)病。盡管結(jié)核病是一種高度傳染性疾病，但結(jié)核菌攜帶者中只有1/10的人發(fā)病[1]，結(jié)核分枝桿菌的感染、結(jié)核病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸與環(huán)境因素及宿主遺傳因素密切相關(guān)[2]，且這些因素之間存在復(fù)雜的交互作用。目前已有學(xué)者對結(jié)核病候選基因多態(tài)性尤其是維生素D受體(VDR)基因與結(jié)核病的關(guān)系展開了系列研究：維生素D作為一種重要免疫調(diào)節(jié)激素[3]，其活性代謝物1,25-二羥基維生素D3參與了單核細(xì)胞的激活，刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而抑制淋巴細(xì)胞增殖、免疫球蛋白產(chǎn)生及細(xì)胞因子合成[4]。VDR位于單核細(xì)胞表面，通過激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，介導(dǎo)了維生素D3功能的發(fā)揮[5]。VDR為一種配體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，與維生素D3相結(jié)合，通過作用于維生素D反應(yīng)元件和上游靶基因改變了其轉(zhuǎn)錄活性[6]。VDR編碼基因存在單核苷酸位點多態(tài)性，且大部分位點可通過限制性酶切位點來鑒定，比如內(nèi)含子8上的T到G突變形成的BsmⅠ和ApaⅠ位點，外顯子9上的T到C沉默突變形成的TaqⅠ位點，以及導(dǎo)致蛋白功能缺失的C到T突變形成的FokⅠ位點。

作者的前期研究[7]結(jié)果表明VDR基因多態(tài)性與結(jié)核病的關(guān)系因研究對象不同而存在分歧，并且河南地區(qū)該基因多態(tài)性對結(jié)核病發(fā)病的影響目前尚未見報道。為此該研究對VDR基因rs2222570位點和rs731236位點多態(tài)性與河南省結(jié)核病的易感性進(jìn)行研究，以期為河南省預(yù)防控制該病的發(fā)生和流行提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象該研究依照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，共收集2015年新確診結(jié)核病涂片陽性的肺結(jié)核病患者260 例(病例組)，排除合并有HIV 感染、糖尿病、腫瘤、慢性肺炎等其他疾病患者。對照組260例，為同期健康體檢的健康人群，胸透無異常，PPD 試驗排除結(jié)核桿菌感染，其他疾病的排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組，且年齡、性別構(gòu)成與病例組匹配。研究對象均簽署知情同意書。

1.2問卷調(diào)查和樣本采集參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]，選擇與結(jié)核病發(fā)生相關(guān)因素作為主要調(diào)查因素，包括一般信息、生活居住環(huán)境、飲食行為習(xí)慣、結(jié)核病接觸史、卡介苗接種史等。抽提研究對象全血中基因組DNA用于后續(xù)研究。

1.3VDR基因型多態(tài)性檢測采用PCR限制性酶切長度片段多態(tài)性方法對VDR基因rs2222570位點和rs731236位點進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)分型檢測。PCR熱啟動反應(yīng)酶TaqHS訂購于TaKaRa公司。PCR反應(yīng)引物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至該公司測序。引物序列見表1。

表1 VDR基因2個SNP位點的引物序列

取100 μL血標(biāo)本，按照血液基因組提取試劑盒(Qiagen公司)說明書的步驟進(jìn)行DNA抽提，最終DNA沉淀溶于100 μL TE中。以58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s的PCR條件擴(kuò)增目的片段。 為觀察rs2222570位點和rs731236位點的多態(tài)性，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物分別用FokⅠ和TaqⅠ內(nèi)切酶于37 ℃酶切反應(yīng)4 h后進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用EpiData 3.1進(jìn)行平行雙錄入，并進(jìn)行邏輯糾錯和一致性檢驗。用Excel 2003對統(tǒng)計后的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗和χ2檢驗比較2組人群的基本特征；應(yīng)用χ2檢驗分析樣本等位基因和基因型頻率，計算比值比(odds ratio，OR)及95%置信區(qū)間(95%CI)。采用SHEsis在線軟件進(jìn)行單倍體型的預(yù)測、構(gòu)建和分析。采用MDR 3.02軟件對基因-環(huán)境交互作用進(jìn)行多因子降維法分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1研究對象的一般情況因?qū)φ战M中有2例樣本基因組提取未能完成后續(xù)PCR和酶切檢測，最終260例病例和258例對照納入分析。研究對象的一般情況見表2，數(shù)據(jù)顯示2組人群的年齡和性別構(gòu)成相匹配(P>0.05)，可排除性別和年齡對其他危險因素的混雜作用。

表2 研究對象的年齡及性別構(gòu)成比較 例(%)

2.2VDR基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系

2.2.1 VDR基因多態(tài)性的檢測 VDR基因rs2222570位點酶切后將產(chǎn)生突變型T/T(350、150、60 bp)，雜合型C/T(400、350、150、60 bp)，野生型C/C(410和150 bp)3種基因型(圖1左)。而VDR基因rs731236位點酶切后將產(chǎn)生突變型T/T(200和100 bp)，雜合型C/T(300、200、100 bp)，野生型C/C(300 bp)3種基因型(圖1右)。

左：rs2222570位點SNP位點的酶切結(jié)果(1～3：C/T，C/C，T/T 3種基因型酶切結(jié)果，M：DNA標(biāo)記物100 bp DNA Ladder)；右：rs731236位點SNP位點的酶切結(jié)果(1～3：T/T，C/C， C/T 3種基因型酶切結(jié)果；M：DNA標(biāo)記物100 bp DNA Ladder)。 圖1 SNP位點的PCR和酶切結(jié)果

分別將2個位點3種基因型部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，結(jié)果如圖2所示，可見突變型和野生型均為單一峰形，而雜合型有重疊峰，因此進(jìn)一步確定2個位點的3種基因型。

圖2 SNP位點測序結(jié)果分析

2.2.2 VDR基因位點Hardy-Weinberg平衡檢驗 見表3。rs2222570位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)FokⅠ酶切后共檢出C/C、C/T和T/T 3 種基因型，對照組rs2222570位點各種基因型的理論頻數(shù)和調(diào)查頻數(shù)一致，符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=3.523，P=0.062)。rs731236位點PCR產(chǎn)物經(jīng)TaqⅠ酶切后共檢出T/T、T/C和C/C 3 種基因型，對照組rs731236位點各種基因型的理論頻數(shù)和調(diào)查頻數(shù)一致，符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=1.201，P=0.268)。兩個位點的P值均>0.05，說明該研究2個位點選擇的樣本具有群體代表性。

2.2.3 VDR基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性關(guān)系 見表4、5。從表4可看出病例組中VDR基因rs2222570位點基因型C/C的分布頻率低于對照組(P<0.001)。校正年齡、性別等因素后，以C/C為參照，雜合型和突變型OR值分別為1.933和2.241。結(jié)果表明基因型C/C為結(jié)核病患病的保護(hù)因素。而VDR基因rs731236位點基因型與結(jié)核病發(fā)病無關(guān)聯(lián)性(P=0.072)。將基因型多態(tài)性轉(zhuǎn)化進(jìn)行遺傳學(xué)模型，對其與結(jié)核病發(fā)病相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果表明VDR基因位點基因型C/C和顯性模型基因型(C/T+T/T)分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.102，P<0.001)，其OR值及95%CI為0.50(0.343～0.709)。并且與T等位基因相比， rs2222570位點C等位基因降低了結(jié)核易感性(OR=0.632，95%CI=0.493～0.868)，進(jìn)一步表明在河南人群中該位點的野生基因型C/C和等位基因C是結(jié)核病發(fā)病的保護(hù)因素。而VDR基因rs731236位點基因型C/C和隱性模型基因型(T/C+T/T)分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.001，P=0.038) ，基因型C/C是河南省結(jié)核病發(fā)病的危險因素，OR值及95%CI為2.001(1.838～2.191)。

表3 VDR基因位點Hardy-Weinberg平衡檢驗

表4 VDR基因型和結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)分析

表5 VDR基因遺傳學(xué)模型和結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)分析

2.2.4 VDR基因SNP 位點單倍體型與結(jié)核病易感性的關(guān)系 對VDR基因的2個SNP位點進(jìn)行單倍體頻率分析，2個SNP位點共產(chǎn)生4種單倍體型，其頻率分布如表6所示。單倍體型CT在病例組中的分布小于對照組，為結(jié)核病發(fā)病的保護(hù)因素。而單倍體型TT和TC在病例組中的分布高于對照組，為結(jié)核病發(fā)病的危險因素。

表6 VDR 基因SNP 位點的單倍體型頻率分布

2.3基因-環(huán)境交互作用分析將維生素D受體基因2個多態(tài)性位點以及和結(jié)核病發(fā)病相關(guān)的吸煙、飲酒、卡介苗接種、結(jié)核病人密切接觸史、睡眠時間、粉塵接觸等環(huán)境資料導(dǎo)入MDR軟件，經(jīng)擬合后獲得了1-4階不同交互情況下的最優(yōu)模型。由表7可知所給模型差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)，4 階模型的檢驗樣本準(zhǔn)確度和交叉檢驗一致性高其他模型，因此選擇4 階模型為最優(yōu)模型，該最優(yōu)模型包含了吸煙、VDR基因rs2222570位點、rs731236位點和結(jié)核病人密切接觸史4個因素。

表7 1-4 階基因-環(huán)境交互作用模型分析結(jié)果

X2：吸煙，X5：rs2222570位點，X7：結(jié)核病人密切接觸史，X8：rs731236位點。

3 討論

在羅伯特·科赫發(fā)現(xiàn)結(jié)核病病因前，醫(yī)生就建議患者服用魚肝油或者曬太陽獲取維生素D治療結(jié)核病[8]。許多研究[9-10]表明維生素D的缺失將增加結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險。VDR基因遺傳因子的改變將引起基因激活能力的缺陷，或者改變了VDR受體的蛋白結(jié)構(gòu)，從而影響二羥維生素D的細(xì)胞學(xué)功能。有研究[11]表明，在不同人群中VDR基因TaqⅠ和FokⅠ位點的多態(tài)性和結(jié)核病易感性相關(guān) 。目前該位點多態(tài)性與結(jié)核病關(guān)系的結(jié)果因研究對象不同而存在分歧。

有研究[8]表明FokⅠ位點FF通過調(diào)節(jié)維生素D的免疫協(xié)調(diào)機(jī)制增加了VDR受體的表達(dá)。但Liu等[12]進(jìn)行病例對照研究表明，結(jié)核病人與健康對照相比存在更高的ff基因頻率。 而Bornman等[13]認(rèn)為VDR受體FokⅠ位點 RFLP 與結(jié)核的發(fā)病沒有相關(guān)性。作者的研究結(jié)果表明VDR基因rs2222570位點多態(tài)性與結(jié)核發(fā)病存在相關(guān)性，該位點顯性基因C相對于隱性基因T是結(jié)核病的保護(hù)因素，OR值為0.632，因此隱性基因T作為結(jié)核病發(fā)病危險因素，使雜合型C/T和突變型T/T相對野生型C/C增加了結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險，OR值分別為1.933和2.241。并且遺傳學(xué)模型進(jìn)一步表明該位點野生型是結(jié)核病發(fā)病的保護(hù)因素，其顯性模型中C/C相對于其他2種基因型降低了結(jié)核病發(fā)病的易感性，OR值為0.501。因此結(jié)果提示VDR基因rs2222570位點多態(tài)性和結(jié)核病的發(fā)病相關(guān)，其野生型降低了結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險。

Bellamy[14]研究表明VDR基因TaqⅠ位點tt基因型與TT和Tt相比降低了結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(OR=0.53，95%CI：0.31～0.88)；反之，在印度結(jié)核病人的研究中發(fā)現(xiàn)TaqⅠ位點tt基因型增加了女性患者的發(fā)病風(fēng)險[15]。近年來在巴拉圭的研究[16]表明TaqⅠ位點t等位基因保護(hù)了活動性肺結(jié)核的發(fā)生，而F位點降低了結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險；VDR基因的多態(tài)性不僅影響了宿主對結(jié)核菌易感性，而且影響宿主對結(jié)核病預(yù)后；VDR的TT基因型與Tt相比，也明顯縮短了結(jié)核菌痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)的時間。該研究結(jié)果表明雖然VDR基因rs731236位點基因型與結(jié)核病發(fā)病無關(guān)，但將其轉(zhuǎn)化為遺傳性模型后VDR基因rs731236位點基因型C/C和隱性模型基因型(T/C+T/T)分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，基因型C/C是河南省結(jié)核病發(fā)病的危險因素，OR值為2.001。

VDR基因的單倍體型，由于其不僅涵蓋了調(diào)節(jié)基因表達(dá)mRNA啟動子區(qū)和3’非翻譯區(qū)，還涵蓋了蛋白編碼區(qū)域，因此更能表明反映蛋白功能及其與結(jié)核發(fā)病的相關(guān)性[17-19]。該研究中雖然rs731236位點的3種基因型在病例組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但和rs2222570位點組合后，單倍體型CT在病例組中的分布小于對照組，為結(jié)核病發(fā)病的保護(hù)因素。而單倍體型TT和TC在病例組中的分布高于對照組，為結(jié)核病發(fā)病的危險因素。

作者對VDR基因rs2222570位點、rs731236位點和傳統(tǒng)因素之間的交互作用進(jìn)行分析，由于logistic 回歸對交互作用的分析存在自身局限性，因此，該研究采用多因子降維法檢測交互作用最優(yōu)模型，能夠更全面的評價VDR基因?qū)鹘y(tǒng)環(huán)境因素交互作用。MDR結(jié)果顯示的最優(yōu)模型包含了吸煙、VDR基因rs2222570位點、rs731236位點和結(jié)核病人密切接觸史4個因素。該結(jié)果與蘇倩等[20]對重慶地區(qū)人群研究顯示的FokⅠ-ff基因型、吸煙及結(jié)核病患者接觸史在結(jié)核病發(fā)生中存在交互作用相一致。

總之，該研究探討VDR基因多態(tài)性與傳統(tǒng)因素交互作用對河南省結(jié)核易感性影響，表明VDR 基因rs2222570位點基因型C/C是結(jié)核病發(fā)病的保護(hù)因素，rs731236位點基因型C/C是結(jié)核病發(fā)病的危險因素，并且多因子降維分析表明二者和吸煙及結(jié)核病患者密切接觸有協(xié)同作用。但該研究僅僅對VDR基因2個位點及傳統(tǒng)因素交互作用對結(jié)核易感性的影響進(jìn)行分析，今后還應(yīng)納入VDR基因的其他多態(tài)性位點進(jìn)行分析，并對多個位點連鎖不平衡進(jìn)行分析，以及對VDR基因多態(tài)性與結(jié)核病轉(zhuǎn)歸關(guān)系進(jìn)行研究。

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(2016-11-07收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Association of polymorphisms of rs2222570 and rs731236 in vitamin D receptor gene with tuberculosis susceptibility in Henan Province

SHIJie,ZHUYankun,ZHENGDanwei,MAXiaoguang,WANGShaohua,LIHui,XINGJin,WUCaixia

HenanProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention，Zhengzhou450016

tuberculosis；vitamin D receptor gene；single nucleotide polymorphisms；multifactor dimensionality reduction

Aim: To evaluate whether the vitamin D receptor(VDR) gene polymorphism or its haplotypes might be associated with tuberculosis susceptibility in Henan Han population. Methods: A total of 260 patients with tuberculosis were recruited, and 260 healthy control matched by sex and age were chosen. Genetic polymorphisms of rs2222570 and rs731236 in VDR gene were analyzed using PCR-SSCP. The data were analyzed by SPSS 19.0. The comparison of haplotypes were carried out by SHEsis online．The MDR 3.0.2 software was applied to analyze gene-environment interaction on the risk of tuberculosis susceptibility. Results: The variant genotypes of rs2222570 in VDR gene were significantly associ ated with the risk of tuberculosis, and the risk of individuals carrying wildtype genotype C/C decreased by 50%(adjustedOR=0.501，95%CI：0.343-0.709). The frequency of allele C in rs2222570 locus was significantly higher in control group compared with the tuberculosis group(adjustedOR=0.632, 95%CI:0.493-0.868). Whereas the mutant genotype C/C of VDR gene rs731236 polymorphism increased the risk of tuberculosis(adjustedOR=2.001, 95%CI:1.838-2.191)．Haplotype analysis showed significant differences in the frequency of haplotype CT，TT，and TC between the two groups[CT:OR(95%CI)=0.673(0.521-0.847),P<0.001; TT:OR(95%CI)=1.332(1.043-1.711),P=0.032;TC:OR(95%CI)=6.561(2.366-18.143),P<0.001]. The interaction of the four factor model, rs2222570，rs731236 of VDR genotypes polymorphisms，smoking and the history of exposure to tuberculosis, might increase the risk of tuberculosis [OR(95%CI)=7.619(2.201-26.354),P<0.001]. Conclusion: The polymorphism of rs2222570 and rs731236 in VDR gene are associated with the risk of tuberculosis, and there may be significant interaction between the rs2222570，rs731236 of VDR genotypes polymorphisms，smoking and history of exposure to tuberculosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.009

R183.3；R521

#通信作者，女，1966年6月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：結(jié)核病防控，E-mail：hncdcxj@163.com

*“十二·五”科技重大專項課題 2014ZX10003002；河南省衛(wèi)生計生委普通科技攻關(guān)項目 201702277