腸道病毒71型熒光定量PCR方法的比較與評(píng)價(jià)*

趙伊珂，衛(wèi)海燕，黃學(xué)勇，程寧寧，潘靜靜，王若琳，許汴利，郭萬(wàn)申#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016

腸道病毒71型熒光定量PCR方法的比較與評(píng)價(jià)*

趙伊珂1)，衛(wèi)海燕2)，黃學(xué)勇2)，程寧寧1)，潘靜靜2)，王若琳2)，許汴利2)，郭萬(wàn)申1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 鄭州 450016

腸道病毒71型；熒光定量PCR；TaqMan 探針

目的：定量檢測(cè)腸道病毒71型(EV71)臨床標(biāo)本中病毒拷貝數(shù),評(píng)價(jià)3種商業(yè)化TaqMan探針熒光定量PCR方法。方法將VP1全序連接到克隆質(zhì)粒pMAL-c2X上，純化的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。選取河南開封手足口病監(jiān)測(cè)試點(diǎn)的105份手足口病患兒糞便標(biāo)本，分別應(yīng)用bioPerfectus Technologies(方法A)、KINGHAWK(方法B)和Beijing ABT(方法C)公司的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較EV71陽(yáng)性檢出率和定量分析結(jié)果的差異，分析3種方法的一致性。結(jié)果成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y=-3.35X+47.49；分別用方法A、B、C對(duì)105份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，EV71陽(yáng)性檢出率分別為41.90%(44/105)、42.86%(45/105)和41.90%(44/105)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.987)；CT值分別為(24.34±3.92)、(25.08±3.94)和(14.17±3.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，方法C測(cè)得的CT值小于方法A和B(P<0.05)；3種方法最低檢測(cè)限值分別為102、10和102拷貝，靈敏度分別為93.62%、95.74%和93.62%，特異度分別為100.00%、75.00%和100.00%；一致性分析結(jié)果顯示，3種方法一致性較差。結(jié)論商業(yè)化的EV71熒光定量PCR試劑盒適用于定性檢測(cè)臨床標(biāo)本，定量檢測(cè)EV71方法需要進(jìn)一步研究。

自20世紀(jì)70年代初首次報(bào)道手足口病與腸道病毒71型(EV71)感染有關(guān)以來(lái)，全球多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了EV71相關(guān)手足口病的大規(guī)模爆發(fā)和流行情況[1-3]。報(bào)道[4]顯示EV71感染是重癥手足口病患者發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，因此，及時(shí)、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)EV71病毒對(duì)于治療手足口病和保護(hù)高危人群至關(guān)重要。雖然熒光定量PCR方法檢測(cè)EV71的分子診斷技術(shù)已經(jīng)得到大力發(fā)展[5]，但目前實(shí)驗(yàn)室使用的診斷方法良莠不齊。該研究采用3種商業(yè)化TaqMan探針熒光定量PCR方法，即bioPerfectus Technologies(方法A)、KINGHAWK(方法B)和Beijing ABT(方法C)3個(gè)公司的EV71熒光定量PCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本和毒株，通過(guò)定性和定量比較，系統(tǒng)評(píng)價(jià)3種商業(yè)化熒光定量PCR試劑盒，為研究人員選擇定量方法提供參考意見。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本、毒株、細(xì)胞及載體2016年于河南開封監(jiān)測(cè)試點(diǎn)收集的105份手足口病患兒糞便標(biāo)本，年齡均小于3歲；毒株：EV71，柯薩奇病毒A組(CA)4、5、6、10、16，柯薩奇病毒B組(CB)2、5，?？刹《?(ECHO6)，河南省疾病預(yù)防控制中心分子實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞：RDa細(xì)胞、Hep-2細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Tiangen公司)；載體：pMAL-c2X(英國(guó)NEB公司)。

1.2儀器與試劑ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國(guó)生命技術(shù)公司)、PCR儀(德國(guó)Jena公司)、全自動(dòng)核酸提取儀(蘇州天隆生物科技有限公司)、微量核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf公司)、凝膠圖像分析儀(美國(guó)Syngene公司)等。病毒RNA/DNA提取試劑盒(蘇州天隆生物科技有限公司)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Foregene公司)、一步法RT-PCR試劑盒(Qiagen公司)、質(zhì)粒純化試劑盒4.0(TaKaRa公司)等。

1.3VP1全序克隆對(duì)河南省疾病預(yù)防控制中心分子實(shí)驗(yàn)室保存的EV71毒株進(jìn)行VP1全序(891 bp)擴(kuò)增。引物序列如下。P3：5’-CGGGATCCAT GGGAGATAGGGTGGCAG-3’；P4：5’-CGCCTGCAGT TAAAGAGTGGTGATCGC-3’。P3含有BamH酶切位點(diǎn)，P4含有Pst1酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s， 72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后與pMAL-c2X載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。PCR初步鑒定后，重組質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAssist 2.2進(jìn)行分析。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限值用質(zhì)粒純化試劑盒提取克隆質(zhì)粒后，用微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒濃度和純度(測(cè)定3次，取平均值)，10倍倍比稀釋，測(cè)定3種熒光定量PCR方法檢測(cè)范圍，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次實(shí)驗(yàn)平行做2孔。

1.5臨床標(biāo)本前處理和檢測(cè)離心管中加1 g玻璃珠、10 mL PBS、1 mL氯仿、約2 g標(biāo)本，振蕩20 min后，室溫1 500×g離心10 min，取上清液待用。提取病毒核酸：按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書，在配套的全自動(dòng)核酸提取儀上操作，提純產(chǎn)物-80 ℃保存待用。定量PCR：分別用3種方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，觀察結(jié)果并記錄CT值，反應(yīng)條件嚴(yán)格參照說(shuō)明書，在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和結(jié)果分析。測(cè)序：105份標(biāo)本染毒RD細(xì)胞，盲傳2代后，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。CA4、CA5、CA6、CA10、CA16、CB2、CB5、ECHO6毒株用RD和Hep-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)產(chǎn)物PCR鑒定后，分別用3種熒光定量方法進(jìn)行檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)平行做2孔，進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SAS 9.1和MedCalc 13.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組間EV71陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)；不同組間EV71 CT值的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；一致性分析采用Altman-Bland法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1VP1全序克隆陽(yáng)性克隆菌落(白斑)增菌培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，鑒定克隆結(jié)果。重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳的條帶位置與EV71毒株擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶相同，為945 bp，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

1～3：分別為DNA Marker DL1000、重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物、毒株擴(kuò)增產(chǎn)物。 圖1 重組質(zhì)粒電泳鑒定結(jié)果

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)到的質(zhì)粒濃度為53.0 g/L，A(260 nm)/A(280 nm)等于1.84，10倍倍比稀釋后在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀上做標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.35X+47.49,截距為3.35，決定系數(shù)R2=0.999，PCR擴(kuò)增效率為98.83%，曲線具有較好的相關(guān)性且有較寬的線性范圍。

2.3臨床標(biāo)本和毒株檢測(cè)結(jié)果用A、B、C 3種熒光定量方法分別檢測(cè)105份臨床標(biāo)本，EV71陽(yáng)性檢出率分別為41.90%(44/105)、42.86%(45/105)和41.90%(44/105)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.026,P=0.987)。

克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋檢測(cè)3種方法的檢測(cè)低限，方法B最靈敏。以測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)(105份臨床標(biāo)本處理后，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示47例為EV71)計(jì)算靈敏度，方法B最高；7例非EV71毒株用3種方法復(fù)孔檢測(cè)，得到特異度，方法B最低。見表1。

用3種方法檢測(cè)的105份臨床標(biāo)本中，均為陽(yáng)性的標(biāo)本有44例。方法A、B和C檢測(cè)44份標(biāo)本的CT值分別為(24.34±3.92)、(25.08±3.94)和(14.17±3.19)，3組CT值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=119.120，P<0.001)；且方法A和方法B檢測(cè)的CT值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，方法A、B與方法C檢測(cè)的CT值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

以 A方法為參考，A方法與B方法相比，2.27%(1/44)的點(diǎn)在95%一致性界限以外，差值的均值為-0.7；方法A與方法C相比，4.54%(2/44)的點(diǎn)在95%一致性界限以外，差值的均值為10.2。在一致性界限范圍內(nèi)，方法A與方法B和C相比，差值的絕對(duì)值最大為3.80和13.74。方法A和B有較好的一致性，方法A和C一致性較差。

表1 3種方法定量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

手足口病實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]雖然是病毒分離，但由于其敏感性差、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，核酸檢測(cè)逐漸取代病毒分離，成為手足口病病原學(xué)檢測(cè)新的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。該實(shí)驗(yàn)以高通量測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，對(duì)105份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3種方法真陽(yáng)性率都超過(guò)90%，這與文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道一致，表明3種方法進(jìn)行定性檢測(cè)時(shí)靈敏度都非常高。手足口病病毒定量方法包括組織半數(shù)感染量測(cè)定法[10]、空斑形成單位法[11]和熒光定量PCR法，前兩種因操作復(fù)雜、結(jié)果不夠準(zhǔn)確逐漸被取代，也有研究[9,12]對(duì)熒光定量PCR方法進(jìn)行比較，但未做定量比較。該實(shí)驗(yàn)用穩(wěn)定表達(dá)的克隆質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)3種方法進(jìn)行定量比較，均為陽(yáng)性的44份標(biāo)本CT值均值分別為(24.34±3.92)、(25.08±3.94)和(14.17±3.19)，3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且方法C檢測(cè)的CT值小于方法A和B。分析其原因，可能是由于方法C加樣量(6 μL)大于方法A和B(均為5 μL)，模板量影響了熒光信號(hào)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值;觀察擴(kuò)增曲線發(fā)現(xiàn)，S曲線的平臺(tái)期出現(xiàn)情況分別為方法A>方法B>方法C,分析其原因，可能是由于方法A循環(huán)數(shù)大于方法B循環(huán)數(shù)和方法C循環(huán)數(shù)，擴(kuò)增條件不同擴(kuò)增曲線的形狀不一致；用3種方法檢測(cè)7份非EV71毒株時(shí)，方法B檢測(cè)CA4和CB2陽(yáng)性，推測(cè)方法B的擴(kuò)增過(guò)程中可能產(chǎn)生了非特異性的擴(kuò)增，該方法需要針對(duì)特異性進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

綜上所述，商業(yè)化的熒光定量PCR試劑盒可用于定性檢測(cè)EV71感染的手足口病臨床標(biāo)本，而對(duì)于EV71病毒的定量檢測(cè)方法，則需要進(jìn)一步改進(jìn)和開發(fā)。

[1] 宋遠(yuǎn)斌,陳志江,曾其毅,等.腸道病毒71型感染致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2012,27(22):1765

[2] 許紅梅,賴方方.腸道病毒71型對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能的影響及疫苗研究進(jìn)展[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2012,27(22):1701

[3] 楊鎰?dòng)?重癥腸道病毒71感染與多臟器功能損害[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2012,27(6):397

[4] 馮慧芬,趙秋民,段廣才,等.重癥手足口病主要危險(xiǎn)因素的Meta分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,41(5):974

[5] 嚴(yán)菊英，盧亦愚，徐昌平.腸道病毒EV71熒光定量RT-PCR法快速檢測(cè)[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2009,26(7):843

[6] 手足口病預(yù)防控制指南：2008年版[J].中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2009,16(S1):6

[7] 秦楠,栗東芳,楊瑞馥.高通量測(cè)序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(4):445

[8] TAN EL,YONG LL,QUAK SH,et al.Rapid detection of enterovirus 71 by real-time TaqMan RT-PCR[J].J Clin Virol,2008,42(2):203

[9] 李華,楊婷,姜廣菊,等.EV71及CA16不同檢測(cè)方法敏感度及特異性比較[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2015,44(1):58

[10]HU X,ZHANG Y,ZHOU X,et al.Simultaneously typing nine serotypes of enteroviruses associated with hand, foot, and mouth disease by a GeXP analyzer-based multiplex reverse transcription-PCR assay[J].J Clin Microbiol,2012,50(2):288

[11]LIOU AT,WU SY,LIAO CC,et al.A new animal model containing human SCARB2 and lacking stat-1 is highly susceptible to EV71[J].Sci Rep,2016,6:31151

[12]衛(wèi)海燕,黃學(xué)勇,許玉玲,等.EV71病毒核酸快速檢測(cè)方法的比較[J].病毒學(xué)報(bào),2012，28(6):670

(2016-12-28收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Comparison and evaluation of different fluorescent quantitative PCR methods for enterovirus 71

ZHAOYike1),WEIHaiyan2),HUANGXueyong2),CHENGNingning1),PANJingjing2),WANGRuolin2),XUBianli2),GUOWanshen1)

1)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016

enterovirus 71; fluorescent quantitative PCR; TaqMan probe

Aim: To determine copy number of the enterovirus 71(EV71) in clinical specimens by quantitative analysis, and compare 3 commercial TaqMan fluorescence quantitative PCR methods systematically and comprehensively.Methods: VP1 sequence of EV71 was inserted into cloning vector pMAL-c2X. The purified plasmid was used as the standard sample for quantitative detection of 105 clinical specimens collected from the special monitoring system of HFMD in Henan Province. Positive rate and CT value among the 3 commercial TaqMan fluorescence quantitative PCR methods from bioPerfectus Technologies(method A), KINGHAWK(method B), and Beijing ABT(method C) were compared, and consistency was analyzed.Results: The recombinant plasmid pMAL-c2X was constructed successfully. Standard curve equation wasY=-3.35X+47.49.For 105 specimens, positive rate of EV71 measured by method A, B, and C was 41.90%(44/105), 42.86%(45/105), and 41.90%(44/105), respectively, and the difference was not significant(P=0.987). Among positive specimens, copy number by method C(14.17±3.19) was less than method A(24.34±3.92) and B(25.08±3.94), and the difference was significant(P<0.05). For 3 methods, the limit of detection was 102, 10, and 102copies; sensitivity was 93.62%, 95.74%, and 93.62%; specificity was 100.00%, 75.00%, and 100.00%. The result of 3 methods showed poor consistency.Conclusion: EV71 fluorescence quantitative PCR kit for commercialization is suitable for the qualitative detection of clinical samples; however, it needs further study for the quantitative detection of EV71.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.006

R373.2

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81573204；河南省杰出青年資助項(xiàng)目 164100510008；河南省科技廳項(xiàng)目 122102310268

#通信作者,男，1966年4月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向：流行病學(xué)，E-mail:cdcgws@163.com