M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與食管鱗癌發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

張 冰，孫淼淼，韋 娜，賀璐璐，王正洋，張紅新，陳奎生#

1)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科；河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450003

M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與食管鱗癌發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

張 冰1)，孫淼淼1)，韋 娜2)，賀璐璐3)，王正洋2)，張紅新2)，陳奎生2)#

1)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450003 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科；河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)中美(河南)荷美爾腫瘤研究院 鄭州 450003

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞；CD206；IL-8；MCP-1；浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移

目的：探討M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(M2型TAM)浸潤(rùn)與食管鱗癌發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其可能機(jī)制。方法采用免疫組化SP法分別檢測(cè)50例食管鱗癌和50例正常食管黏膜組織中CD206(M2型TAM特異性標(biāo)志物)、IL-8、MCP-1蛋白的表達(dá)；應(yīng)用原位雜交方法分別檢測(cè)上述組織中IL-8、MCP-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌組織中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量多于正常食管黏膜(P=0.032)；食管鱗癌間質(zhì)中IL-8、MCP-1蛋白及mRNA陽性表達(dá)率高于正常食管黏膜組織(P<0.05)；M2型TAM浸潤(rùn)數(shù)量與食管鱗癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、性別無關(guān)(P>0.05)；食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與IL-8、MCP-1蛋白和mRNA的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)(蛋白：rP=0.432、0.315；mRNA：rP=0.373、0.332，P均<0.05)。結(jié)論M2型TAM與食管鱗癌的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，其機(jī)制可能與TAM分泌的趨化因子IL-8和MCP-1有關(guān)。

食管鱗癌是消化道惡性腫瘤中最常見的組織學(xué)類型，其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的主要原因之一[1]。浸潤(rùn)到腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞又被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage，TAM)。TAM主要包括兩種類型：經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，即M1型TAM，發(fā)揮殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞的作用；替代性活化的巨噬細(xì)胞，即M2型TAM，主要促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)不同活化表型的TAM具有不同的特異性標(biāo)記物，而甘露糖受體,即CD206是M2型TAM的特異性標(biāo)志物之一。研究[4]表明M2型TAM與腫瘤發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能與其自分泌或旁分泌多種細(xì)胞因子有關(guān)，趨化因子IL-8、MCP-1、MIP-1在介導(dǎo)局部免疫的同時(shí)，其促進(jìn)腫瘤血管生成的作用也日漸為人們所重視,但有關(guān)TAM與食管鱗癌發(fā)生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。該研究探討M2型TAM浸潤(rùn)與食管鱗癌發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料50例食管鱗癌和50例正常食管黏膜組織為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年1月至2011年12月的手術(shù)切除標(biāo)本，臨床資料完整。50例中男26例，女24例；年齡38～80歲，≥60歲者30例，<60歲者20例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期28例；浸潤(rùn)到黏膜下層或淺肌層者10例，浸潤(rùn)到深肌層者12例，浸潤(rùn)至全層或外膜者28例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。CD206、IL-8和MCP-1一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒、SP免疫組化通用試劑盒、SA-AP顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，胃蛋白酶、預(yù)雜交液、原位雜交封閉液、BCIP/NBT購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2食管鱗癌和正常食管黏膜組織中CD206、IL-8和MCP-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)各組織標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定、常規(guī)石蠟包埋、脫蠟水化、抗原修復(fù)，行SP法染色，滴加用PBS稀釋的一抗(CD206、IL-8和MCP-1均按1100稀釋)，4 ℃濕盒內(nèi)過夜。次日，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定：①CD206陽性表達(dá)主要位于腫瘤間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，M2型TAM計(jì)數(shù)方法參考文獻(xiàn)[5-6]。②IL-8、MCP-1的陽性表達(dá)均位于腫瘤間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。

1.3食管鱗癌和正常食管黏膜組織中IL-8和MCP-1mRNA表達(dá)的檢測(cè)各組織標(biāo)本經(jīng)含1/1 000 DEPC的體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，置于60 ℃烤箱中烘烤3 h，室溫下冷卻，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ浑s交中IL-8探針序列：5’-TCCGTAATTCAACACAGCACT-3’;MCP-1 探針序列：5’-TGCAGATTCTTGGGTTGTGGA-3’，由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。體積分?jǐn)?shù)3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；體積分?jǐn)?shù)3%枸櫞酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37 ℃消化20 min，暴露mRNA核酸片段；滴加雜交液，42 ℃溫浴箱中過夜；洗滌、封閉、復(fù)染、封片。以不含探針的預(yù)雜交液孵育標(biāo)本作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：IL-8、MCP-1 mRNA的陽性表達(dá)主要位于腫瘤間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)，呈紫藍(lán)色顆粒；判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，正常食管黏膜和食管鱗癌間質(zhì)中IL-8、MCP-1蛋白及mRNA表達(dá)陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，不同臨床病理特征的食管鱗癌患者M(jìn)2型TAM浸潤(rùn)數(shù)量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；食管鱗癌間質(zhì)M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與IL-8、MCP-1蛋白及mRNA表達(dá)的關(guān)系采用Pearson列聯(lián)系數(shù)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌和正常食管黏膜組織中M2型TAM的計(jì)數(shù)結(jié)果CD206是M2 型 TAM的特異性標(biāo)志物之一。免疫組化結(jié)果顯示CD206陽性表達(dá)主要位于腫瘤間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒(圖1)。單個(gè)高倍視野下，食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量(28.66±14.06)多于正常食管黏膜組織(7.46±2.15)(t=19.326，P=0.032)。

圖1 正常食管黏膜(A)和食管 鱗癌(B)間質(zhì)中CD206蛋白的陽性表達(dá)(SP，×100)

2.2正常食管黏膜和食管鱗癌間質(zhì)中IL-8、MCP-1的表達(dá)食管鱗癌間質(zhì)中IL-8、MCP-1蛋白及mRNA陽性表達(dá)率高于正常食管黏膜，結(jié)果見圖2、表1。

1：IL-8蛋白；2：MCP-1蛋白；3：IL-8 mRNA；4：MCP-1 mRNA。 圖2 正常食管黏膜(A)和食管鱗癌(B)間質(zhì)中IL-8、MCP-1蛋白和mRNA的表達(dá)(SP和BCIP/NBT，×100)

2.3食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與食管鱗癌患者人口學(xué)特征及臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

CD206標(biāo)記的M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與食管鱗癌患者的性別、年齡無關(guān)，而與食管鱗癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期密切相關(guān)，見表2。

2.4食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與IL-8、MCP-1蛋白及mRNA表達(dá)的關(guān)系食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與IL-8、MCP-1蛋白及mRNA的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)(表3～6)。

表2 食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與患者人口學(xué)特征及臨床病理特征的關(guān)系

表3 食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與IL-8蛋白表達(dá)的關(guān)系 例

rP=0.432,P<0.001。

表4 食管鱗癌間質(zhì)中M2 型 TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與MCP-1蛋白表達(dá)的關(guān)系 例

rP=0.315,P=0.019。

表5 食管鱗癌間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與IL-8 mRNA表達(dá)的關(guān)系 例

rP=0.373,P=0.004。

表6 食管鱗癌間質(zhì)中M2 型 TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與MCP-1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 例

rP=0.332,P=0.013。

3 討論

食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟、多階段,由體內(nèi)外多種因素參與并相互作用的過程。盡管在早期診斷、腫瘤篩選以及治療方面的技術(shù)不斷進(jìn)步，但目前對(duì)食管鱗癌侵襲、轉(zhuǎn)移方面的機(jī)制了解甚少，食管鱗癌患者的死亡率仍很高[8]。近來研究[9]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞不但沒有發(fā)揮抗腫瘤的作用，反而參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。研究[5]證實(shí)：惡性腫瘤組織中TAM計(jì)數(shù)越高，腫瘤的進(jìn)展越快，癌組織越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后也越差，所以TAM可作為評(píng)估惡性腫瘤預(yù)后的一個(gè)客觀指標(biāo)。

IL-8具有趨化活性，在腫瘤組織中注射IL-8可以使處于靜止期的CD4+細(xì)胞和NK細(xì)胞活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和增殖[10]。Fujimoto等[11]在對(duì)宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TAM可分泌IL-8，其水平與腫瘤中微血管的數(shù)量相關(guān)。因此,IL-8可作為一種潛在的靶向治療細(xì)胞因子，抑制其表達(dá)在腫瘤的生物學(xué)治療中將發(fā)揮重要作用。

MCP-1是細(xì)胞因子中的一員，具有多種生物學(xué)功能，它可以特異性地趨化單核細(xì)胞使其分化為巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)TAM浸潤(rùn)。有研究[12]發(fā)現(xiàn)：MCP-1在胃癌間質(zhì)中的陽性表達(dá)率高于正常組織，且其陽性表達(dá)率隨著癌組織浸潤(rùn)深度的增加而升高；MCP-1可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的聚集，胃癌間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子影響下分泌MCP-1，進(jìn)一步誘導(dǎo)更多的單核巨噬細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)到胃癌間質(zhì)組織。因此，MCP-1與TAM之間可以相互影響相互調(diào)控，共同促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。

該研究結(jié)果顯示M2型TAM與食管鱗癌的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)，且食管鱗癌組織間質(zhì)中M2型TAM的浸潤(rùn)數(shù)量與MCP-1、IL-8蛋白及mRNA的表達(dá)有關(guān)。食管鱗癌發(fā)生后，腫瘤細(xì)胞分泌趨化因子IL-8和MCP-1，二者可促進(jìn)巨噬細(xì)胞在腫瘤部位聚集。TAM一方面通過上調(diào)IL-8、MCP-1表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，另一方面，TAM本身也能分泌趨化因子IL-8和MCP-1，這樣就形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控體系，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，加速了食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。

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(2017-01-09收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Relationship of infiltration of M2 type tumor-associated macrophages with occurrence, invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma

ZHANGBing1)，SUNMiaomiao1)，WEINa2),HELulu3)，WANGZhengyang2)，ZHANGHongxin2)，CHENKuisheng2)1)DepartmentofPathology,theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003

2)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity；HenanKeyLaboratoryofTumorPathology,Zhengzhou450052 3)China-US(Henan)HormelCancerInstitute,Zhengzhou450003

tumor associated macrophage；CD206;IL-8；MCP-1；invasion and metastasis

Aim: To investigate the relationship between the infiltration of M2 type tumor associated macrophages(M2 type TAM) and the occurrence, invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) and its possible mechanism.Methods: The expressions of CD206, IL-8, MCP-1 proteins and IL-8, MCP-1 mRNA were detected using immunohistochemical method andinsituhybridization in 50 cases of the interstitial of ESCC and 50 cases of normal esophageal mucosa.Results: The number of M2 type TAM in the interstitial of ESCC was significantly higher than that in normal esophageal mucosa tissue(P=0.032); the positive expression rates of IL-8,MCP-1 protein and mRNA in the interstitial tissue of ESCC were significantly higher than those in the interstitial tissue of normal esophageal mucosa(P<0.05). The number of M2 type TAM was significantly associated with the depth of tumor invasion, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05), but not with the patients′ age or gender(P>0.05). The number of M2 type TAM in ESCC was positively correlated with the expressions of IL-8,MCP-1 protein(rP=0.432,0.315) and mRNA(rP=0.373,0.332，P<0.05).Conclusion: M2 type TAM may be related with the occurrence, invasion and metastasis of ESCC, and the mechanism may be related with chemotactic factor IL-8 and MCP-1 secreted by M2 type TAM.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.003

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 132102310086；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 142300410076；國(guó)家自然科學(xué)基金 81272370

R735.1

#通信作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：腫瘤病理，E-mail：chenksh2002@163.com