野菊花保肝膠囊抗乙肝病毒及抗酒精性肝損傷的作用*

王振基，孟小倩，劉文亞，閆京花，許佳慧，徐麗華，畢躍峰

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

野菊花保肝膠囊抗乙肝病毒及抗酒精性肝損傷的作用*

王振基，孟小倩，劉文亞，閆京花，許佳慧，徐麗華，畢躍峰#

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

野菊花保肝膠囊；乙肝病毒；酒精性肝損傷；小鼠

目的：研究野菊花保肝膠囊(CBC)體外抗乙肝病毒及體內(nèi)抗酒精性肝損傷的作用并初步探討其作用機制。方法HepG2.2.15細胞分為9組，分別給予0.000、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg/L的CBC處理72 h，采用CCK-8實驗檢測細胞增殖；HepG2.2.15細胞分為6組，分別用0.000、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/L CBC和100 mg/L拉米夫定處理，采用ELISA檢測各組細胞第6天、第9天上清液中HBsAg、HBeAg的含量。將60只昆明小鼠隨機分成正常對照組，模型組，聯(lián)苯雙脂滴丸組(BP陽性對照組，150 mg/kg)，CBC高、中、低劑量組(280、140、70 mg/kg)，每組10只，除正常對照組外，其余5組采用體積分數(shù)53%乙醇灌胃的方式建立小鼠急性酒精性肝損傷模型并給予相應(yīng)處理，10 d后測定各組小鼠血清ALT、AST水平，以及肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平，并觀察各組小鼠肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果各給藥組HepG2.2.15細胞第6、9天上清液中HBsAg、HBeAg的含量均降低(P<0.05)；CBC對HepG2.2.15的半數(shù)細胞毒濃度和最大無毒濃度分別為5.014、0.231 mg/L。CBC能顯著降低酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性，升高肝組織SOD活性，降低MDA含量；CBC各給藥組肝損傷癥狀減輕，尤其是CBC中、高劑量組(P<0.05)。結(jié)論CBC具有體外抗乙肝病毒作用，并對酒精性肝損傷有保護作用。

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的、以肝損傷為主的傳染性疾病，是肝損傷最常見的原因[1]。目前臨床主要的抗HBV藥物有核苷類似物和干擾素，前者易產(chǎn)生耐藥，后者易引起肝損傷等不良反應(yīng)。我國傳統(tǒng)中藥以其多途徑、多層次、多靶點、價格低廉、不良反應(yīng)少等特點，逐漸成為抗HBV和肝保護的研究熱點[2]。野菊花(FlosChrysanthemiindici)來源于菊科植物野菊的干燥頭狀花序，性微寒，味苦辛，歸心肝二經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、消腫解毒、抗感染、抗病毒的功效[3]。作者所在的課題組經(jīng)過前期研究，從野菊花中獲得一個具有抗乙肝病毒、肝保護作用的活性部位(主要成分包括黃酮類和倍半萜類)，并研制成野菊花保肝膠囊(CBC)[4-5]。該研究旨在檢測CBC對HBV的抑制作用，及其對酒精性肝損傷小鼠的肝保護作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1材料HepG2.2.15細胞株由鄭州大學(xué)藥學(xué)院王亞峰老師惠贈。SPF級昆明小鼠，體重(20±2) g，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供。野菊花來自河南省信陽市大別山地區(qū)，標(biāo)本保存于鄭州大學(xué)藥物研究院標(biāo)本室，標(biāo)本號201605。CBC由作者所在實驗室自行制備。拉米夫定購于GSK公司，聯(lián)苯雙脂滴丸(BP)購于萬邦德制藥集團股份有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購于Solarbio公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，G418購于Thermo公司，HBsAg和HBeAg檢測試劑盒購于上?？迫A生物工程股份有限公司，ALT、AST、MDA、SOD ELISA檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器五廠)，細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀(BioTek公司)，臺式高速大容量冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)，內(nèi)切式組織勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2藥物配制CBC各劑量組及拉米夫定溶液用雙蒸水配制，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌；BP溶液用5 g/L的CMC-Na配制，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3CBC對HepG2.2.15細胞增殖的影響細胞常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度為6×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入含不同質(zhì)量濃度(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg/L)CBC的培養(yǎng)基，每孔100 μL，同時設(shè)空白對照組，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)72 h。于實驗結(jié)束前4 h，每孔加入5 μL CCK-8試劑孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測其吸光度。計算半數(shù)細胞毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。

1.4CBC對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg的影響細胞常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度為6×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入含不同質(zhì)量濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/L)CBC的培養(yǎng)基，每孔100 μL，同時設(shè)拉米夫定組(陽性對照組)(100 mg/L)和空白對照組，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)9 d，分別收集第6天和第9天的上清液，按照ELISA檢測試劑盒的要求檢測上清液中HBsAg、HBeAg的含量。

1.5CBC對酒精性肝損傷小鼠的肝保護作用取7周齡SPF級昆明小鼠60只，隨機分成正常對照組，模型組，BP陽性對照組(150 mg/kg)，CBC高、中、低劑量組(280、140、70 mg/kg)，每組10只，雌雄各半。采用灌胃方式按0.2 mL/10 g體重給藥，正常對照組和模型組給予等體積的雙蒸水，1次/d，共10 d。末次給藥禁食不禁水3 h后，模型組和給藥組給予體積分數(shù)53%的乙醇(12 mL/kg)，正常對照組給予等體積的生理鹽水，12 h后稱重，摘眼球取血，分離血清用于檢測ALT和AST；立即脫頸椎處死小鼠取出肝臟，制備10%肝組織勻漿，檢測肝勻漿中MDA和SOD的含量；進行肝組織病理學(xué)檢查，病理損傷分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[6]。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較各組細胞間的吸光度值，上清液中HBsAg和HBeAg含量的差異，以及各組小鼠血清ALT、AST活性和肝組織MDA、SOD含量的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CBC對HepG2.2.15細胞的毒性作用0.000(空白對照)、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg/L的CBC處理HepG2.2.15細胞72 h后，吸光度值分別為(1.131±0.054)、(1.096±0.010)、(0.937±0.049)、(0.671±0.064)、(0.567±0.121)、(0.323±0.163)、(0.199±0.013)、(0.188±0.015)和(0.180±0.008)，隨著濃度的增加，吸光度值減小(F=15.052，P=0.002)；TC50和TC0分別為5.014、0.231 mg/L。

2.2CBC對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg的影響CBC對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg的分泌均有抑制作用。見表1。

表1 CBC對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg的影響(n=4)

*：與空白對照組比較，P<0.05。

2.3CBC對酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常對照組升高，而CBC各劑量組ALT和AST活性較模型組不同程度地降低。見表2。

2.4CBC對酒精性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD含量的影響模型組小鼠肝組織MDA含量較正常對照組升高，SOD含量降低；CBC高劑量組MDA含量較模型組降低， CBC中、高劑量組SOD活性升高。見表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST及肝組織MDA和SOD含量比較(n=10)

#：與正常對照組比較，P<0.05；*：與模型組比較，P<0.05。

2.5各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，肝竇清晰。模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細胞索排列紊亂，較多肝細胞發(fā)生氣球樣變性，多數(shù)細胞內(nèi)可見大小不等的脂滴空泡，多分布在中央靜脈周圍，匯管區(qū)出現(xiàn)較多炎性細胞浸潤，可見點狀壞死灶。CBC各給藥組肝細胞腫脹程度及氣球樣變減輕，炎細胞浸潤減少，點狀壞死減少，以中、高劑量組最為明顯。見表3和圖1。由表3可知，CBC各劑量組小鼠肝組織病理改變均有不同程度的改善。

A：正常對照組；B：模型組；C：BP陽性對照組；D：CBC高劑量組；E：CBC中劑量組；F：CBC低劑量組。 圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×200)

3 討論

HepG2.2.15細胞是由帶有HBV-DNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2獲得[7]，能分泌HBsAg和HBeAg，可間接反映乙肝病毒的復(fù)制情況[8]，是目前最常用的抗乙肝病毒藥物篩選模型。該研究結(jié)果顯示CBC對HBsAg和HBeAg具有一定的抑制作用，且對HBeAg的抑制作用更強，推測可能為藥物作用的靶點不同所致，課題組前期研究[3]表明CBC抗HBV的主要成分為倍半萜類。

近年來酒精性肝病的發(fā)病率明顯上升。研究[9]認為乙醇可通過多種途徑造成肝損傷，目前公認的為氧自由基參與的脂質(zhì)過氧化途徑，所以清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化已成為抗酒精性肝損傷的研究熱點。

正常情況下，ALT和AST主要存在于細胞液中。發(fā)生酒精性肝損傷時，肝細胞膜受損，釋放出ALT、AST，血清中ALT和AST含量急劇升高，因此血清ALT、AST的活性檢測是酒精性肝損傷的一個重要指標(biāo)[10]。自由基本是人體生化反應(yīng)中正常的中間產(chǎn)物，當(dāng)發(fā)生酒精性肝損傷時，自由基產(chǎn)生過多，動態(tài)平衡被打破。正常情況下細胞內(nèi)存在的SOD抗氧化酶能抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，以防御自由基對肝臟的損害。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量的多少可間接反映肝細胞過氧化受損程度[11]。另外，肝組織病理學(xué)檢查能客觀反映肝臟受損程度。該研究結(jié)果顯示模型組發(fā)生不同程度的肝細胞腫脹變性、炎癥，甚至出現(xiàn)壞死情況，說明建模成功；而CBC各給藥組小鼠血清ALT、AST活性不同程度地降低，SOD活性升高，MDA含量降低，并且肝細胞水腫、炎癥、壞死等病理學(xué)變化有不同程度的改善。有研究[12]表明CBC肝保護作用的主要成分為黃酮類。

綜上所述，CBC既有抗HBV的作用又對酒精性肝損傷有保護作用，其可能是通過提高機體抗氧化能力，加速清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來達到肝保護的作用。CBC有望在保肝藥品領(lǐng)域得到進一步的開發(fā)和利用。

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(2017-01-05收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of Yejuhuabaogan capsule on HBV and acute alcoholic liver injury in mice

WANGZhenji,MENGXiaoqian,LIUWenya,YANJinghua,XUJiahui，XULihua，BIYuefeng

SchoolofPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Yejuhuabaogan capsule；HBV；alcoholic liver injury；mouse

Aim: To investigate the effects of Yejuhuabaogan capsule(CBC) on HBVinvitroand acute alcoholic liver injuryinvivo. Methods: HepG2.2.15 cells were divided into 9 groups，and were treated with 0.000,0.625,1.250,2.500,5.000,10.000,20.000,40.000, and 80.000 mg/L CBC for 72 hours. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation. HepG2.2.15 cells were assigned into 6 groups and were treated with 0.000,0.125,0.250,0.500,1.000 mg/L CBC and 100 mg/L lamivudine,and ELISA was used to detect the secretion of HBsAg and HBeAg by HepG2.2.15 cells on the 6th and 9th day after the treatment. Kunming mice were allocated into 6 groups: control group, model group, BP positive control group(150 mg/kg), CBC groups with high, middle and low dosages(280, 140 and 70 mg/kg). The liver injury model was prepared with the volume fraction of 53% ethanol by gavage. The levels of serum ALT and AST were determined, and liver homogenate was prepared to detect SOD and MDA activity after 10 days. The liver was studied by pathological examination. Results: CBC reduced the contents of HBsAg and HBeAg secreted by HepG2.2.15 cells on the 6th and 9th day(P<0.05).TC50andTC0of CBC were 5.014 and 0.231 mg/L,respectively. CBC reduced the serum levels of ALT and AST, and increased SOD activity, depressed MDA content(P<0.05). CBC could alleviate liver injury,especially at the high and middle doses(P<0.05).Conclusion: CBC has anti-HBV effects as well as the protective effects on the alcoholic liver injury.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.008

R575

#通信作者，女，1969年7月生，博士，教授，研究方向：天然藥物化學(xué)及天然健康產(chǎn)品研究開發(fā)，E-mail:zzubyf@126.com

*國家自然科學(xué)基金面上項目 30973872；河南省科技攻關(guān)計劃項目 162102310128